Isolement du virus de la maladie de Newcastle chez les volailles d'abattage
Les volailles soumises aux conditions reprises dans cette annexe doivent provenir de troupeaux ayant réagi négativement (aucun virus isolé) aux tests de détection du virus de la maladie de Newcastle réalisés comme suit:
1. Échantillonnage
Au moins 60 échantillons comprenant des écouvillonages cloacaux (ou fèces) doivent être prélevés dans chaque troupeau.
2. Traitement des échantillons
Les échantillons peuvent être groupés par 5 au maximum. Les écouvillonnages doivent être placés dans une quantité de milieu antibiotique suffisante pour assurer leur immersion totale. Les échantillons de fèces doivent être homogénéisés (à l'aide d'un mélangeur fermé, d'un pilon et d'un mortier et de sable stérile) dans un milieu antibiotique jusqu'à l'obtention de suspensions à 10-20 % p/v dans ce dernier. Laisser reposer les suspensions pendant 2 heures environ à la température ambiante (ou plus longtemps à 4 °C), puis les clarifier par centrifugation (par exemple, 800 à 1 000 × g pendant 10 minutes).
Des concentrations élevées d'antibiotiques sont nécessaires pour les échantillons de fèces. Un mélange typique est constitué comme suit: 10 000 unités/ml de pénicilline, 10 mg/ml de streptomycine, 0,25 mg/ml de gentamycine et 5 000 unités/ml de mycostatine dans une solution tamponnée au phosphate. Pour le contrôle des Chlamydia, l'addition de 50 mg/ml d'oxytétracycline est autorisée. Lors de la confection du milieu, il est impératif que le pH soit contrôlé après addition des antibiotiques et ajusté pour atteindre un niveau compris entre 7,0 et 7,4.
3. Isolement du virus dans les œufs embryonnés de poules
Inoculer entre 0,1 et 0,2 millilitre du surnageant clarifié dans la cavité allantoïdienne d'au moins 4 œufs embryonnés de poules, mis à incuber pendant 8 à 10 jours. Idéalement, ces œufs devraient être issus d'un troupeau exempt d'organes pathogènes spécifiques (EOPS) mais si cela n'est pas possible, il est admis d'utiliser des œufs issus d'un troupeau reconnu exempt d'anticorps du virus de la maladie de Newcastle. Les œufs inoculés sont conservés à 37 °C et mirés quotidiennement. Au fur et à mesure, les œufs contenant des embryons morts ou mourants et tous les œufs restant après six jours d'inoculation doivent être réfrigérés à 4 °C et faire l'objet d'une recherche d'hémagglutinines à partir du liquide allantoïdien/amniotique. En l'absence d'hémagglutination, la procédure ci-dessus est répétée en utilisant comme inoculum le liquide allantoïdien/amniotique non dilué.
Lorsqu'il y a hémagglutination, la présence de bactéries doit être exclue par culture. S'il y a des bactéries, il est admis de passer les liquides par un filtre à membrane de 450 nm, d'ajouter un complément d'antibiotiques et d'inoculer les œufs embryonnés comme ci-dessus.
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