1. Au sommaire des annexes du règlement (CEE) n° 2568/91, le titre suivant est ajouté:
« Annexe XVII: Méthode de détermination des stigmastadiènes dans les huiles végétales 84 ».
2. L'annexe I est remplacée par les tableaux et le texte suivants:
« ANNEXE I CARACTÉRISTIQUES DES HUILES D'OLIVE >TABLE>
>TABLE>
3. La note 5 de l'annexe VIII est remplacée par le texte suivant:
« Note 5:
Pour les huiles vierges lampantes et pour les huiles de grignons d'olive brutes, en vue d'obtenir une bonne séparation du pic de la trilinoléine de ceux adjacents ou d'éventuelles substances interférentes, il faut purifier les huiles au préalable conformément à la méthode suivante:
Faire absorber 200 ìl d'huile, sans les diluer, sur une petite colonne de silice pour extraction de liquide-solide (type SEP PAK silica cartridge-waters part. n° 51 900).
Les triglycérides sont élués avec 20 ml d'hexane anhydre pour HPLC, en un temps maximum de 20 secondes.
Le produit élué est séché dans un courant d'azote et repris en isopropanol ou acétone (5 ml). On injecte 10-20 ìl en HPLC. Il faut contrôler que la composition en acides gras de l'huile est la même avant et après la purification, dans les limites d'erreur de la méthode analytique adoptée. »
4. L'annexe XVII suivante est ajoutée:
« ANNEXE XVII MÉTHODE DE DÉTERMINATION DES STIGMASTADIÈNES DANS LES HUILES VÉGÉTALES 1. OBJET Détermination des stigmastadiènes dans les huiles végétales contenant de faibles concentrations de ces hydrocarbures, en particulier dans les huiles d'olive vierge et les huiles de grignons d'olive.
2. CHAMP D'APPLICATION La méthode est utilisable pour toutes les huiles végétales, mais les mesures ne sont fiables que lorsque la teneur en hydrocarbures est comprise entre 0,01 et 4 mg/kg. Cette méthode est particulièrement adaptée pour détecter la présence d'huiles végétales raffinées (olive, grignons d'olive, tournesol, palme, etc) dans l'huile d'olive vierge, étant donné que les huiles raffinées contiennent des stigmastadiènes, alors que les huiles vierges n'en contiennent pas.
3. PRINCIPE Isolement de l'insaponifiable. Séparation de la fraction d'hydrocarbures stéroïdes par chromatographie sur colonne sur gel de silice et analyse par chromatographie capillaire en phase gazeuse.
4. APPAREILLAGE 4.1. Flacons appropriés de 250 millilitres avec condenseur à reflux.
4. 2. Ampoules à décanter de 500 millilitres.
4. 3. Flacons à fond rond de 100 millilitres.
4. 4. Évaporateur rotatif.
4. 5. Colonne de chromatographie en verre (de 1,5 à 2,0 centimètres de diamètre interne sur 50 centimètres de longueur) avec bouchon en Teflon et tampon de laine de verre ou disque de verre fritté dans le fond. Pour préparer la colonne de gel de silice, verser de l'hexane dans la colonne de chromatographie sur une hauteur d'environ 5 centimètres, puis compléter avec une suspension de gel de silice dans de l'hexane (15 grammes dans 40 millilitres) en utilisant des fractions d'hexane. Laisser reposer, puis soumettre à de légères vibrations. Ajouter du sulfate de sodium anhydre sur environ 0,5 centimètre de hauteur, puis éluer l'hexane en excès.
4. 6. Appareil de chromatographie en phase gazeuse avec détecteur d'ionisation à flamme, injecteur-diviseur ou sur colonne refroidie (« on -column ») et four programmable à ± 1 °C près.
4. 7. Colonne capillaire en silice fondue pour chromatographie en phase gazeuse (0,25 ou 0,5 millimètre de diamètre interne sur 25 mètres de longueur) recouvertes d'une phase de phénylméthylsilicone à 5 % formant un film de 0,25 micron d'épaisseur.
Remarque 1.
Il est possible d'utiliser d'autres colonnes de polarité similaire ou inférieure.
4. 8. Intégrateur-enregistreur permettant une intégration de vallée à vallée.
4. 9. Microseringue de 5 à 10 ìl (microlitres) pour chromatographie en phase gazeuse avec aiguille cémentée.
4. 10. Chauffe-ballon électrique ou plaque chauffante.
5. RÉACTIFS Sauf indication contraire, tous les réactifs doivent être purs. Il convient d'utiliser de l'eau distillée ou de l'eau d'une pureté au moins équivalente.
5. 1. Hexane ou mélange d'alcanes de point d'ébullition compris entre 65 et 70 °C, distillés à l'aide d'une colonne de fractionnement.
Remarque 2.
Le solvant doit être distillé pour éliminer les impuretés.
5. 2. Éthanol à 96 v/v.
5. 3. Sulfate de sodium anhydre.
5. 4. Solution d'hydroxyde de potassium alcoolique à 10 %. Ajouter 10 millilitres d'eau à 50 grammes d'hydroxyde de potassium, mélanger, puis dissoudre le mélange dans de l'éthanol jusqu'à obtention de 500 millilitres de solution.
Remarque 3.
La potasse alcoolique brunit au repos. Elle doit être préparée fraîchement chaque jour et conservée dans des flacons en verre brun bin fermés.
5. 5. Gel de silice 60 pour colonne de chromatographie, maille 70 à 230 (Merck réf. 7734 ou similaire).
Remarque 4.
En général, le gel de silice peut être utilisé directement tel qu'il se présente dans le conteneur, sans traitement préalable. Toutefois, certains lots de silice peuvent présenter une faible activité, ce qui se traduit par une mauvaise séparation chromatographique. Dans ce cas, il convient de traiter le gel de silice de la façon suivante: désactiver le gel de silice en le chauffant à 550 °C pendant 4 heures au minimum. Après chauffage, placer le gel de silice dans un déssicateur jusqu'à refroidissement, puis le transvaser dans un flacon fermé. Ajouter 2 % d'eau et secouer jusqu'à disparition des grumeaux et obtention d'une poudre flottant librement. Si certains lots de gel de silice donnent des chromatogrammes présentant des pics parasites, le gel de silice doit être traité comme indiqué ci-dessus. Une autre solution consiste à utiliser un autre gel de silice pur (Merck, réf. 7754).
5. 6. Solution mère (200 ppm) de cholesta-3,5-diène (Sigma, pureté de 99 %) dans de l'hexane. (10 milligrammes dans 50 millilitres).
5. 7. Solution standard de cholesta-3,5-diène dans de l'hexane à une concentration de 20 ppm, obtenue par dilution de la solution précédente.
Remarque 5.
Conservées à une température inférieure à 4 °C, les solutions désignées aux points 5.6 et 5.7 se conserveront pendant au moins 4 mois.
5. 8. Solution de n-nonacosane dans de l'hexane à une concentration d'environ 100 ppm.
5. 9. Gaz vecteur pour la chromatographie: hélium ou hydrogène d'une pureté de 99,9990 %.
5. 10. Gaz auxiliaires pour le détecteur d'ionisation à flamme: hydrogène d'une pureté de 99,9990 % et air purifié.
6. MÉTHODE 6.1. Préparation de l'insaponifiable:
6. 1.1. Peser 20 ± 0,1 grammes d'huile dans un flacon de 250 millilitres (point 4.1), ajouter 1 millilitre de la solution standard de cholesta-3,5-diène (20 microgrammes) et 75 millilitres de potasse alcoolique à 10 %, mettre en place le condenseur à reflux et chauffer en maintenant en légère ébullition pendant 30 minutes. Éloigner le flacon contenant l'échantillon de la source de chaleur et laisser refroidir légèrement (ne pas laisser refroidir complètement, sinon l'échantillon figerait). Ajouter 100 millilitres d'eau et transvaser la solution dans une ampoule à décanter (point 4.2) avec 100 millilitres d'hexane. Secouer le mélange énergiquement pendant 30 secondes et laisser les différentes couches se former.
Remarque 6.
S'il se forme une émulsion qui ne disparaît pas rapidement, ajouter de petites quantités d'éthanol.
6. 1.2. Transférer la phase aqueuse du dessous dans une seconde ampoule à décanter et extraire à nouveau avec 100 millilitres d'hexane. Récupérer à nouveau la phase inférieure et laver les extraits d'hexane (regroupés dans une autre ampoule à décanter) trois fois avec chaque fois 100 millilitres d'un mélange éthanol-eau (1: 1) jusqu'à obtention d'un pH neutre.
6. 1.3. Faire passer la solution d'hexane sur du sulfate de sodium anhydre (50 grammes), laver avec 20 millilitres d'hexane et faire sécher dans un évaporateur rotatif à 30 °C et à une faible pression.
6. 2. Séparation de la fraction d'hydrocarbures stéroïdes:
6. 2.1. Placer le résidu dans la colonne de fractionnement avec deux fractions d'1 millilitre d'hexane, faire s'écouler l'échantillon le long de la colonne en amenant le niveau de la solution au-dessus du sulfate de sodium et commencer l'élution chromatographique avec l'hexane à un débit de 1 millilitre par minute environ. Éliminer le premier éluat de 25 à 30 millilitres, puis recueillir la fraction de 40 millilitres suivante. Ensuite, transférer cette fraction dans un flacon à fond rond de 100 millilitres (point 4.3).
Remarque 7.
La première fraction contient les hydrocarbures saturés (figure 1a) et la seconde, les hydrocarbures stéroïdes. En poursuivant l'élution, on obtient du squalène et des composés apparentés. Pour obtenir une bonne séparation entre les hydrocarbures saturés et les hydrocarbures stéroïdes, le volume des fractions doit être optimal. À cet effet, il convient d'ajuster le volume de la première fraction de manière que, lors de l'analyse de la seconde fraction, les pics représentant les hydrocarbures saturés soient faibles (figure 1c); si ces pics ne se forment pas, mais que l'intensité du pic standard est faible, il faut réduire le volume. En tout état de cause, il est inutile de séparer complètement les composants de la première et de la seconde fractions, étant donné qu'il n'y a pas de chevauchement des pics lors de l'analyse par chromatographie en phase gazeuse si les conditions de la CG sont ajustées conformément au point 6.3.1. En général, il est inutile d'optimaliser le volume de la seconde fraction car on obtient une bonne séparation avec les composants suivants. Quoi qu'il en soit. la formation d'un grand pic à un temps de rétention inférieur d'environ 1,5 minute à celui du pic standard est due au squalène et témoigne d'une mauvaise séparation.
6. 2.2. Faire évaporer la seconde fraction dans un évaporateur à 30 °C et à une faible pression jusqu'à séchage, puis dissoudre immédiatement le résidu dans 0,2 millilitre d'hexane. Conserver la solution au réfrigérateur jusqu'à analyse.
Remarque 8.
Les résidus désignés aux points 6.1.3 et 6.2.2 ne doivent pas être conservés secs et à température ambiante. Dès leur obtention, il convient d'ajouter le solvant et de conserver les solutions au réfrigérateur.
6. 3. Chromatographie en phase gazeuse 6.3.1. Conditions opératoires applicables à l'injection:
- température de l'injecteur: 300 °C,
- température du détecteur: 320 °C,
- intégrateur-enregistreur: les paramètres d'intégration doivent être fixés de manière à permettre une évaluation correcte des aires. Le mode d'intégration de vallée à vallée est recommandé,
- sensibilité: environ 16 fois l'atténuation minimale,
- quantité de solution injectée: 1 microlitre,
- températures de programmation du four: température initiale de 235 °C pendant 6 minutes, puis élévation de 2 °C par minute jusqu'à 285 °C,
- injecteur avec diviseur de débit 1: 15,
- vecteur: hélium ou hydrogène à une pression d'environ 120 kPa.
Ces conditions peuvent être modifiées en fonction des caractéristiques du chromatographe et de la colonne, de manière que les chromatogrammes répondent aux exigences suivantes: formation du pic standard interne à plus ou moins 5 minutes du temps indiqué au point 6.3.2; le pic standard interne doit s'étirer sur au moins 80 % de l'échelle totale.
Il y a lieu de vérifier le système de chromatographie en phase gazeuse en injectant un mélange de solution mère de cholestadiène (point 5.6) et de solution de n-nonacosane (point 5.8). Le pic du cholesta-3,5-diène doit se former avant celui du n-nonacosane (figure 1c); si cela ne se produit pas, deux mesures peuvent être prises: réduire la température du four et/ou utiliser une colonne moins polaire.
6. 3.2. Identification des pics Le pic standard interne se forme à environ 19 minutes et le stigmasta-3,5-diène à un temps de rétention relatif d'environ 1,29 (voir figure 1b). Le stigmastadiène s'accompagne de faibles quantités d'isomère et, généralement, ils produisent un pic chromatographique unique. Néanmoins, si la colonne est trop polaire ou si elle présente un grand pouvoir de résolution, l'isomère peut former un petit pic avant celui du stigmasta-3,5-diène et très près de lui (figure 2). Pour garantir que les stigmastadiènes produisent un pic unique, il est conseillé de remplacer la colonne par une autre moins polaire ou à diamètre interne plus large.
Remarque 9.
La méthode de détermination des hydrocarbures stéroïdes appliquée à l'analyse d'une huile végétale raffinée permet d'obtenir un pic témoin pour les stigmastadiènes. La substance fait apparaître un pic de hauteur appréciable, facilement identifiable.
6. 3.3. Analyse quantitative La teneur en stigmastadiène est déterminée par la formule suivante:
>TABLE>
où: As = aire du pic de stigmastadiène (si le pic est résolu en deux isomères, somme des aires des deux isomères).
Ac = aire du standard interne (cholestadiène).
Mc = masse de standard ajoutée, en microgrammes.
M° = masse d'huile prélevée, en grammes.
Limite de détection: 0,01 mg/kg environ. »
Figure 1
Chromatogrammes (chromatographie en phase gazeuse) obtenus par analyse d'échantillons d'huile d'olive sur une colonne capillaire en silice fondue (0,25 millimètre de diamètre interne sur 25 mètres de longueur) recouverte d'un film de 0,25 micron d'épaisseur de phénylméthylsilicone à 5 %.
a) Première fraction (30 millilitres) d'une huile vierge, éluée avec le standard.
b) Seconde fraction (40 millilitres) d'une huile d'olive contenant 0,10 mg/kg de stigmastadiènes.
c) Seconde fraction (40 millilitres) contenant une petite proportion de la première fraction.
Figure 2
Chromatogramme en phase gazeuse obtenu à partir d'un échantillon d'huile d'olive raffinée analysé sur une colonne DB-5 sur laquelle figure l'isomère de stigmasta-3,5-diène.