CHAPITRE C
Échantillonnage et tests de laboratoire
1. Échantillonnage
Tout échantillon destiné à être examiné en vue de la détection d'une EST doit être prélevé selon les méthodes et protocoles prévus dans la dernière édition du «Manuel des tests de diagnostic et des vaccins pour les animaux terrestres» de l'Organisation mondiale de la santé animale (OIE) (ci-après le «Manuel»). En l'absence de méthodes et de protocoles de l'OIE ou en complément de ceux-ci, et pour garantir un approvisionnement suffisant en matériel, l'autorité compétente veille à ce que des méthodes et des protocoles d'échantillonnage conformes aux lignes directrices définies par le laboratoire de référence de l'Union européenne soient utilisés.
L'autorité compétente prélève en particulier les tissus qui conviennent, selon les avis scientifiques disponibles et les lignes directrices du laboratoire de référence de l'Union européenne, pour assurer la détection de toutes les souches connues d'EST chez les petits ruminants et en conserve au moins la moitié à l'état frais mais non congelé jusqu'à l'obtention d'un résultat négatif au test rapide. Lorsque le résultat est positif ou douteux, les tissus restants doivent faire l'objet d'un test de confirmation et être traités par la suite conformément aux lignes directrices définies par le laboratoire de référence de l'Union européenne dans son manuel technique sur la caractérisation des souches d'EST chez les petits ruminants destiné aux laboratoires de référence nationaux.
Les échantillons doivent faire l'objet d'un marquage correct quant à l'identité de l'animal sur lequel ils sont prélevés.
2. Laboratoires
Tout examen de laboratoire concernant les EST doit être réalisé dans un laboratoire de diagnostic officiel désigné à cet effet par l'autorité compétente.
3. Méthodes et protocoles
3. 1. Tests de laboratoire destinés à détecter la présence d'ESB chez les bovins
a) Cas suspects
Les échantillons provenant de bovins, transmis à un laboratoire pour y faire l'objet d'examens conformément aux dispositions de l'article 12, paragraphe 2, sont soumis immédiatement à des tests de confirmation pratiqués selon au moins l'une des méthodes ou l'un des protocoles suivants prévus dans la dernière édition du Manuel:
i) méthode immunohistochimique (IHC);
ii) Western blot;
iii) mise en évidence de fibrilles caractéristiques au microscope électronique;
iv) examen histopathologique;
v) combinaison de tests rapides parmi ceux définis au troisième alinéa.
Si l'examen histopathologique est douteux ou négatif, les tissus sont soumis à un examen complémentaire pratiqué selon une autre méthode ou un autre protocole de confirmation.
Les tests rapides peuvent servir au dépistage initial des cas suspects ou, en cas de résultat douteux ou positif, à leur confirmation, conformément aux lignes directrices du laboratoire de référence de l'Union européenne [règles de l'OIE sur la confirmation officielle de la présence d'ESB chez des bovins (après l'obtention d'un premier résultat réactif lors d'un test rapide homologué)], dès lors que sont réunies toutes les conditions suivantes:
i) le test de confirmation est effectué dans un laboratoire de référence national pour les EST;
ii) l'un des deux tests rapides est un Western blot;
iii) le second test rapide utilisé:
— prévoit un contrôle du tissu négatif et un échantillon aux fins du dépistage de l'ESB pour contrôler le tissu positif,
— est différent de celui utilisé pour l'examen initial;
iv) lorsque le premier test est un Western blot rapide, son résultat est documenté et l'image de la membrane est transmise au laboratoire de référence national pour les EST; et
v) lorsque le résultat de l'examen initial n'est pas confirmé par le second test rapide, l'échantillon est examiné selon une autre méthode de confirmation. Lorsque l'examen histopathologique est utilisé à cette fin et que ses résultats sont douteux ou négatifs, les tissus sont soumis à un examen complémentaire pratiqué selon une autre méthode ou un autre protocole de confirmation.
Si l'un des examens de confirmation mentionnés aux points i) à v) du premier alinéa aboutit à des résultats positifs, l'animal est considéré comme un cas positif d'ESB.
b) Surveillance de l'ESB
Les échantillons provenant de bovins, transmis à un laboratoire pour y faire l'objet d'examens conformément aux dispositions de l'annexe III, chapitre A, partie I, sont soumis à un test rapide.
Si le test rapide est douteux ou positif, l'échantillon est immédiatement soumis à des examens de confirmation pratiqués selon au moins l'une des méthodes ou l'un des protocoles suivants prévus dans la dernière édition du Manuel:
i) méthode immunohistochimique (IHC);
ii) Western blot;
iii) mise en évidence de fibrilles caractéristiques au microscope électronique;
iv) examen histopathologique;
v) combinaison de tests rapides parmi ceux définis au quatrième alinéa.
Si l'examen histopathologique est douteux ou négatif, les tissus sont soumis à un examen complémentaire pratiqué selon une autre méthode ou un autre protocole de confirmation.
Des tests rapides peuvent servir au dépistage initial des cas suspects ou, en cas de résultat douteux ou positif, à leur confirmation, conformément aux lignes directrices du laboratoire de référence de l'Union européenne [règles de l'OIE sur la confirmation officielle de la présence d'ESB chez des bovins (après l'obtention d'un premier résultat réactif lors d'un test rapide homologué)], dès lors que sont réunies toutes les conditions suivantes:
i) le test de confirmation est effectué dans un laboratoire de référence national pour les EST;
ii) l'un des deux tests rapides est un Western blot;
iii) le second test rapide utilisé:
— prévoit un contrôle du tissu négatif et un échantillon aux fins du dépistage de l'ESB pour contrôler le tissu positif,
— est différent de celui utilisé pour l'examen initial;
iv) lorsque le premier test est un Western blot rapide, son résultat est documenté et l'image de la membrane est transmise au laboratoire de référence national pour les EST; et
v) lorsque le résultat de l'examen initial n'est pas confirmé par le second test rapide, l'échantillon est soumis à un examen pratiqué selon une autre méthode de confirmation. Lorsque l'examen histopathologique est utilisé à cette fin et que ses résultats sont douteux ou négatifs, les tissus sont soumis à un examen complémentaire pratiqué selon une autre méthode ou un autre protocole de confirmation.
Un animal est considéré comme un cas positif d'ESB si les résultats du test rapide sont douteux ou positifs, et si l'un au moins des examens de confirmation mentionnés aux points i) à v) du deuxième alinéa est positif.
c) Examen complémentaire des cas positifs d'ESB
Des échantillons de tous les cas positifs d'ESB sont transmis à un laboratoire, désigné par l'autorité compétente et ayant participé de manière concluante au dernier essai d'aptitude organisé par le laboratoire de référence de l'Union européenne pour la réalisation de tests de discrimination sur les cas d'ESB confirmés, où ils sont soumis à des tests complémentaires conformément aux méthodes et protocoles établis dans le guide du laboratoire de référence de l'Union européenne pour la classification des isolats d'EST bovines (méthode en deux étapes pour la classification provisoire des isolats d'EST bovines).
3. 2. Tests de laboratoire destinés à détecter la présence d'EST chez les ovins et les caprins
a) Cas suspects
Les échantillons provenant d'ovins et de caprins transmis à un laboratoire pour y faire l'objet d'examens conformément aux dispositions de l'article 12, paragraphe 2, sont soumis immédiatement à des tests de confirmation pratiqués selon au moins l'une des méthodes ou l'un des protocoles suivants prévus dans la dernière édition du Manuel:
i) méthode immunohistochimique (IHC);
ii) Western blot;
iii) mise en évidence de fibrilles caractéristiques au microscope électronique;
iv) examen histopathologique.
Si l'examen histopathologique est douteux ou négatif, les tissus sont soumis à un examen complémentaire pratiqué selon une autre méthode ou un autre protocole de confirmation.
Les tests rapides peuvent servir au dépistage initial des cas suspects. Ils ne peuvent être utilisés en tant qu'examens de confirmation ultérieurs.
Si les résultats du test rapide utilisé pour le dépistage initial des cas suspects sont positifs ou douteux, l'échantillon est soumis à l'un des examens de confirmation mentionnés aux points i) à iv) du premier alinéa. Lorsque l'examen histopathologique est utilisé à cette fin et que ses résultats sont douteux ou négatifs, les tissus sont soumis à un examen complémentaire pratiqué selon une autre méthode ou un autre protocole de confirmation.
Si l’un des examens de confirmation mentionnés aux points i) à iv) du premier alinéa aboutit à des résultats positifs, l’animal est considéré comme un cas positif d’EST.
b) Surveillance des EST
Les échantillons provenant d'ovins et de caprins, transmis au laboratoire pour y être soumis à des tests conformément aux dispositions de l'annexe III, chapitre A, partie II (surveillance des ovins et des caprins), font l'objet d'un test rapide visant à garantir la détection de toutes les souches connues d'EST.
Si le test rapide donne un résultat douteux ou positif, les tissus prélevés sont immédiatement transmis à un laboratoire officiel pour y subir un examen de confirmation par histopathologie, immunohistochimie, Western blot ou mise en évidence de fibrilles caractéristiques au microscope électronique, comme prévu au point a). Si le résultat de l'examen de confirmation est négatif ou douteux, les tissus sont soumis à un examen complémentaire par immunohistochimie ou Western blot.
Si l’un des examens de confirmation aboutit à des résultats positifs, l’animal est considéré comme un cas positif d’EST.
c) Examen complémentaire des cas positifs d'EST
Les échantillons qui, à la suite des examens visés aux points a) ou b), sont considérés comme des cas positifs d’EST, mais ne sont pas considérés comme des cas atypiques, sont examinés afin d’exclure la présence d’ESB uniquement lorsqu’ils proviennent d’un cas de référence. Les autres cas qui présentent des caractéristiques qui, selon le laboratoire d’essai, méritent une enquête sont également examinés afin d’exclure la présence d’ESB.
i) Test moléculaire initial reposant sur une méthode de discrimination par Western blot
Aux fins de l’exclusion de la présence d’ESB, les échantillons sont soumis à un test reposant sur une méthode de discrimination par Western blot figurant dans les lignes directrices du laboratoire de référence de l’Union européenne. L’examen de discrimination est réalisé par un laboratoire officiel désigné par l’autorité compétente et ayant participé de manière concluante au dernier essai d’aptitude organisé par le laboratoire de référence de l’Union européenne pour l’utilisation de cette méthode.
ii) Test moléculaire secondaire reposant sur d’autres méthodes d’essai moléculaire
Les cas d’EST pour lesquels le test moléculaire initial visé au point i) ne permet pas d’exclure la présence de l’ESB conformément aux lignes directrices du laboratoire de référence de l’Union européenne sont immédiatement transmis, avec toutes les informations utiles disponibles, au laboratoire de référence de l’Union européenne. Les échantillons sont soumis, pour confirmation, à un examen complémentaire par au moins une autre méthode qui diffère, sur le plan immunochimique, de la méthode d’identification moléculaire initiale. La conception des tests moléculaires secondaires, conformément aux connaissances scientifiques et expertise des laboratoires les plus récentes, est approuvée au cas par cas par le laboratoire de référence de l’Union européenne, comme décrit dans ses lignes directrices. Le laboratoire de référence de l’Union européenne est assisté par un groupe d’experts [le «groupe d’experts en identification de la souche» (STEG)] ainsi que par un représentant du laboratoire national de référence compétent.
Les résultats sont interprétés par le laboratoire de référence de l’Union européenne, assisté par le STEG, ainsi que par un représentant du laboratoire national de référence compétent. La Commission est informée immédiatement du résultat de cette interprétation.
iii) Essai biologique sur souris
Les échantillons pour lesquels la présence d'ESB est suspectée ou n'a pu être écartée de manière concluante à l'issue du test moléculaire secondaire sont soumis, pour confirmation définitive, à un examen complémentaire prenant la forme d'un essai biologique sur souris. La nature ou la quantité du matériel disponible pourront influer sur la conception de l'essai biologique, qui sera agréé au cas par cas par le laboratoire de référence de l'Union européenne assisté du STEG. Les essais biologiques seront réalisés par le laboratoire de référence de l'Union européenne ou par les laboratoires désignés par celui-ci.
Les résultats seront interprétés par le laboratoire de référence de l'Union européenne assisté du STEG. La Commission est informée immédiatement du résultat de cette interprétation.
3. 3. Tests de laboratoire destinés à détecter la présence d'EST chez les espèces autres que celles visées aux points 3.1 et 3.2
Lorsqu'il existe des méthodes et des protocoles établis pour les tests effectués en vue de confirmer la présence suspectée d'une EST chez une espèce autre que les espèces bovine, ovine et caprine, les tests comprennent au moins l'examen histopathologique des tissus cérébraux. L'autorité compétente peut également exiger le recours à des techniques de laboratoire telles que l'immunohistochimie, le Western blot, la mise en évidence de fibrilles caractéristiques au microscope électronique ou d'autres méthodes permettant de détecter la forme de la protéine prion associée à la maladie. Quoi qu'il en soit, si l'examen histopathologique initial est négatif ou douteux, il faut procéder au moins à un autre examen de laboratoire. Si la maladie se manifeste pour la première fois, au moins trois examens différents donnant des résultats positifs sont requis.
En particulier, lorsque des cas d'ESB sont suspectés chez une espèce autre que les bovins, ces cas sont transmis au laboratoire de référence de l'Union européenne qui procède à une caractérisation complémentaire avec l'aide du STEG.
4. Tests rapides
En ce qui concerne l'exécution de tests rapides conformément à l'article 5, paragraphe 3, et à l'article 6, paragraphe 1, seules les méthodes suivantes sont utilisées à ces fins pour la surveillance de l'ESB chez les bovins:
— test fondé sur la technique du Western blot pour la détection de la fraction résistant à la protéinase K PrPRes (test Prionics-Check Western),
— immunodosage de la PrPRes par la méthode immunométrique à deux sites, dite méthode «en sandwich» (protocole court d'analyse), après dénaturation et concentration (test rapide Bio-Rad TeSeE SAP),
— immunodosage sur microplaques (ELISA) pour la détection de la PrPRes résistant à la protéinase K avec anticorps monoclonaux (test Prionics-Check LIA),
— immunodosage à l'aide d'un polymère chimique pour la capture sélective de la PrPSc et d'un anticorps de détection monoclonal dirigé contre les régions conservées de la molécule de PrP [kit IDEXX HerdChek ESB Antigène, EIA, et HerdChek ESB-Tremblante Antigène (IDEXX Laboratories)],
— immunodosage à flux latéral à l'aide de deux anticorps monoclonaux différents pour la détection des fractions de la PrP résistant à la protéinase K (test Prionics Check PrioSTRIP),
— immunodosage à deux sites à l'aide de deux anticorps monoclonaux différents dirigés contre deux épitopes présents à l'état hautement déroulé dans la PrPSc bovine (test Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit).
En ce qui concerne l'exécution des tests rapides conformément à l'article 5, paragraphe 3, et à l'article 6, paragraphe 1, seules les méthodes suivantes sont utilisées à ces fins pour la surveillance de l'EST chez les ovins et les caprins:
— immunodosage de la PrPRes par la méthode immunométrique à deux sites, dite méthode «en sandwich» (protocole court d'analyse), après dénaturation et concentration (test rapide Bio-Rad TeSeE SAP),
— immunodosage pour la détection de la PrPRes par la méthode immunométrique à deux sites, dite méthode «en sandwich», à l'aide du test TeSeE SAP Sheep/Goat Detection kit, après dénaturation et concentration à l'aide du test TeSeE Sheep/Goat Purification kit (test rapide Bio-Rad TeSeE Sheep/Goat),
— immunodosage à l'aide d'un polymère chimique pour la capture sélective de la PrPSc et d'un anticorps de détection monoclonal dirigé contre les régions conservées de la molécule de PrP [HerdChek ESB-Tremblante Antigène (IDEXX Laboratories)],
Pour tous ces tests rapides, l'échantillon de tissu utilisé doit être conforme au mode d'emploi du fabricant.
Les fabricants des tests rapides doivent avoir mis en place un système d'assurance de la qualité agréé par le laboratoire de référence de l'Union européenne et garantissant l'efficacité constante des tests. Les fabricants doivent fournir les protocoles de test au laboratoire de référence de l'Union européenne.
Les tests rapides et protocoles de test ne peuvent être modifiés qu'après notification des modifications envisagées au laboratoire de référence de l'Union européenne et à condition que celui-ci ait constaté que ces modifications n'altèrent pas la sensibilité, la spécificité ou la fiabilité du test rapide. Ce constat est communiqué à la Commission et aux laboratoires de référence nationaux.
5. Autres tests
(À définir.)