CRITÈRES APPLICABLES À LA PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS ET AUX MÉTHODES D'ANALYSE UTILISÉES POUR LE CONTRÔLE OFFICIEL DES TENEURS EN MYCOTOXINES DES DENRÉES ALIMENTAIRES
1. INTRODUCTION
1. 1. Précautions
Les mycotoxines étant généralement réparties de façon hétérogène, les échantillons sont préparés, et surtout homogénéisés, avec le plus grand soin.
Lorsque l’homogénéisation a lieu au laboratoire, la totalité de l’échantillon reçu au laboratoire doit être homogénéisée.
Au cours de l’analyse des aflatoxines, il convient d'éviter autant que possible la lumière du jour, car l'aflatoxine se décompose progressivement sous l'influence de la lumière ultraviolette.
1. 2. Calcul de la proportion coque/amande dans les fruits à coque entiers
Les limites fixées pour les aflatoxines par le règlement (CE) no 466/2001 s'appliquent à la partie comestible. La teneur en aflatoxines de la partie comestible peut être déterminée comme suit:
— les échantillons de fruits à coque peuvent être décortiqués pour que la teneur en aflatoxines soit déterminée dans la partie comestible;
— la procédure de préparation de l'échantillon peut s'appliquer au fruit avec sa coque. Le mode de prélèvement et la méthode d'analyse doivent prévoir une estimation du poids des amandes dans l'échantillon global. Celui-ci est estimé après établissement d’un facteur approprié caractérisant la proportion entre la coque et l'amande dans les fruits entiers. Cette proportion sert à déterminer la quantité d'amandes dans l'échantillon global utilisé pour la préparation et la méthode d'analyse de l'échantillon.
Une centaine de fruits à coque entiers sont prélevés de manière aléatoire sur le lot ou retirés de chaque échantillon global pour être mis de côté. Pour chaque échantillon de laboratoire, on peut obtenir le rapport recherché en pesant les fruits entiers, en enlevant leur coque et en pesant les portions de coques et d'amandes.
La proportion entre la coque et l'amande, une fois déterminée par le laboratoire à partir d'un certain nombre d'échantillons, peut être prise en compte dans les travaux d'analyse ultérieurs. Toutefois, s'il est constaté qu'un échantillon de laboratoire dépasse les limites fixées, la proportion est déterminée, pour cet échantillon, à l'aide de la centaine de fruits mis de côté.
2. TRAITEMENT DE L'ÉCHANTILLON REÇU DANS LE LABORATOIRE
Chaque échantillon de laboratoire est finement broyé et soigneusement mélangé selon une méthode éprouvée garantissant une homogénéisation complète.
Si la teneur maximale s'applique à la matière sèche, la teneur du produit en matière sèche est déterminée sur une partie de l'échantillon homogénéisé à l'aide d'une méthode dont la précision en la matière est démontrée.
3. ÉCHANTILLONS IDENTIQUES
Les échantillons identiques destinés à des mesures exécutoires, au commerce (défense) et à des fins de référence (arbitrage) sont prélevés sur le produit homogénéisé, pour autant que cette procédure n’aille pas à l’encontre de la législation des États membres concernant le droit des exploitants du secteur alimentaire.
4. MÉTHODE D'ANALYSE À UTILISER PAR LE LABORATOIRE ET EXIGENCES DE CONTRÔLE
4. 1. Définitions
Certaines des définitions les plus courantes que les laboratoires sont tenus d'utiliser sont indiquées ci-après.
rrépétabilité, valeur en dessous de laquelle on peut s'attendre à ce que la différence absolue entre les résultats de deux tests individuels, obtenus dans des conditions de répétabilité (c'est-à-dire même échantillon, même opérateur, même appareillage, même laboratoire et court intervalle de temps), se situe dans une limite donnée de probabilité (en principe 95 %) d'où r = 2,8 × sr.
srécart-type, calculé à partir des résultats obtenus dans des conditions de répétabilité.
RSDrécart-type relatif, calculé à partir des résultats obtenus dans des conditions de répétabilité [(sr / ) × 100].
Rreproductibilité, valeur en dessous de laquelle on peut s'attendre à ce que la différence absolue entre les résultats de tests individuels, obtenus dans des conditions de reproductibilité (c'est-à-dire pour un produit identique, obtenu par les opérateurs dans différents laboratoires utilisant la méthode de test normalisée), se situe dans une limite donnée de probabilité (en principe 95 %) ; R = 2,8 × sR.
sRécart-type, calculé à partir des résultats obtenus dans des conditions de reproductibilité.
RSDRécart-type relatif, calculé à partir des résultats obtenus dans des conditions de reproductibilité [(sR / ) × 100].
4. 2. Exigences générales
Les méthodes analytiques de confirmation utilisées pour le contrôle des denrées alimentaires doivent satisfaire aux dispositions de l'annexe III, points 1 et 2, du règlement (CE) no 882/2004.
4. 3. Exigences spécifiques
4. 3.1. Exigences spécifiques pour les méthodes de confirmation
4. 3.1.1. Critères de performance
L'utilisation de méthodes de confirmation entièrement validées (à savoir les méthodes validées au moyen d'études collaboratives portant sur les matrices pertinentes) est recommandée lorsque ces méthodes conviennent et sont disponibles. D'autres méthodes de confirmation validées et appropriées (telles les méthodes validées en interne sur des matrices pertinentes appartenant au groupe de produits considéré) peuvent également être utilisées, à condition qu'elles satisfassent aux critères de performance énoncés dans les tableaux figurant ci-après.
Si possible, la validation des méthodes validées en interne doit se faire au moyen d'un matériau de référence certifié.
a) Critères de performance pour les aflatoxines
Note:
— Valeurs à appliquer à la fois à B1 et à la somme de B1 + B2 + G1 + G2.
— Si les sommes des différentes aflatoxines B1 + B2 + G1 + G2 doivent être enregistrées, la réponse de chacune d'elles au système d'analyse doit être connue ou équivalente.
| Critère | Plage de concentration | Valeur recommandée | Valeur maximale autorisée
| Valeurs à blanc | Toutes | Négligeable | —
| | | |
| Récupération — Aflatoxine M1 | 0,01 - 0,05 μg/kg | 60 à 120 % |
| | > 0,05 μg/kg | 70 à 110 % |
| | | |
| Récupération — Aflatoxines B1, B2, G1, G2 | < 1,0 μg/kg | 50 à 120 % |
| | 1 - 10 μg/kg | 70 à 110 % |
| | > 10 μg/kg | 80 à 110 % |
| | | |
| Reproductibilité RSDR | Toutes | Dérivée de l'équation de Horwitz (*) (**) | 2 × la valeur dérivée de l'équation de Horwitz (*) (**)
| On peut calculer la répétabilité RSDr en multipliant par 0,66 la reproductibilité RSDR à la concentration présentant un intérêt.
b) Critères de performance pour l'ochratoxine A
|
Teneur
μg/kg
| Ochratoxine A
| RSDr % | RSDR % | Récupération %
| < 1 | ≤ 40 | ≤ 60 | De 50 à 120
| ≥ 1 | ≤ 20 | ≤ 30 | De 70 à 110
c) Critères de performance pour la patuline
|
Teneur
μg/kg
| Patuline
| RSDr % | RSDR % | Récupération %
| < 20 | ≤ 30 | ≤ 40 | De 50 à 120
| 20 — 50 | ≤ 20 | ≤ 30 | De 70 à 105
| > 50 | ≤ 15 | ≤ 25 | De 75 à 105
d) Critères de performance pour le désoxynivalénol
|
Teneur
μg/kg
| Désoxynivalénol
| RSDr % | RSDR % | Récupération %
| > 100 — ≤ 500 | ≤ 20 | ≤ 40 | De 60 à 110
| > 500 | ≤ 20 | ≤ 40 | De 70 à 120
e) Critères de performance pour la zéaralénone
|
Teneur
μg/kg
| Zéaralénone
| RSDr % | RSDR % | Récupération %
| ≤ 50 | ≤ 40 | ≤ 50 | De 60 à 120
| > 50 | ≤ 25 | ≤ 40 | De 70 à 120
f) Critères de performance pour les fumonisines B1 et B2 prises séparément
|
Teneur
μg/kg
| Fumonisines B1 et B2 prises séparément
| RSDr % | RSDR % | Récupération %
| ≤ 500 | ≤ 30 | ≤ 60 | De 60 à 120
| > 500 | ≤ 20 | ≤ 30 | De 70 à 110
g) Critères de performance pour les toxines T-2 et HT-2 prises séparément
|
Teneur
μg/kg
| Toxines T-2 et HT-2 prises séparément
| RSDr % | RSDR % | Récupération %
| 15-250 | ≤ 30 | ≤ 50 | De 60 à 130
| > 250 | ≤ 25 | ≤ 40 | De 60 à 130
h) Critères de performance pour la citrinine
|
Teneur
μg/kg
| Citrinine
| RSDr % | RSDR recommandé % | RSDR maximal autorisé % | Récupération %
| Toutes | 0,66 × RSDR | Dérivée de l'équation de Horwitz (*) (**) | 2 × la valeur dérivée de l'équation de Horwitz (*) (**) | De 70 à 120
i) Notes concernant les critères de performance pour les mycotoxines:
— Les limites de détection des méthodes utilisées ne sont pas indiquées, étant donné que les valeurs relatives à la fidélité sont données pour les concentrations présentant un intérêt.
— Les valeurs relatives à la fidélité sont calculées à partir de l'équation de Horwitz, en particulier à partir de l'équation initiale de Horwitz (pour les concentrations 1,2 × 10–7 ≤ C ≤ 0,138) (*) et à partir de l'équation modifiée de Horwitz (pour les concentrations C < 1,2 × 10–7) (**).
(*) Équation de Horwitz pour les concentrations 1,2 × 10–7 ≤ C ≤ 0,138:
RSDR = 2(1-0,5logC)
(réf.: W. Horwitz, L.R. Kamps et K.W. Boyer, J. Assoc. Off. Analy. Chem., 1980, 63, 1344)
(**) Équation modifiée de Horwitz (*) pour les concentrations C < 1,2 × 10–7:
RSDR = 22 %
(réf.: M. Thompson, Analyst, 2000, 125, p. 385-386)
équation dans laquelle:
— RSDR est l'écart type relatif calculé à partir des résultats obtenus dans des conditions de reproductibilité [(sR/) × 100],
— C est le taux de concentration (c'est-à-dire 1 = 100 g/100 g, 0,001 = 1 000 mg/kg).
Il s'agit d'une équation générale relative à la fidélité dont il a été constaté qu'elle est indépendante de l'analyte et de la matrice et uniquement dépendante de la concentration pour la plupart des méthodes d'analyse de routine.
4. 3.1.2. Adaptation à l'usage prévu
Il est permis d'adopter une démarche fondée sur l'adaptation à l'usage prévu pour évaluer si les méthodes validées en interne peuvent servir de méthodes de remplacement aux fins du contrôle officiel. Les méthodes retenues aux fins du contrôle officiel doivent produire des résultats dont l'incertitude de mesure normalisée (u) est inférieure à l'incertitude de mesure normalisée maximale, laquelle est calculée au moyen de la formule suivante:
UfLOD/22αC2
où:
— Uf est l'incertitude de mesure normalisée maximale (μg/kg),
— LOD est la limite de détection que permet d'atteindre la méthode (μg/kg),
— α est un facteur numérique constant dépendant de la valeur de C. Les valeurs à utiliser sont indiquées dans le tableau ci-après,
— C est la concentration présentant un intérêt (μg/kg).
Si la méthode d'analyse donne des résultats présentant des mesures d'incertitude inférieures à l'incertitude normalisée maximale, la méthode est réputée aussi valable qu'une méthode satisfaisant aux critères de performance énoncés au point 4.3.1.1.
Tableau
Valeurs numériques correspondant à la constante α dans la formule énoncée au présent point, en fonction de la concentration présentant un intérêt
| C (μg/kg) | α
| ≤ 50 | 0,2
| 51 - 500 | 0,18
| 501 - 1 000 | 0,15
| 1 001 - 10 000 | 0,12
| > 10 000 | 0,1
4. 3.2. Exigences spécifiques pour les méthodes de dépistage semi-quantitatives
4. 3.2.1. Champ d'application
Les exigences s'appliquent aux méthodes bioanalytiques fondées sur l'immunoreconnaissance ou la fixation à un récepteur (ELISA, bandelettes réactives, dispositifs à flux latéral, immunodétecteurs, etc.) et aux méthodes physico-chimiques fondées sur la chromatographie ou la détection directe par spectrométrie de masse (SM en milieu ambiant, par exemple). Les autres méthodes (telle la chromatographie sur couche mince) ne sont pas exclues si les signaux émis se rapportent directement aux mycotoxines considérées et permettent que le principe décrit ci-dessous soit applicable.
Les exigences spécifiques s'appliquent aux méthodes donnant comme résultat de la mesure une valeur numérique [réponse (relative) d'un lecteur de bandelettes réactives, signal du couplage de la chromatographie en phase liquide (CL) et de la spectrométrie de masse, etc.] et auxquelles s'appliquent les règles statistiques ordinaires.
Les exigences ne s'appliquent pas aux méthodes qui ne donnent pas des valeurs numériques (mais se limitent, par exemple, à signaler la présence ou l'absence), lesquelles requièrent d'autres modes de validation. Les exigences spécifiques applicables à ces méthodes sont énoncées au point 4.3.3.
Le présent document décrit les procédures de validation des méthodes de dépistage par validation interlaboratoire, de vérification de la performance d'une méthode validée au terme d'un exercice interlaboratoire et de validation monolaboratoire d'une méthode de dépistage.
4. 3.2.2. Terminologie
Concentration cible du dépistage (STC): la concentration présentant un intérêt pour la détection de la mycotoxine dans un échantillon. Lorsqu'il s'agit de vérifier le respect des limites réglementaires, la STC est égale à la teneur maximale applicable. Si l'objectif est autre ou si aucune teneur maximale n'est fixée, la STC est prédéfinie par le laboratoire.
Méthode de dépistage: la méthode servant à sélectionner, avec un degré de certitude donné, les échantillons dont la teneur en mycotoxines dépasse la concentration cible du dépistage (STC). Pour le dépistage des mycotoxines, une certitude de 95 % est considérée comme adaptée à l'usage prévu. Le résultat du dépistage est soit «négatif», soit «suspect». Les méthodes de dépistage doivent offrir une grande capacité de traitement d'échantillons à la fois efficace et économique, augmentant les chances de découvrir de nouveaux cas d'exposition élevée des consommateurs et de risques pour leur santé. Ces méthodes sont fondées sur des méthodes de bioanalyse, de CL-SM ou de CLHP. Les résultats dépassant la valeur seuil doivent être vérifiés; à cet effet, l'échantillon original est soumis à une nouvelle analyse complète réalisée au moyen d'une méthode de confirmation.
Échantillon négatif: un échantillon dont la teneur en mycotoxine est inférieure à la STC avec une certitude de 95 % (ce niveau de certitude signifie qu'il y a 5 % de risque que l'échantillon ait été déclaré erronément négatif).
Échantillon faussement négatif ou faux négatif: un échantillon dont la teneur en mycotoxine est supérieure à la STC, mais qui a été déclaré négatif.
Échantillon suspect: un échantillon qui dépasse la valeur seuil (voir infra) et dont la teneur en mycotoxine peut être supérieure à la STC. Tout échantillon suspect est soumis à une analyse de confirmation qui doit permettre d'identifier et de quantifier avec précision la mycotoxine.
Échantillon faussement suspect: un échantillon négatif déclaré suspect.
Méthodes de confirmation: les méthodes qui fournissent des informations complètes ou complémentaires permettant l'identification de la mycotoxine et sa quantification univoque au niveau considéré.
Valeur seuil: la réaction, le signal ou la concentration, obtenus au moyen de la méthode de dépistage, au-dessus desquels l'échantillon est réputé suspect. Le seuil est déterminé pendant la validation, compte tenu de la variabilité de la mesure.
Échantillon témoin (blanc de matrice) négatif: un échantillon dont on sait qu'il est exempt de la mycotoxine à dépister à la suite, par exemple, d'une détermination antérieure réalisée au moyen d'une méthode de confirmation d'une sensibilité suffisante. Si aucun échantillon témoin ne peut être obtenu, le matériau présentant la teneur la plus basse possible peut être utilisé aussi longtemps que la teneur permet de conclure que la méthode de dépistage est adaptée à sa destination.
Échantillon témoin positif: un échantillon contenant la mycotoxine à la concentration cible du dépistage, par exemple un matériau de référence certifié, un matériau dont le contenu est connu (un matériau d'essai provenant d'essais d'aptitude, par exemple) ou un matériau ayant été suffisamment caractérisé au moyen d'une méthode de confirmation. Faute d'un tel échantillon, il s'agit d'un mélange d'échantillons présentant des niveaux de contamination différents ou d'un échantillon enrichi préparé en laboratoire et suffisamment caractérisé, à condition qu'il puisse être prouvé que le niveau de contamination a été vérifié.
4. 3.2.3. Procédure de validation
La validation vise à démontrer que la méthode de dépistage est adaptée à l'usage auquel elle est destinée. Elle se fait par détermination de la valeur seuil et par détermination du taux d'échantillons faussement négatifs et d'échantillons faussement suspects. Des caractéristiques de la performance telles que la sensibilité, la sélectivité et la fidélité sont inhérentes à ces deux paramètres.
Les méthodes de dépistage peuvent faire l'objet d'une validation interlaboratoire ou monolaboratoire. Si les données d'une validation interlaboratoire d'une méthode sont déjà disponibles pour une combinaison mycotoxine/matrice/STC donnée, un laboratoire appliquant la méthode pourra se contenter de vérifier les performances de celle-ci.
4. 3.2.3.1. Validation initiale par validation monolaboratoire
Mycotoxines
La validation doit être faite pour chaque mycotoxine concernée. Si des méthodes de bioanalyse produisent une réponse combinée pour un groupe donné de mycotoxines (les aflatoxines B1, B2, G1 et G2 et les fumonisines B1 et B2, par exemple), leur applicabilité doit être démontrée et les limites de l'essai doivent être mentionnées dans la définition du champ d'application de la méthode. La réactivité croisée non souhaitée (réaction, par exemple, du déoxynivalénol-3-glycoside, du 3-acétyldéoxynivalénol ou du 15-acétyldéoxynivalénol aux méthodes immunologiques de dépistage du déoxynivalénol) ne devrait pas augmenter le taux d'échantillons faussement négatifs pour les mycotoxines ciblées, mais elle pourrait augmenter le taux d'échantillons faussement suspects. La réalisation d'analyses de confirmation visant à identifier et à quantifier précisément les mycotoxines devrait limiter cette augmentation indésirable.
Matrices
Une validation initiale devrait être réalisée pour chaque produit ou, lorsqu'il est avéré que la méthode est utilisable pour des produits multiples, pour chaque groupe de produits. Dans le second cas, un produit représentatif et présentant un intérêt est sélectionné dans le groupe concerné (voir ci-après tableau A).
Ensemble d'échantillons
Le nombre minimal d'échantillons requis en vue de la validation est fixé à 20 échantillons témoins négatifs homogènes et à 20 échantillons témoins positifs homogènes contenant la mycotoxine à la STC, analysés dans des conditions de fidélité intermédiaire (RSDRi) pendant une période s'étalant sur cinq jours. Facultativement, des ensembles supplémentaires de 20 échantillons dans lesquels la mycotoxine est présente à des teneurs différentes peuvent être ajoutés à l'ensemble constitué pour la validation, pour que l'on puisse se faire une idée de la plage dans laquelle la méthode permet de discriminer les différentes concentrations de la mycotoxine.
Concentration
La méthode doit être validée pour chaque STC à utiliser lors des applications de routine.
4. 3.2.3.2. Validation initiale au moyen d'études collaboratives
La validation au moyen d'études collaboratives doit se faire conformément à un protocole des essais collaboratifs internationalement reconnu (par exemple la norme ISO 5725:1994 ou le protocole international harmonisé de l'UICPA) qui requiert l'utilisation des données valides d'au moins huit laboratoires. Par ailleurs, la seule différence par rapport aux validations monolaboratoires réside dans le fait que les ≥ 20 échantillons par produit/teneur peuvent être répartis également entre les laboratoires participants, chaque laboratoire recevant au minimum deux échantillons.
4. 3.2.4. Détermination de la valeur seuil et du taux de résultats faussement suspect des échantillons blancs
Les réponses (relatives) concernant les échantillons témoins négatifs et positifs servent de base de calcul des paramètres requis.
Méthodes de dépistage à réponse proportionnelle à la concentration de la mycotoxine
La formule suivante s'applique aux méthodes de dépistage à réponse proportionnelle à la concentration de la mycotoxine:
Valeur seuil = RSTC — valeur t0,05 *SDSTC
RSTC =réponse moyenne des échantillons témoins positifs (à la STC)
valeur t:valeur t unicaudale pour un taux de résultats faussement négatifs de 5 % (voir tableau B ci-après)
SDSTC =écart-type
Méthodes de dépistage à réponse inversement proportionnelle à la concentration de la mycotoxine
Par analogie, pour les méthodes de dépistage à réponse inversement proportionnelle à la concentration de la mycotoxine, la valeur seuil est déterminée comme suit:
Valeur seuil = RSTC + valeur t0,05 *SDSTC
Si l'on utilise cette valeur t spécifique pour déterminer la valeur seuil, le taux de résultats faussement négatifs est fixé par défaut à 5 %.
Évaluation de l'adaptation à l'usage
Les résultats relatifs aux échantillons témoins négatifs servent à estimer le taux correspondant de résultats faussement suspects. La valeur t calculée correspond au cas où le résultat d'un échantillon témoin négatif est supérieur à la valeur seuil et donc erronément considéré comme suspect.
Valeur t(valeur seuil — moyenneblanc)/SDblanc
dans les méthodes de dépistage à réponse proportionnelle à la concentration de la mycotoxine
ou
valeur t(moyenneblanc — valeur seuil)/SDblanc
dans les méthodes de dépistage à réponse inversement proportionnelle à la concentration de la mycotoxine
À partir de la valeur t obtenue sur la base des degrés de liberté calculés à partir du nombre d'expériences, la probabilité d'échantillons faussement suspects dans une distribution unicaudale peut être calculée (fonction TDIST de la feuille de calcul, par exemple) ou trouvée dans un tableau relatif à la distribution de t.
La valeur correspondante de la distribution unicaudale de t indique le taux de résultats faussement suspects.
Ce concept est décrit en détail, exemple à l'appui, dans Analytical and Bioanalytical Chemistry DOI 10.1007/s00216 -013-6922-1.
4. 3.2.5. Extension du champ d'application de la méthode
4. 3.2.5.1. Extension du champ d'application à d'autres mycotoxines
Lorsque le champ d'application d'une méthode de dépistage existante est étendu à d'autres mycotoxines, la validité de la méthode doit être démontrée au moyen d'une validation complète.
4. 3.2.5.2. Extension du champ d'application à d'autres produits
S'il est avéré ou probable que la méthode de dépistage est applicable à d'autres produits, sa validité doit être vérifiée pour ces autres produits. Si le nouveau produit appartient à un groupe de produits (voir tableau A ci-après) pour lequel la méthode a déjà fait l'objet d'une validation initiale, la réalisation d'une validation supplémentaire limitée est suffisante. À cet effet, un minimum de 10 échantillons témoins négatifs homogènes et de 10 échantillons témoins positifs homogènes (à la STC) doivent être analysés dans des conditions de fidélité intermédiaire. Les échantillons témoins positifs doivent tous présenter des valeurs dépassant la valeur seuil. Si ce critère n'est pas rempli, une validation complète est requise.
4. 3.2.6. Vérification de méthodes déjà validées au moyen d'études collaboratives
La performance des méthodes de dépistage déjà validées au moyen d'une étude collaborative doit être vérifiée. À cet effet, un minimum de 6 échantillons témoins négatifs et de 6 échantillons témoins positifs (à la STC) doivent être analysés. Les échantillons témoins positifs doivent tous présenter des valeurs dépassant la valeur seuil. Si ce critère n'est pas rempli, le laboratoire doit réaliser une analyse des causes profondes de cette situation afin de déceler pourquoi il ne peut pas répéter le résultat obtenu lors de l'étude collaborative. Après avoir pris les mesures correctrices nécessaires, le laboratoire doit revérifier la performance de la méthode en interne. Si le laboratoire n'est pas capable de vérifier les résultats de l'étude collaborative, il doit établir sa propre valeur seuil dans le cadre d'une validation monolaboratoire complète.
4. 3.2.7. Vérification/validation continue de la méthode
Après validation initiale de la méthode, le laboratoire collecte des données de validation supplémentaires en joignant au moins deux échantillons témoins positifs à chaque lot d'échantillons soumis à un dépistage. L'un des échantillons témoins positifs est un échantillon connu (un échantillon utilisé, par exemple, lors de la validation initiale) et l'autre provient d'un produit différent appartenant au même groupe de produits (si l'analyse porte sur un seul produit, l'échantillon consiste en un autre échantillon de ce produit). Un échantillon témoin négatif peut également être joint. Les résultats obtenus pour les deux échantillons témoins positifs sont ajoutés aux données de validation existantes.
La valeur seuil est reprécisée et la validité de la méthode est réexaminée au moins une fois par an. La vérification continue de la méthode vise plusieurs objectifs:
— assurer le contrôle qualité du lot d'échantillons soumis à un dépistage,
— fournir des informations sur la robustesse de la méthode dans les conditions prévalant dans le laboratoire appliquant la méthode,
— démontrer l'applicabilité de la méthode aux différents produits,
— permettre une adaptation des valeurs seuils en cas de dérive graduelle au fil du temps.
4. 3.2.8. Rapport de validation
Le rapport de validation doit comporter:
— une partie consacrée à la STC,
— une partie consacrée à la valeur seuil atteinte,
Note: La valeur seuil doit comporter le même nombre de chiffres significatifs que la STC. Les valeurs numériques servant à calculer la valeur seuil doivent avoir au moins un chiffre significatif de plus que la STC.
— une partie consacrée au taux calculé d'échantillons faussement suspects,
— une partie portant sur la manière dont le taux d'échantillons faussement suspects a été établi.
Note: La partie du rapport consacrée au taux calculé d'échantillons faussement suspects mentionne si la méthode est adaptée à l'usage prévu alors qu'elle précise le nombre d'échantillons blancs (ou présentant un faible niveau de contamination) qui seront soumis à une vérification.
Tableau A
Groupes de produits entrant en considération pour la validation des méthodes de dépistage
| Groupes de produits | Catégories de produits | Produits représentatifs de la catégorie
| Forte teneur en eau | Jus de fruit | Jus de pomme, jus de raisin
| Boissons alcoolisées | Vin, bière, cidre
| Légumes-racines et légumes-tubercules | Gingembre frais
| Purées à base de céréales ou de fruits | Purées destinées aux nourrissons et aux enfants en bas âge
| Forte teneur en huile | Fruits à coque | Noix communes, noisettes, châtaignes
| Graines oléagineuses et produits dérivés | Graines de colza, graines de tournesol, graines de coton, fèves de soja, arachides, graines de sésame, etc.
| Fruits oléagineux et produits dérivés | Huiles et pâtes (beurre d'arachide et tahini, par exemple)
| Forte teneur en fécule et/ou protéines et faible teneur en eau et en matières grasses | Céréales et produits dérivés | Froment (blé), seigle, orge, maïs, riz, avoine Pain complet, pain blanc, crackers, céréales pour petit déjeuner, pâtes
| Produits diététiques | Poudres sèches destinées à la préparation d'aliments pour nourrissons et enfants en bas âge
| Forte teneur en acide et forte teneur en eau | Agrumes |
| «Produits difficiles ou uniques» | |
Fèves de cacao et produits dérivés, copra et produits dérivés,
café, thé
Épices, réglisse
| Forte teneur en sucre et faible teneur en eau | Fruits séchés | Figues, raisins, groseilles, sultanines
| Lait et produits laitiers | Lait | Lait de vache, de chèvre et de bufflonne
| Fromage | Fromage de vache et de chèvre
| Produits laitiers (lait en poudre, par exemple) | Yaourt, crème
Tableau B
Valeur t unicaudale pour un taux d'échantillons faussement négatifs de 5 %
| Degrés de liberté | Nombre d'identiques | Valeur t (5 %)
| 10 | 11 | 1,812
| 11 | 12 | 1,796
| 12 | 13 | 1,782
| 13 | 14 | 1,771
| 14 | 15 | 1,761
| 15 | 16 | 1,753
| 16 | 17 | 1,746
| 17 | 18 | 1,74
| 18 | 19 | 1,734
| 19 | 20 | 1,729
| 20 | 21 | 1,725
| 21 | 22 | 1,721
| 22 | 23 | 1,717
| 23 | 24 | 1,714
| 24 | 25 | 1,711
| 25 | 26 | 1,708
| 26 | 27 | 1,706
| 27 | 28 | 1,703
| 28 | 29 | 1,701
| 29 | 30 | 1,699
| 30 | 31 | 1,697
| 40 | 41 | 1,684
| 60 | 61 | 1,671
| 120 | 121 | 1,658
| ∞ | ∞ | 1,645
4. 3.3. Exigences pour les méthodes de dépistage qualitatives (méthodes ne donnant pas de valeurs numériques)
Plusieurs organismes de normalisation (tels que l'AOAC et l'ISO) s'occupent actuellement de l'élaboration de lignes directrices pour la validation de méthodes d'essai binaires. Très récemment, l'AOAC a rédigé une ligne directrice concernant cette question. Ce document peut être considéré comme celui qui contient les orientations les plus modernes dans le domaine. Par conséquent, les méthodes donnant des résultats binaires (le contrôle visuel de bandelettes réactives, par exemple) devraient être validées conformément à cette ligne directrice.
http://www.aoac.org/imis15_prod/AOAC_Docs/ISPAM/Qual_Chem_Guideline_Final_Approved_031412.pdf
4. 4. Estimation de l'incertitude de mesure, calcul du taux de récupération et enregistrement des résultats
4. 4.1. Méthodes de confirmation
Le résultat de l'analyse doit être enregistré comme suit:
a) corrigé au titre de la récupération, le taux de récupération étant indiqué. La correction de la récupération n'est pas nécessaire lorsque le taux de récupération est compris entre 90 et 110 %;
b) sous la forme «x +/–U», où x est le résultat de l'analyse et U l'incertitude de mesure élargie, calculée à l'aide d'un coefficient de couverture 2 qui donne un niveau de confiance d'environ 95 %.
Pour les denrées alimentaires d'origine animale, il est aussi possible de prendre en compte l'incertitude de mesure en établissant la limite de décision (CCα), conformément à la décision 2002/657/CE de la Commission (point 3.1.2.5 de l'annexe I — cas de substances pour lesquelles une limite autorisée est fixée).
Néanmoins, si le résultat de l'analyse est nettement (> 50 %) inférieur à la teneur maximale ou beaucoup plus élevé que la teneur maximale (à savoir plus de cinq fois supérieur à la teneur maximale), et à condition que les procédures appropriées en matière de qualité aient été suivies et que l'analyse vise uniquement à contrôler si les dispositions légales sont respectées, ce résultat peut être mentionné sans correction de la récupération, et la mention du taux de récupération et de l'incertitude de mesure peut être omise dans ce cas.
Les présentes règles d'interprétation du résultat d'analyse en vue de l'acceptation ou du rejet du lot s'appliquent au résultat de l'analyse de l'échantillon destiné au contrôle officiel. En cas d'analyse à des fins de défense ou d'arbitrage, les règles nationales s'appliquent.
4. 4.2. Méthodes de dépistage
Le résultat du dépistage est déclaré «conforme» ou «suspecté d'être non conforme».
Est «suspecté d'être non conforme» l'échantillon qui dépasse la valeur seuil et dont la teneur en mycotoxine peut être supérieure à la STC. Tout échantillon suspect est soumis à une analyse de confirmation qui doit permettre d'identifier et de quantifier avec précision la mycotoxine.
Est «conforme» l'échantillon dont la teneur en mycotoxine est inférieure à la STC avec une certitude de 95 % (ce niveau de certitude signifie qu'il y a 5 % de risque que l'échantillon ait été déclaré erronément négatif). Le résultat de l'analyse est enregistré comme étant «inférieur à la concentration cible du dépistage (< STC)» et le niveau de la STC est indiqué.
4. 5. Normes de qualité applicables aux laboratoires
Le laboratoire doit respecter les dispositions de l’article 12 du règlement (CE) no 882/2004 relatif aux contrôles officiels effectués pour s'assurer de la conformité avec la législation sur les aliments pour animaux et les denrées alimentaires et avec les dispositions relatives à la santé animale et au bien-être des animaux.