Article annexe IV

A. DOSAGE DE LA VITAMINE A

La vitamine A doit être dosée:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17547 «Aliments des animaux — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Détermination de la teneur en vitamines A, E et D — Méthode utilisant la purification par extraction en phase solide (SPE) et la chromatographie liquide à haute performance (CLHP)» ou

— par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (CLHP-PI) à l’aide d’un détecteur UV ou fluorimétrique, conformément aux points 1 à 9.

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en vitamine A (rétinol) des aliments pour animaux. La vitamine À comprend le rétinol-all-trans et ses isomères-cis, qui sont déterminés par cette méthode. La teneur en vitamine A est exprimée en unités internationales (UI) par kg. Une UI correspond à l’activité de 0,300 μg de vitamine A alcool-all-trans ou à 0,344 μg de vitamine A acétate all-trans ou de 0,550 μg de vitamine A palmitate all-trans.

La limite de quantification est de 2 000 UI de vitamine A/kg.

2. Principe

L’échantillon est hydrolysé avec une solution d’hydroxyde de potassium éthanolique, et la vitamine A est extraite dans de l’éther de pétrole. Le solvant est enlevé par évaporation; le résidu est dissous dans du méthanol et, si nécessaire, dilué à la concentration requise. La teneur en vitamine A est déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (CLHP-PI) à l’aide d’un détecteur UV ou fluorimétrique. Les paramètres de la chromatographie sont choisis de telle sorte qu’il n’y ait pas de séparation entre la vitamine A alcool-all-trans et ses isomères-cis.

3. Réactifs

3. 1. Éthanol, σ = 96 %.

3. 2. Éther de pétrole, intervalle d’ébullition 40 °C-60 °C.

3. 3. Méthanol.

3. 4. Solution d’hydroxyde de potassium, c = 50 g/100 ml.

3. 5. Solution d’ascorbate de sodium, c = 10 g/100 ml (voir l’observation figurant au point 7.7).

3. 6. Sulfure de sodium, Na2S · x H2O (x = 7-9).

3. 6.1. Solution de sulfure de sodium, c = 0,5 mol/l dans du glycérol, β = 120 g/l (pour x = 9) (voir l’observation figurant au point 7.8).

3. 7. Solution de phénolphtaléine, c = 2 g/100 ml dans de l’éthanol (point 3.1).

3. 8. Propanol-2.

3. 9. Phase mobile pour CLHP: mélange de méthanol (point 3.3) et d’eau, par exemple 980 + 20 (v + v). Les proportions exactes sont déterminées par les caractéristiques de la colonne employée.

3. 10. Azote, libre d’oxygène.

3. 11. Vitamine A acétate all-trans, extra-pure, d’activité garantie, par exemple: 2,80 × 106 UI/g.

3. 11.1. Solution mère de vitamine A acétate all-trans: peser, à 0,1 mg près, 50 mg de vitamine A acétate (point 3.11) dans une fiole jaugée de 100 ml. Dissoudre dans du propanol-2 (point 3.8) et ajuster au trait de jauge avec le même solvant. La concentration nominale de cette solution est de 1 400 UI de vitamine A par ml. La teneur exacte doit être déterminée selon le point 5.6.3.1.

3. 12. Vitamine A palmitate all-trans, extra-pure, d’activité garantie, par exemple: 1,80 × 106 UI/g.

3. 12.1. Solution mère de vitamine A palmitate all-trans: peser, à 0,1 mg près, 80 mg de vitamine A palmitate (point 3.12) dans une fiole jaugée de 100 ml. Dissoudre dans du propanol-2 (point 3.8) et ajuster au trait de jauge avec le même solvant. La concentration nominale de cette solution est de 1 400 UI de vitamine A par ml. La teneur exacte doit être déterminée selon le point 5.6.3.2.

3. 13. BHT (di-tert-butyl–2,6-méthyl-4-phénol) (voir l’observation figurant au point 7.5).

4. Appareillage

4. 1. Évaporateur rotatif sous vide.

4. 2. Verrerie ambrée.

4. 2.1. Ballons à fond plat ou coniques, 500 ml, avec col en verre rodé.

4. 2.2. Fioles jaugées à bouchon en verre rodé, col étroit, de 10, 25, 100 et 500 ml.

4. 2.3. Ampoules à décanter coniques, 1 000 ml, à bouchon en verre rodé.

4. 2.4. Ballons piriformes, 250 ml, avec col en verre rodé.

4. 3. Réfrigérant d’Allihn, 300 mm de longueur utile, avec joint en verre rodé et adaptateur pour tuyau d’alimentation en gaz.

4. 4. Papier filtre plissé pour la séparation des phases, d’un diamètre de 185 mm (par exemple: Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).

4. 5. Équipement CLHP avec système à injection.

4. 5.1. Colonne de chromatographie liquide de 250 mm × 4 mm, C18, particules de 5 ou 10 μm, ou équivalent (critère de performance: un seul pic pour tous les isomères de rétinol dans les conditions CLHP).

4. 5.2. Détecteur UV ou fluorimétrique, de longueur d’onde variable.

4. 6. Spectrophotomètre avec cellules de quartz de 10 mm.

4. 7. Bain-marie avec agitateur magnétique.

4. 8. Appareil d’extraction (voir le graphique 1) se composant:

4. 8.1. d’une éprouvette d’une capacité de 1 litre, à col et à bouchon en verre rodé;

4. 8.2. d’une pièce à rodage mâle munie d’une tige latérale et d’un tube réglable passant en son centre. Ce tube doit avoir une partie inférieure en U et un bec gicleur à son extrémité opposée, de telle sorte que la couche liquide supérieure dans l’éprouvette puisse être transférée dans une ampoule à décanter.

5. Mode opératoire

NB: La vitamine A est sensible à la lumière (UV) et à l’oxydation. Toutes les opérations doivent être réalisées en l’absence de lumière (dans du verre ambré ou protégé d’une feuille d’aluminium) et en l’absence d’oxygène (éliminé avec de l’azote). Pendant l’extraction, l’air au-dessus du liquide doit être remplacé par de l’azote (éviter l’excès de pression en desserrant le bouchon de temps en temps).

5. 1. Préparation de l’échantillon

Moudre l’échantillon pour qu’il passe par un tamis à mailles de 1 mm, en évitant la production de chaleur. Le broyage doit avoir lieu immédiatement avant la pesée et la saponification, sinon il peut y avoir des pertes en vitamine A. Ne pas broyer le ou les échantillons si la taille des particules est adéquate (par exemple, dans les prémélanges et les additifs pour l’alimentation animale).

5. 2. Saponification

Selon la teneur en poids de la vitamine A, peser, à 1 mg près, de 2 à 25 g de l’échantillon dans un ballon à fond plat ou conique de 500 ml (point 4.2.1). Par faible concentration, le poids de l’échantillon peut être augmenté pour qu’il y ait assez de particules dans la prise d’essai. Ajouter successivement, tout en remuant, 130 ml d’éthanol (point 3.1), environ 100 mg de BHT (point 3.13), 2 ml de solution d’ascorbate de sodium (point 3.5) et 2 ml de solution de sulfure de sodium (point 3.6). Adapter un réfrigérant (point 4.3) au ballon et immerger celui-ci dans un bain-marie avec agitateur magnétique (point 4.7). Chauffer jusqu’à ébullition et laisser refluer pendant 5 minutes. Ajouter alors 25 ml de solution d’hydroxyde de potassium (point 3.4) par le réfrigérant (point 4.3) et laisser refluer de nouveau pendant 25 min, tout en agitant sous un faible courant d’azote. Rincer alors le réfrigérant avec environ 20 ml d’eau et laisser refroidir le contenu du ballon à la température ambiante.

5. 3. Extraction

Transférer quantitativement par décantation la solution de saponification en rinçant avec un volume total de 250 ml d’eau dans une ampoule à décanter de 1 000 ml (point 4.2.3) ou dans l’appareil d’extraction (point 4.8). Rincer successivement le ballon de saponification avec 25 ml d’éthanol (point 3.1) et 100 ml d’éther de pétrole (point 3.2) et transférer le liquide de rinçage dans l’ampoule à décanter ou dans l’appareil d’extraction. La proportion d’eau et d’éthanol dans les solutions combinées doit être d’environ 2:1. Secouer énergiquement pendant 2 minutes et laisser reposer pendant 2 minutes.

5. 3.1. Extraction à l’aide d’une ampoule à décanter (point 4.2.3)

Lorsque les couches sont séparées (voir l’observation figurant au point 7.3), transférer la couche d’éther de pétrole dans une autre ampoule à décanter (point 4.2.3). Répéter deux fois l’opération avec 100 ml d’éther de pétrole (point 3.2), puis deux fois avec 50 ml d’éther de pétrole (point 3.2).

Laver deux fois les extraits combinés dans l’ampoule à décanter en remuant doucement (afin d’éviter la formation d’émulsions) avec des portions de 100 ml d’eau et de nouveau en secouant avec d’autres portions de 100 ml d’eau jusqu’à ce que l’eau demeure incolore après addition de solution de phénolphtaléine (point 3.7) (quatre lavages sont généralement suffisants). Filtrer l’extrait lavé sur un filtre plissé sec pour la séparation des phases (point 4.4) afin d’éliminer l’eau résiduelle et transférer dans une fiole jaugée de 500 ml (point 4.2.2). Rincer l’ampoule à décanter et le filtre avec 50 ml d’éther de pétrole (point 3.2), ajuster au trait de jauge avec de l’éther de pétrole (point 3.2) et bien mélanger.

5. 3.2. Extraction à l’aide d’un appareil d’extraction (point 4.8)

Lorsque les couches sont séparées (voir l’observation figurant au point 7.3), remettre le bouchon de l’éprouvette (point 4.8.1) sur la pièce à rodage mâle (point 4.8.2) et placer l’extrémité inférieure en forme de U du tube réglable de telle sorte qu’elle se trouve juste au-dessus du niveau de l’interface. En exerçant une pression d’azote par la tige latérale, transférer la couche supérieure d’éther de pétrole dans une ampoule à décanter de 1 000 ml (point 4.2.3). Ajouter 100 ml d’éther de pétrole (point 3.2) dans le cylindre en verre, boucher et bien secouer. Laisser les couches se séparer et transférer la couche supérieure dans l’ampoule à décanter comme précédemment. Répéter la procédure d’extraction avec de nouveau 100 ml d’éther de pétrole (point 3.2), puis deux fois avec 50 ml d’éther de pétrole (point 3.2) et ajouter les couches d’éther de pétrole dans l’ampoule à décanter.

Laver les extraits combinés d’éther de pétrole selon la procédure décrite au point 5.3.1 et procéder selon ce point.

5. 4. Préparation de la solution d’échantillon pour CLHP

Introduire à la pipette une portion aliquote de la solution d’éther de pétrole (issue du point 5.3.1 ou 5.3.2) dans un ballon piriforme de 250 ml (point 4.2.4). Laisser évaporer le solvant presque entièrement dans l’évaporateur rotatif (point 4.1) sous une pression réduite, à une température de bain ne dépassant pas 40 °C. Restaurer la pression atmosphérique en laissant entrer l’azote (point 3.10) et enlever le ballon de l’évaporateur rotatif. Supprimer le reste du solvant dans un courant d’azote (point 3.10) et dissoudre immédiatement le résidu dans un volume connu (10-100 ml) de méthanol (point 3.3) (la concentration de vitamine A doit être de l’ordre de 5 UI/ml à 30 UI/ml).

5. 5. Dosage par CLHP

La vitamine A est séparée sur une colonne C18 à phase inverse (point 4.5.1), et la concentration est mesurée à l’aide d’un détecteur UV (325 nm) ou d’un détecteur fluorimétrique (excitation: 325 nm, émission: 475 nm) (point 4.5.2).

Injecter une portion aliquote (par exemple: 20 μl) de la solution méthanolique obtenue au point 5.4 et éluer avec la phase mobile (point 3.9). Calculer la hauteur (surface) moyenne du pic de plusieurs injections de la même solution d’échantillon et les hauteurs (surfaces) moyennes des pics de plusieurs injections des solutions d’étalonnage (point 5.6.2).

Conditions CLHP

Les conditions suivantes sont proposées à titre indicatif; d’autres conditions peuvent être appliquées, pourvu qu’elles donnent des résultats équivalents.

| Colonne de chromatographie liquide (point 4.5.1): | 250 mm × 4 mm, C18, particules de 5 ou de 10 μm, ou équivalent

| Phase mobile (point 3.9): | mélange de méthanol (point 3.3) et d’eau, par exemple 980 + 20 (v+v)

| Débit: | 1-2 ml/min

| Détecteur (point 4.5.2): | détecteur UV (325 nm) ou détecteur fluorimétrique (excitation: 325 nm/émission: 475 nm)

5. 6. Étalonnage

5. 6.1. Préparation des solutions-étalons de travail

Introduire à la pipette 20 ml de la solution mère de vitamine A acétate (point 3.11.1) ou 20 ml de la solution mère de vitamine A palmitate (point 3.12.1) dans un ballon à fond plat ou conique de 500 ml (point 4.2.1) et hydrolyser comme décrit au point 5.2, mais sans ajouter de BHT. Procéder ensuite à l’extraction avec de l’éther de pétrole (point 3.2) conformément au point 5.3 et ajuster à 500 ml avec de l’éther de pétrole (point 3.2). Laisser évaporer 100 ml de cet extrait presque entièrement sur l’évaporateur rotatif (voir le point 5.4), enlever le solvant résiduel dans un courant d’azote (point 3.10) et redissoudre le résidu dans 10,0 ml de méthanol (point 3.3). La concentration nominale de cette solution est de 560 UI de vitamine A par ml. La teneur exacte doit être déterminée conformément au point 5.6.3.3. La solution étalon de travail doit être préparée peu avant d’être utilisée.

Introduire à la pipette 2,0 ml de cette solution étalon de travail dans une fiole jaugée de 20 ml, ajuster au trait de jauge avec du méthanol (point 3.3) et mélanger. La concentration nominale de cette solution étalon de travail diluée est de 56 UI de vitamine A par ml.

5. 6.2. Préparation des solutions d’étalonnage et de la courbe d’étalonnage

Transférer 1,0, 2,0, 5,0 et 10,0 ml de la solution étalon de travail diluée dans une série de fioles jaugées de 20 ml, ajuster au trait de jauge avec du méthanol (point 3.3) et mélanger. Les concentrations nominales de ces solutions sont de 2,8, 5,6, 14,0 et 28,0 UI de vitamine A par ml.

Injecter plusieurs fois 20 μl de chaque solution d’étalonnage et déterminer les hauteurs (surfaces) moyennes des pics. D’après les hauteurs (surfaces) moyennes des pics, tracer une courbe d’étalonnage tenant compte des résultats du contrôle UV (point 5.6.3.3).

5. 6.3. Calibration par UV des solutions étalons

5. 6.3.1. Solution mère de vitamine A acétate

Introduire à la pipette 2,0 ml de la solution mère de vitamine A acétate (point 3.11.1) dans une fiole jaugée de 50 ml (point 4.2.2) et ajuster au trait de jauge avec du propanol-2 (point 3.8). La concentration nominale de cette solution est de 56 UI de vitamine A par ml. Introduire à la pipette 3,0 ml de cette solution de vitamine A acétate diluée dans une fiole jaugée de 25 ml et ajuster au trait de jauge avec du propanol-2 (point 3.8). La concentration nominale de cette solution est de 6,72 UI de vitamine A par ml. Mesurer le spectre UV de cette solution contre du propanol-2 (point 3.8) dans le spectrophotomètre (point 4.6) entre 300 nm et 400 nm. L’extinction maximale doit se situer entre 325 nm et 327 nm.

Calcul de la teneur en vitamine A:

UI de vitamine AmlE326 ×19,0

E1 cm1 %de la vitamine A acétate1 530 à 326 nm dans du propanol – 2

5. 6.3.2. Solution mère de vitamine A palmitate

Introduire à la pipette 2,0 ml de la solution mère de vitamine A palmitate (point 3.12.1) dans une fiole jaugée de 50 ml (point 4.2.2) et ajuster au trait de jauge avec du propanol-2 (point 3.8). La concentration nominale de cette solution est de 56 UI de vitamine A par ml. Introduire à la pipette 3,0 ml de cette solution de vitamine A de palmitate diluée dans une fiole jaugée de 25 ml et ajuster au trait de jauge avec du propanol-2 (point 3.8). La concentration nominale de cette solution est de 6,72 UI de vitamine A par ml. Mesurer le spectre UV de cette solution contre du propanol-2 (point 3.8) dans le spectrophotomètre (point 4.6) entre 300 nm et 400 nm. L’extinction maximale doit se situer entre 325 nm et 327 nm.

Calcul de la teneur en vitamine A:

UI de vitamine AmlE326 ×19,0

E1 cm1 %de la vitamine A palmitate957 à 326 nm dans du propanol – 2

5. 6.3.3. Solution étalon de travail de vitamine A

Introduire à la pipette 3,0 ml de la solution étalon de travail de vitamine A non diluée, préparée conformément au point 5.6.1, dans une fiole jaugée de 50 ml (point 4.2.2) et ajuster au trait de jauge avec du propanol-2 (point 3.8). Introduire à la pipette 5,0 ml de cette solution dans une fiole jaugée de 25 ml et ajuster au trait de jauge avec du propanol-2 (point 3.8). La concentration nominale de cette solution est de 6,72 UI de vitamine A par ml. Mesurer le spectre UV de cette solution contre du propanol-2 (point 3.8) dans le spectrophotomètre (point 4.6) entre 300 nm et 400 nm. L’extinction maximale doit se situer entre 325 nm et 327 nm.

Calcul de la teneur en vitamine A:

UI de vitamine AmlE325 ×18,30

E1 cm1 %de la vitamine A alcool1 821 à 325 nm dans du propanol – 2

6. Calcul des résultats

À partir de la hauteur moyenne (surface) des pics de vitamine A de la solution d’échantillon, déterminer la concentration de vitamine A dans cette solution, en UI/ml, par référence à la courbe d’étalonnage (point 5.6.2).

La teneur w en vitamine A de l’échantillon, exprimée en UI/kg, est donnée par la formule suivante:

w500 × c × V2 × 1 000V1 × mUIkg

où:

cconcentration de vitamine A dans la solution d’échantillon (point 5.4) en UI/ml,

V1volume de la solution d’échantillon (point 5.4) en ml,

V2volume de la portion aliquote prélevée au point 5.4 en ml,

mpoids de la prise d’essai, en grammes.

7. Observations

7. 1. Pour les échantillons ayant une faible concentration de vitamine A, il peut être utile de rassembler les extraits dans l’éther de pétrole issus de deux saponifications (quantité pesée: 25 g) à une solution d’échantillon pour dosage par CLHP.

7. 2. L’échantillon prélevé pour l’analyse ne doit pas contenir plus de 2 g de matières grasses.

7. 3. S’il n’y a pas séparation des phases, ajouter environ 10 ml d’éthanol (point 3.1) pour briser l’émulsion.

7. 4. Avec de l’huile de foie de morue et d’autres matières grasses pures, le temps de saponification doit être porté à 45-60 minutes.

7. 5. Le BHT peut être remplacé par de l’hydroquinone.

7. 6. En utilisant une colonne en phase directe, il est possible de séparer les isomères de rétinol. Dans ce cas, les hauteurs (surfaces) de tous les pics des isomères cis et trans doivent toutefois être additionnés en vue du calcul des résultats.

7. 7. La solution d’ascorbate de sodium peut être remplacée par environ 150 mg d’acide ascorbique.

7. 8. La solution de sulfure de sodium peut être remplacée par environ 50 mg d’EDTA.

7. 9. En cas d’analyse de la vitamine A dans des aliments d’allaitement, une attention particulière doit être accordée:

— à la saponification (point 5.2): en raison de la quantité de graisse présente dans l’échantillon, il peut être nécessaire d’augmenter la quantité de solution d’hydroxyde de potassium (point 3.4),

— à l’extraction (point 5.3): en raison de la présence d’émulsions, il peut être nécessaire d’adapter le ratio (2:1) eau/éthanol.

Il convient, pour vérifier si la méthode d’analyse appliquée donne des résultats fiables sur cette matrice spécifique (aliments d’allaitement), d’effectuer un test de récupération sur une prise d’essai supplémentaire. Si le taux de récupération est inférieur à 80 %, le résultat de l’analyse doit être corrigé au titre de la récupération.

8. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser 15 % par rapport au résultat le plus élevé.

9. Résultats d’une étude collaborative

L: nombre de laboratoires

n: nombre de valeurs individuelles

sr: écart type de répétabilité

sR: écart type de reproductibilité

r: répétabilité

R: reproductibilité

CVr: coefficient de variation de la répétabilité

CVR: coefficient de variation de la reproductibilité

| | Prémélange | Aliment prémélangé | Concentré minéral | Concentré protéique | Aliment pour porcelets

| L | 13 | 12 | 13 | 12 | 13

| n | 48 | 45 | 47 | 46 | 49

| moyenne [UI/kg] | 17,02 × 106 | 1,21 × 106 | 537 100 | 151 800 | 18 070

| sr [UI/kg] | 0,51 × 106 | 0,039 × 106 | 22 080 | 12 280 | 682

| r [UI/kg] | 1,43 × 106 | 0,109 × 106 | 61 824 | 34 384 | 1 910

| CVr [%] | 3,0 | 3,5 | 4,1 | 8,1 | 3,8

| sR [UI/kg] | 1,36 × 106 | 0,069 × 106 | 46 300 | 23 060 | 3 614

| R [UI/kg] | 3,81 × 106 | 0,193 × 106 | 129 640 | 64 568 | 10 119

| CVR [%] | 8,0 | 6,2 | 8,6 | 15 | 20

Graphique 1

Appareil d’extraction (point 4.8)

B. DOSAGE DE LA VITAMINE E

La vitamine E doit être dosée:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17547 «Aliments des animaux — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Détermination de la teneur en vitamines A, E et D — Méthode utilisant la purification par extraction en phase solide (SPE) et la chromatographie liquide à haute performance (CLHP)» ou

— par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (CLHP-PI) à l’aide d’un détecteur UV ou fluorimétrique, conformément aux points 1 à 9.

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en vitamine E des aliments pour animaux. La teneur en vitamine E est exprimée en mg d’acétate de DL-α-tocophérol par kg. 1 mg d’acétate de DL-α-tocophérol correspond à 0,91 mg de DL-α-tocophérol (vitamine E).

La limite de quantification est de 2 mg de vitamine E/kg. Cette limite de quantification ne peut être atteinte qu’avec un détecteur fluorimétrique. La limite de quantification est fixée à 10 mg/kg en cas d’utilisation d’un détecteur UV.

2. Principe

L’échantillon est hydrolysé avec une solution d’hydroxyde de potassium éthanolique et la vitamine E est extraite dans de l’éther de pétrole. Le solvant est enlevé par évaporation; le résidu est dissous dans du méthanol et, si nécessaire, dilué à la concentration requise. La teneur en vitamine E est déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (CLHP-PI) à l’aide d’un détecteur UV ou fluorimétrique.

3. Réactifs

3. 1. Éthanol, σ = 96 %.

3. 2. Éther de pétrole, intervalle d’ébullition 40 °C-60 °C.

3. 3. Méthanol.

3. 4. Solution d’hydroxyde de potassium, c = 50 g/100 ml.

3. 5. Solution d’ascorbate de sodium, c = 10 g/100 ml (voir l’observation figurant au point 7.7).

3. 6. Sulfure de sodium, Na2S · x H2O (x = 7-9).

3. 6.1. Solution de sulfure de sodium, c = 0,5 mol/l dans du glycérol, β = 120 g/l (pour x = 9) (voir l’observation figurant au point 7.8).

3. 7. Solution de phénolphtaléine, c = 2 g/100 ml dans de l’éthanol (point 3.1).

3. 8. Phase mobile pour CLHP: mélange de méthanol (point 3.3) et d’eau, par exemple 980 + 20 (v + v). Les proportions exactes sont déterminées par les caractéristiques de la colonne employée.

3. 9. Azote, libre d’oxygène.

3. 10. Acétate de DL-α-tocophérol, extra-pur, d’activité garantie

3. 10.1. Solution mère d’acétate de DL-α-tocophérol: peser, à 0,1 mg près, 100 mg d’acétate de DL-α-tocophérol (point 3.10) dans une fiole jaugée de 100 ml. Dissoudre dans de l’éthanol (point 3.1) et ajuster au trait de jauge avec le même solvant. 1 ml de cette solution contient 1 mg d’acétate de DL-α-tocophérol (pour le contrôle UV: voir le point 5.6.1.3, pour la stabilisation: voir l’observation figurant au point 7.4).

3. 11. DL-α-tocophérol, extra-pur, d’activité garantie.

3. 11.1. Solution mère de DL-α-tocophérol: peser, à 0,1 mg près, 100 mg de DL-α-tocophérol (point 3.11) dans une fiole jaugée de 100 ml. Dissoudre dans de l’éthanol (point 3.1) et ajuster au trait de jauge avec le même solvant. 1 ml de cette solution contient 1 mg de DL-α-tocophérol (pour le contrôle UV: voir le point 5.6.2.3, pour la stabilisation: voir l’observation figurant au point 7.4).

3. 12. BHT (di-tert-butyl–2,6-méthyl-4-phénol) (voir l’observation figurant au point 7.5).

4. Appareillage

4. 1. Évaporateur rotatif.

4. 2. Verrerie ambrée.

4. 2.1. Ballons à fond plat ou coniques, 500 ml, avec col en verre rodé.

4. 2.2. Fioles jaugées à bouchon en verre rodé, col étroit, de 10, 25, 100 et 500 ml.

4. 2.3. Ampoules à décanter coniques, 1 000 ml, à bouchon en verre rodé.

4. 2.4. Ballons piriformes, 250 ml, avec col en verre rodé.

4. 3. Réfrigérant d’Allihn, 300 mm de longueur utile, avec joint en verre rodé et adaptateur pour tuyau d’alimentation en gaz.

4. 4. Papier filtre plissé pour la séparation des phases, d’un diamètre de 185 mm (par exemple: Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).

4. 5. Équipement CLHP avec système à injection.

4. 5.1. Colonne de chromatographie liquide de 250 mm × 4 mm, C18, particules de 5 ou 10 μm, ou équivalent.

4. 5.2. Détecteur UV ou fluorimétrique, de longueur d’onde variable.

4. 6. Spectrophotomètre avec cellules de quartz de 10 mm.

4. 7. Bain-marie avec agitateur magnétique.

4. 8. Appareil d’extraction (voir le graphique 2) se composant:

4. 8.1. d’une éprouvette d’une capacité de 1 litre, à col et à bouchon en verre rodé;

4. 8.2. d’une pièce à rodage mâle munie d’une tige latérale et d’un tube réglable passant en son centre. Ce tube doit avoir une partie inférieure en U et un bec gicleur à son extrémité opposée, de telle sorte que la couche liquide supérieure dans l’éprouvette puisse être transférée dans une ampoule à décanter.

5. Mode opératoire

NB: La vitamine E est sensible à la lumière (UV) et à l’oxydation. Toutes les opérations doivent être réalisées en l’absence de lumière (dans du verre ambré ou protégé d’une feuille d’aluminium) et en l’absence d’oxygène (éliminé avec de l’azote). Pendant l’extraction, l’air au-dessus du liquide doit être remplacé par de l’azote (éviter l’excès de pression en desserrant le bouchon de temps en temps).

5. 1. Préparation de l’échantillon

Moudre l’échantillon pour qu’il passe par un tamis à mailles de 1 mm, en évitant la production de chaleur. Le broyage doit avoir lieu immédiatement avant la pesée et la saponification, sinon il peut y avoir des pertes en vitamine E.

5. 2. Saponification

Selon la teneur en poids de la vitamine E, peser, à 0,01 g près, de 2 à 25 g de l’échantillon dans un ballon à fond plat ou conique de 500 ml (point 4.2.1). Ajouter successivement, tout en remuant, 130 ml d’éthanol (point 3.1), environ 100 mg de BHT (point 3.12), 2 ml de solution d’ascorbate de sodium (point 3.5) et 2 ml de solution de sulfure de sodium (point 3.6). Adapter le réfrigérant (point 4.3) au ballon et immerger celui-ci dans un bain-marie avec agitateur magnétique (point 4.7). Chauffer jusqu’à ébullition et laisser refluer pendant 5 minutes. Ajouter alors 25 ml de solution d’hydroxyde de potassium (point 3.4) par le réfrigérant (point 4.3) et laisser refluer de nouveau pendant 25 min, tout en agitant sous un faible courant d’azote. Rincer alors le réfrigérant avec environ 20 ml d’eau et laisser refroidir le contenu du ballon à la température ambiante.

5. 3. Extraction

Transférer quantitativement par décantation la solution de saponification en rinçant avec un volume total de 250 ml d’eau dans une ampoule à décanter de 1 000 ml (point 4.2.3) ou dans l’appareil d’extraction (point 4.8). Rincer successivement le ballon de saponification avec 25 ml d’éthanol (point 3.1) et 100 ml d’éther de pétrole (point 3.2) et transférer le liquide de rinçage dans l’ampoule à décanter ou dans l’appareil d’extraction. La proportion d’eau et d’éthanol dans les solutions combinées doit être d’environ 2:1. Secouer énergiquement pendant 2 minutes et laisser reposer pendant 2 minutes.

5. 3.1. Extraction à l’aide d’une ampoule à décanter (point 4.2.3)

Lorsque les couches sont séparées (voir l’observation figurant au point 7.3), transférer la couche d’éther de pétrole dans une autre ampoule à décanter (point 4.2.3). Répéter deux fois l’opération avec 100 ml d’éther de pétrole (point 3.2), puis deux fois avec 50 ml d’éther de pétrole (point 3.2).

Laver deux fois les extraits combinés dans l’ampoule à décanter en remuant doucement (afin d’éviter la formation d’émulsions) avec des portions de 100 ml d’eau et de nouveau en secouant avec d’autres portions de 100 ml d’eau jusqu’à ce que l’eau demeure incolore après addition de solution de phénolphtaléine (point 3.7) (quatre lavages sont généralement suffisants). Filtrer l’extrait lavé sur un filtre plissé sec pour la séparation des phases (point 4.4) afin d’éliminer l’eau résiduelle et transférer dans une fiole jaugée de 500 ml (point 4.2.2). Rincer l’ampoule à décanter et le filtre avec 50 ml d’éther de pétrole (point 3.2), ajuster au trait de jauge avec de l’éther de pétrole (point 3.2) et bien mélanger.

5. 3.2. Extraction à l’aide d’un appareil d’extraction (point 4.8)

Lorsque les couches sont séparées (voir l’observation figurant au point 7.3), remettre le bouchon de l’éprouvette (point 4.8.1) sur la pièce à rodage mâle (point 4.8.2) et placer l’extrémité inférieure en forme de U du tube réglable de telle sorte qu’elle se trouve juste au-dessus du niveau de l’interface. En exerçant une pression d’azote par la tige latérale, transférer la couche supérieure d’éther de pétrole dans une ampoule à décanter de 1 000 ml (point 4.2.3). Ajouter 100 ml d’éther de pétrole (point 3.2) dans le cylindre en verre, boucher et bien secouer. Laisser les couches se séparer et transférer la couche supérieure dans l’ampoule à décanter comme précédemment. Répéter la procédure d’extraction avec de nouveau 100 ml d’éther de pétrole (point 3.2), puis deux fois avec 50 ml d’éther de pétrole (point 3.2) et ajouter les couches d’éther de pétrole dans l’ampoule à décanter.

Laver les extraits combinés d’éther de pétrole selon la procédure décrite au point 5.3.1 et procéder selon ce point.

5. 4. Préparation de la solution d’échantillon pour CLHP

Introduire à la pipette une portion aliquote de la solution d’éther de pétrole (issue du point 5.3.1 ou de 5.3.2) dans un ballon piriforme de 250 ml (point 4.2.4). Laisser évaporer le solvant presque entièrement dans l’évaporateur rotatif (point 4.1) sous une pression réduite, à une température de bain ne dépassant pas 40 °C. Restaurer la pression atmosphérique en laissant entrer l’azote (point 3.9) et enlever le ballon de l’évaporateur rotatif. Supprimer le reste du solvant dans un courant d’azote (point 3.9) et dissoudre immédiatement le résidu dans un volume connu (10-100 ml) de méthanol (point 3.3) (la concentration de DL-α-tocophérol doit être de l’ordre de 5 μg/ml à 30 μg/ml).

5. 5. Dosage par CLHP

La vitamine E est séparée sur une colonne C18 à phase inverse (point 4.5.1) et la concentration est mesurée à l’aide d’un détecteur fluorimétrique (excitation: 295 nm, émission: 330 nm) ou d’un détecteur UV (292 nm) (point 4.5.2).

Injecter une portion aliquote (par exemple: 20 μl) de la solution méthanolique obtenue au point 5.4 et éluer avec la phase mobile (point 3.8). Calculer les hauteurs (surfaces) moyennes des pics de plusieurs injections de la même solution d’échantillon et les hauteurs (surfaces) moyennes des pics de plusieurs injections des solutions d’étalonnage (point 5.6.2).

Conditions CLHP

Les conditions suivantes sont proposées à titre indicatif; d’autres conditions peuvent être appliquées, pourvu qu’elles donnent des résultats équivalents.

| Colonne de chromatographie liquide (point 4.5.1): | 250 mm × 4 mm, C18, particules de 5 ou de 10 μm, ou équivalent

| Phase mobile (point 3.8): | mélange de méthanol (point 3.3) et d’eau, par exemple 980 + 20 (v + v).

| Débit: | 1-2 ml/min

| Détecteur (point 4.5.2): | détecteur fluorimétrique (excitation: 295 nm/ émission: 330 nm) ou détecteur UV (292 nm)

5. 6. Étalonnage (acétate de DL-α-tocophérol ou DL-α-tocophérol)

5. 6.1. Solution étalon d’acétate de DL-α-tocophérol

5. 6.1.1. Préparation de la solution étalon de travail

Introduire à la pipette 25 ml de la solution mère d’acétate de DL-α-tocophérol (point 3.10.1) dans un ballon à fond plat ou conique de 500 ml (point 4.2.1) et hydrolyser comme décrit au point 5.2. Procéder ensuite à l’extraction avec de l’éther de pétrole (point 3.2) conformément au point 5.3 et ajuster à 500 ml avec de l’éther de pétrole. Laisser évaporer 25 ml de cet extrait presque entièrement sur l’évaporateur rotatif (voir le point 5.4), enlever le solvant résiduel dans un courant d’azote (point 3.9) et redissoudre le résidu dans 25,0 ml de méthanol (point 3.3). La concentration nominale de cette solution est de 45,5 μg de DL-α-tocophérol par ml, équivalant à 50 μg d’acétate de DL-α-tocophérol par ml. La solution étalon de travail doit être préparée peu avant d’être utilisée.

5. 6.1.2. Préparation des solutions d’étalonnage et de la courbe d’étalonnage

Transférer 1,0, 2,0, 4,0 et 10,0 ml de la solution étalon de travail dans une série de fioles jaugées de 20 ml, ajuster au trait de jauge avec du méthanol (point 3.3) et mélanger. Les concentrations nominales de ces solutions sont de 2,5, 5,0, 10,0 et 25,0 μg/ml d’acétate de DL-α-tocophérol, soit 2,28, 4,55, 9,10 et 22,8 μg/ml de DL-α-tocophérol.

Injecter plusieurs fois 20 μl de chaque solution d’étalonnage et déterminer les hauteurs (surfaces) moyennes des pics. D’après les hauteurs (surfaces) moyennes des pics, tracer une courbe d’étalonnage.

5. 6.1.3. Calibration par UV de la solution mère d’acétate de DL-α-tocophérol (point 3.10.1)

Diluer 5,0 ml de la solution mère d’acétate de DL-α-tocophérol (point 3.10.1), ajuster à 25,0 ml dans de l’éthanol et mesurer le spectre UV de cette solution contre de l’éthanol (point 3.1) dans le spectrophotomètre (point 4.6) entre 250 nm et 320 nm.

L’absorption maximale doit être de 284 nm:

E1 cm1 %43,6à 284 nm dans de l’éthanol.

À cette dilution, une valeur d’extinction de 0,84 à 0,88 doit être obtenue.

5. 6.2. Solution étalon de DL-α-tocophérol

5. 6.2.1. Préparation de la solution étalon de travail

Introduire à la pipette 2 ml de la solution étalon de DL-α-tocophérol (point 3.11.1) dans une fiole jaugée de 50 ml, dissoudre dans du méthanol (point 3.3) et ajuster au trait de jauge avec du méthanol. La concentration nominale de cette solution est de 40 μg de DL-α-tocophérol par ml, équivalant à 44,0 μg d’acétate de DL-α-tocophérol par ml. La solution étalon de travail doit être préparée peu avant d’être utilisée.

5. 6.2.2. Préparation des solutions d’étalonnage et de la courbe d’étalonnage

Transférer 1,0, 2,0, 4,0 et 10,0 ml de la solution étalon de travail dans une série de fioles jaugées de 20 ml, ajuster au trait de jauge avec du méthanol (point 3.3) et mélanger. Les concentrations nominales de ces solutions sont de 2,0, 4,0, 8,0 et 20,0 μg/ml de DL-α-tocophérol, soit 2,20, 4,40, 8,79 et 22,0 μg/ml d’acétate de DL-α-tocophérol.

Injecter plusieurs fois 20 μl de chaque solution d’étalonnage et déterminer les hauteurs (surfaces) moyennes des pics. D’après les hauteurs (surfaces) moyennes des pics, tracer une courbe d’étalonnage.

5. 6.2.3. Calibration par UV de la solution mère de DL-α-tocophérol (point 3.11.1)

Diluer 2,0 ml de la solution mère de DL-α-tocophérol (point 3.11.1), ajuster à 25,0 ml dans de l’éthanol et mesurer le spectre UV de cette solution contre de l’éthanol (point 3.1) dans le spectrophotomètre (point 4.6) entre 250 nm et 320 nm. L’absorption maximale doit être de 292 nm:

E1 cm1 %75,8à 292 nm dans de l’éthanol.

À cette dilution, une valeur d’extinction de 0,6 doit être obtenue.

6. Calcul des résultats

À partir de la hauteur moyenne (surface) des pics de vitamine E de la solution d’échantillon, déterminer la concentration de vitamine E dans cette solution, en μg/ml, (exprimée en acétate de DL-α-tocophérol) par référence à la courbe d’étalonnage (point 5.6.1.2 ou 5.6.2.2).

La teneur w en vitamine E de l’échantillon, exprimée en mg/kg, est donnée par la formule suivante:

w500 × c × V2V1 × mmgkg

où:

cconcentration de vitamine E (calculée en acétate de DL-α-tocophérol) dans la solution d’échantillon (point 5.4) en μg/ml,

V1volume de la solution d’échantillon (point 5.4) en ml,

V2volume de la portion aliquote prélevée au point 5.4 en ml,

mpoids de la prise d’essai, en grammes.

7. Observations

7. 1. Pour les échantillons ayant une faible concentration de vitamine E, il peut être utile de rassembler les extraits dans l’éther de pétrole issus de deux saponifications (quantité pesée: 25 g) à une solution d’échantillon pour dosage par CLHP.

7. 2. L’échantillon prélevé pour l’analyse ne doit pas contenir plus de 2 g de matières grasses.

7. 3. S’il n’y a pas séparation des phases, ajouter environ 10 ml d’éthanol (point 3.1) pour briser l’émulsion.

7. 4. Une fois la mesure spectrophotométrique de la solution d’acétate de DL-α-tocophérol ou de DL-α-tocophérol effectuée, respectivement selon le point 5.6.1.3 ou 5.6.2.3, ajouter environ 10 mg de BHT (point 3.12) à la solution (point 3.10.1 ou 3.10.2) et conserver cette solution au réfrigérateur (durée maximale de conservation: quatre semaines).

7. 5. Le BHT peut être remplacé par de l’hydroquinone.

7. 6. Il est possible d’utiliser une colonne en phase directe pour séparer les tocophérols α, β, γ et δ.

7. 7. La solution d’ascorbate de sodium peut être remplacée par environ 150 mg d’acide ascorbique.

7. 8. La solution de sulfure de sodium peut être remplacée par environ 50 mg d’EDTA.

7. 9. La vitamine E acétate s’hydrolyse très rapidement en milieu alcalin et est dès lors très sensible à l’oxydation, particulièrement en présence d’oligoéléments tels que le fer et le cuivre. Le dosage de la vitamine E dans des prémélanges présentant des teneurs supérieures à 5 000 mg/kg pourrait entraîner une dégradation de la vitamine E. C’est pourquoi il est recommandé d’utiliser, aux fins de la confirmation, une méthode de dosage CLHP comprenant une digestion enzymatique de la vitamine E sans saponification alcaline.

8. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser 15 % par rapport au résultat le plus élevé.

9. Résultats d’une étude collaborative

L: nombre de laboratoires

n: nombre de valeurs individuelles

sr: écart type de répétabilité

sR: écart type de reproductibilité

r: répétabilité

R: reproductibilité

CVr: coefficient de variation de la répétabilité

CVR: coefficient de variation de la reproductibilité

| | Prémélange | Aliment prémélangé | Concentré minéral | Concentré protéique | Aliment pour porcelets

| L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12

| n | 48 | 48 | 48 | 48 | 48

| Moyenne [mg/kg] | 17 380 | 1 187 | 926 | 315 | 61,3

| sr [mg/kg] | 384 | 45,3 | 25,2 | 13,0 | 2,3

| r [mg/kg] | 1 075 | 126,8 | 70,6 | 36,4 | 6,4

| CVr [%] | 2,2 | 3,8 | 2,7 | 4,1 | 3,8

| sR [mg/kg] | 830 | 65,0 | 55,5 | 18,9 | 7,8

| R [mg/kg] | 2 324 | 182,0 | 155,4 | 52,9 | 21,8

| CVR [%] | 4,8 | 5,5 | 6,0 | 6,0 | 12,7

Graphique 2

Appareil d’extraction (point 4.8)

C. DOSAGE DES OLIGOÉLÉMENTS FER, CUIVRE, MANGANÈSE ET ZINC

La teneur en fer, cuivre, manganèse et zinc doit être déterminée:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 15510 «Aliments des animaux — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Détermination des teneurs en calcium, sodium, phosphore, magnésium, potassium, fer, zinc, cuivre, manganèse, cobalt, molybdène et plomb par ICP-AES» ou

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 15621 «Aliments des animaux — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Dosage du calcium, du sodium, du phosphore, du magnésium, du potassium, du soufre, du fer, du zinc, du cuivre, du manganèse et du cobalt après digestion sous pression par ICP-AES» ou

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17053 «Aliments des animaux — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Dosage par ICP-MS (multiméthode) des éléments traces, métaux lourds et autres éléments inorganiques présents dans les aliments» ou

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN ISO 6869 «Aliments des animaux — Détermination des teneurs en calcium, cuivre, fer, magnésium, manganèse, potassium, sodium et zinc — Méthode par spectrométrie d’absorption atomique» ou

— selon la méthode par spectrométrie d’absorption atomique de flamme décrite aux points 1 à 8.

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de doser les oligoéléments fer, cuivre, manganèse et zinc dans les aliments pour animaux. Les limites de quantification sont les suivantes:

— fer (Fe): 20 mg/kg

— cuivre (Cu): 10 mg/kg

— manganèse (Mn): 20 mg/kg

— zinc (Zn): 20 mg/kg

2. Principe

L’échantillon est mis en solution dans l’acide chlorhydrique après destruction éventuelle des matières organiques. Les éléments fer, cuivre, manganèse et zinc sont dosés, après dilution appropriée, par spectrométrie d’absorption atomique.

3. Réactifs

Remarques préliminaires

L’eau utilisée pour la préparation des réactifs et des solutions requises au cours de l’analyse doit être exempte des cations à déterminer. Elle est obtenue soit par double distillation de l’eau dans un appareil en borosilicate ou en quartz, soit par double permutation sur résine échangeuse d’ions.

Les réactifs doivent être au moins de qualité «pour analyse». L’absence de l’élément à déterminer doit être contrôlée par un essai à blanc. Si nécessaire, les réactifs doivent être soumis à une purification plus poussée.

Les solutions étalons décrites ci-après peuvent être remplacées par des solutions étalons commerciales, à condition que celles-ci soient garanties et contrôlées avant l’emploi.

3. 1. Acide chlorhydrique (d: 1,19 g/ml).

3. 2. Acide chlorhydrique (6 mol/l).

3. 3. Acide chlorhydrique (0,5 mol/l).

3. 4. Acide fluorhydrique à 38-40 % (v/v), ayant une teneur en fer (Fe) inférieure à 1 mg/l et dont le résidu d’évaporation est inférieur à 10 mg (exprimés en sulfates)/l.

3. 5. Acide sulfurique (d: 1,84 g/ml).

3. 6. Peroxyde d’hydrogène Peroxyde d’hydrogène [à environ 100 volumes d’oxygène (30 % en poids)].

3. 7. Solution étalon de fer (1 000 μg Fe/ml) préparée comme suit, ou solution commerciale équivalente: dissoudre 1 g de fer en fil dans 200 ml d’acide chlorhydrique 6 mol/litre (point 3.2), ajouter 16 ml de peroxyde d’hydrogène (point 3.6.) et ajuster à 1 litre avec de l’eau.

3. 7.1. Solution étalon de travail de fer (100 μg Fe/ml): diluer une part de la solution étalon (point 3.7) dans neuf parts d’eau.

3. 8. Solution étalon de cuivre (1 000 μg Cu/ml) préparée comme suit, ou solution commerciale équivalente:

— dissoudre 1 g de cuivre en poudre dans 25 ml d’acide chlorhydrique 6 mol/l (point 3.2), ajouter 5 ml de peroxyde d’hydrogène (point 3.6) et ajuster à 1 litre avec de l’eau.

3. 8.1. Solution étalon de travail de cuivre (10 μg Cu/ml): diluer une part de la solution étalon (point 3.8) dans neuf parts d’eau; diluer ensuite une part de la solution obtenue dans neuf parts d’eau.

3. 9. Solution étalon de manganèse (1 000 μg Mn/ml) préparée comme suit, ou solution commerciale équivalente:

— dissoudre 1 g de manganèse en poudre dans 25 ml d’acide chlorhydrique 6 mol/l (point 3.2) et ajuster à 1 litre avec de l’eau.

3. 9.1. Solution étalon de travail de manganèse (10 μg Mn/ml): diluer une part de la solution étalon (point 3.9) dans neuf parts d’eau; diluer ensuite une part de la solution obtenue dans neuf parts d’eau.

3. 10. Solution étalon de zinc (1 000 μg Zn/ml) préparée comme suit, ou solution commerciale équivalente:

— dissoudre 1 g de zinc en ruban ou en plaque dans 25 ml d’acide chlorhydrique 6 mol/l (point 3.2) et ajuster à 1 litre avec de l’eau.

3. 10.1. Solution étalon de travail de zinc (10 μg Zn/ml): diluer une part de la solution étalon (point 3.10) dans neuf parts d’eau; diluer ensuite une part de la solution obtenue dans neuf parts d’eau.

3. 11. Solution de chlorure de lanthane: dissoudre 12 g d’oxyde de lanthane dans 150 ml d’eau, ajouter 100 ml d’acide chlorhydrique 6 mol/l (point 3.2) et ajuster à 1 litre avec de l’eau.

4. Appareillage

4. 1. Four à moufle, à température réglable et, de préférence, contrôlée.

4. 2. Verrerie en borosilicate, résistante. Il est recommandé d’utiliser un matériel servant exclusivement aux dosages des oligoéléments.

4. 3. Spectrophotomètre d’absorption atomique, répondant aux exigences de la méthode en ce qui concerne la sensibilité et la précision dans la gamme des mesures utiles.

5. Mode opératoire

5. 1. Échantillons contenant des composés organiques

5. 1.1. Incinération et préparation de la solution à analyser

5. 1.1.1. Placer 5 à 10 g de l’échantillon, pesés à 0,2 mg près, dans un creuset en quartz ou en platine [voir note b)], sécher à l’étuve à 105 °C et introduire le creuset dans le four à moufle (point 4.1) froid. Fermer le four [voir note c)] et élever progressivement sa température pour atteindre 450 à 475 °C en 90 minutes environ. Maintenir cette température durant 4 à 16 h (par exemple, toute une nuit) de façon à éliminer la matière charbonneuse, ouvrir ensuite le four et laisser refroidir [voir note d)].

Humidifier les cendres avec de l’eau et les transférer dans un bécher de 250 ml. Rincer le creuset à l’aide de 5 ml d’acide chlorhydrique (point 3.1) et transvaser lentement et avec précaution la solution de rinçage dans le bécher (une réaction violente peut se produire par formation de CO2). Ajouter ensuite goutte à goutte de l’acide chlorhydrique (point 3.1), tout en remuant le contenu du bécher, jusqu’à cessation de l’effervescence. Évaporer à sec en remuant périodiquement à l’aide d’une tige de verre.

Ajouter au résidu 15 ml d’acide chlorhydrique 6 mol/l (point 3.2) et ensuite environ 120 ml d’eau. Agiter avec la tige de verre, qu’il importe de laisser dans le bécher, et couvrir ce dernier avec un verre de montre. Porter le liquide à ébullition douce et maintenir l’ébullition jusqu’à ce que les cendres ne se dissolvent apparemment plus. Filtrer sur un papier filtre sans cendres et recueillir le filtrat dans une fiole jaugée de 250 ml. Laver le bécher et le filtre avec 5 ml d’acide chlorhydrique 6 mol/l (point 3.2) chaud et à deux reprises avec de l’eau bouillante. Ajuster au trait de jauge avec de l’eau (la concentration de HCl est d’environ 0,5 mol/l).

5. 1.1.2. Si le résidu se trouvant dans le filtre apparaît noir (charbonneux), le replacer dans le four et incinérer de nouveau à 450-475 °C. Cette incinération, qui requiert seulement quelques heures (3 à 5 heures environ), est complétée lorsque les cendres apparaissent blanches ou presque blanches. Dissoudre le résidu dans environ 2 ml d’acide chlorhydrique (point 3.1), évaporer à sec et ajouter 5 ml d’acide chlorhydrique 6 mol/l (point 3.2). Chauffer, filtrer la solution dans la fiole jaugée et ajuster au trait de jauge avec de l’eau (la concentration de HCl est d’environ 0,5 mol/l).

Notes:

a) Il est important, lors du dosage des oligoéléments, d’être attentif aux risques de contamination, notamment par le zinc, le cuivre et le fer. Les instruments utilisés pour la préparation des échantillons doivent par conséquent être exempts de ces métaux.

Pour réduire les risques de contamination, il convient de travailler en atmosphère exempte de poussières avec un matériel rigoureusement propre et une verrerie soigneusement lavée. Le dosage du zinc est particulièrement sensible aux nombreux types de contaminations dues, par exemple, à la verrerie, aux réactifs et à la poussière.

b) Calculer le poids de l’échantillon à incinérer en fonction de la teneur approximative de l’aliment en oligo-élément à doser et de la sensibilité du spectrophotomètre utilisé. Pour certains aliments pauvres en oligo-éléments, il peut être nécessaire de prélever un échantillon de 10 à 20 g et de limiter le volume de la solution finale à 100 ml.

c) Incinérer dans un four fermé sans injection d’air ou d’oxygène.

d) La température indiquée par le pyromètre ne peut dépasser 475 °C.

5. 1.2. Dosage spectrophotométrique

5. 1.2.1. Préparation des solutions d’étalonnage

Préparer, pour chaque oligoélément à doser, une gamme de solutions d’étalonnage à partir des solutions étalons de travail données aux points 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 et 3.10.1, de façon que chaque solution d’étalonnage ait une concentration de HCl d’environ 0,5 mol/l et, dans le cas du fer, du manganèse et du zinc, une concentration de chlorure de lanthane correspondant à 0,1 % de lanthane (p/v).

Les concentrations choisies d’oligoéléments doivent se trouver dans la zone de sensibilité du spectrophotomètre utilisé. Les tableaux ci-après donnent, à titre d’exemple, des types de composition de solution d’étalonnage; selon le type et la sensibilité du spectrophotomètre utilisé, il peut être nécessaire de choisir d’autres concentrations.

Fer

| μg Fe/ml | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5

| ml de solution étalon de travail (point 3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5

| ml HCl (point 3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7

| + 10 ml de solution de chlorure de lanthane (point 3.11); ajuster à 100 ml avec de l’eau.

Cuivre

| μg Cu/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0

| ml de solution étalon de travail (point 3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10

| ml HCl (point 3.2) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8

Manganèse

| μg Mn/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0

| ml de solution étalon de travail (point 3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10

| ml HCl (point 3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7

| + 10 ml de solution de chlorure de lanthane (point 3.11); ajuster à 100 ml avec de l’eau.

Zinc

| μg Zn/ml | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8

| ml de solution étalon de travail (point 3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8

| ml HCl (point 3.2) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7

| + 10 ml de solution de chlorure de lanthane (point 3.11); ajuster à 100 ml avec de l’eau.

5. 1.2.2. Préparation de la solution à analyser

Pour le dosage du cuivre, la solution préparée conformément au point 5.1.1 peut, en règle générale, être utilisée directement. S’il est nécessaire d’amener sa concentration dans la gamme des concentrations des solutions d’étalonnage, une partie aliquote peut être introduite à la pipette dans une fiole jaugée de 100 ml et ajustée au trait de jauge avec de l’acide chlorhydrique 0,5 mol/l (point 3.3).

Pour le dosage du fer, du manganèse et du zinc, introduire à la pipette une portion aliquote de la solution préparée conformément au point 5.1.1 dans une fiole jaugée de 100 ml; ajouter 10 ml de solution de chlorure de lanthane (point 3.11) et ajuster au trait de jauge avec de l’acide chlorhydrique 0,5 mol/l (point 3.3) (voir aussi point 8 «Observation»).

5. 1.2.3. Essai à blanc

Effectuer un essai à blanc comportant toutes les étapes prescrites du mode opératoire, en excluant la présence de l’échantillon. La solution d’étalonnage «0» ne peut être utilisée comme «blanc».

5. 1.2.4. Mesure de l’absorption atomique

Mesurer l’absorption atomique des solutions d’étalonnage et de la solution à analyser, en utilisant une flamme oxydante air-acétylène, aux longueurs d’onde ci-après:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Effectuer chaque mesure quatre fois.

5. 2. Aliments minéraux

En l’absence de matière organique, l’incinération préalable est inutile. Appliquer le mode opératoire à partir du deuxième alinéa du point 5.1.1.1. L’évaporation en présence d’acide fluorhydrique peut être omise.

6. Calcul des résultats

Calculer la concentration d’oligoéléments dans la solution à analyser à l’aide d’une courbe d’étalonnage et exprimer le résultat en mg d’oligoélément par kg d’échantillon (ppm).

7. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur un même échantillon par le même analyste ne peut dépasser:

— 5 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs en oligoélément concerné allant jusqu’à 50 mg/kg,

— 10 % du résultat le plus élevé pour les teneurs en oligoélément comprises entre 50 et 100 mg/kg,

— 10 mg/kg, en valeur absolue, pour les teneurs en oligoélément concerné comprises entre 100 et 200 mg/kg,

— 5 % du résultat le plus élevé pour les teneurs en oligoélément concerné supérieures à 200 mg/kg.

8. Observation

La présence de grandes quantités de phosphates peut interférer dans le dosage du fer, du manganèse et du zinc. Cette interférence doit être corrigée par addition de solution de chlorure de lanthane (point 3.11). Néanmoins, si l’échantillon a un rapport pondéral Ca + Mg/P > 2, l’addition de solution de chlorure de lanthane (point 3.11) à la solution à analyser et aux solutions d’étalonnage peut être omise.

D. DOSAGE DE L’HALOFUGINONE

DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl) acétonyl]-quinazoline-4-(3H)-one bromhydrate

L’halofuginone doit être dosé:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17299 «Aliments pour animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Recherche et dosage dans des aliments composés pour animaux des coccidiostatiques autorisés au taux d’additif et de contamination croisée à 1 % et 3 %, de coccidiostatiques non enregistrés et d’un antibiotique aux taux sub-additifs, par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)» ou

— par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) en phase inverse à l’aide d’un détecteur UV, conformément aux points 1 à 8.

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en halofuginone des aliments pour animaux. La limite de quantification est de 1 mg/kg.

2. Principe

Après traitement à l’eau chaude, l’halofuginone est extrait sous forme de base libre dans de l’acétate d’éthyle et ensuite séparé sous forme de chlorhydrate dans une solution acide aqueuse. L’extrait est purifié par chromatographie sur résines échangeuses d’ions. La teneur en halofuginone est déterminée par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) en phase inverse à l’aide d’un détecteur d’UV.

3. Réactifs

3. 1. Acétonitrile, de qualité CLHP.

3. 2. Résine d’Amberlite XAD-2.

3. 3. Acétate d’ammonium.

3. 4. Acétate d’éthyle.

3. 5. Acide acétique, glacial.

3. 6. Halofuginone étalon (DL-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl) acétonyl]-quinazoline-4-(3H)-one bromhydrate, E 764).

3. 6.1. Solution mère étalon d’halofuginone, 100 μg/ml

Peser, à 0,1 mg près, 50 mg d’halofuginone (point 3.6) dans une fiole jaugée de 500 ml, dissoudre dans une solution tampon d’acétate d’ammonium (point 3.18), ajuster au trait de jauge avec la solution tampon et mélanger. Cette solution est stable pendant trois semaines à 5 °C si elle est conservée à l’abri de la lumière.

3. 6.2. Solutions d’étalonnage

Dans une série de fioles jaugées de 100 ml, transvaser 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 et 6,0 ml de la solution mère de l’étalon (point 3.6.1). Ajuster au trait de jauge avec la phase mobile (point 3.21) et mélanger. Ces solutions ont des concentrations respectives de 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 et 6,0 mg/ml d’halofuginone. Les solutions doivent être préparées peu avant d’être utilisées.

3. 7. Acide chlorhydrique (ρ20 environ 1,16 g/ml).

3. 8. Méthanol.

3. 9. Nitrate d’argent.

3. 10. Ascorbate de sodium.

3. 11. Carbonate de sodium.

3. 12. Chlorure de sodium.

3. 13. EDTA (acide éthylènediamine tétracétique, sel disodique).

3. 14. Eau, de qualité CLHP.

3. 15. Solution de carbonate de sodium, c = 10 g/100 ml.

3. 16. Solution de carbonate de sodium saturée au chlorure de sodium, c = 5 g/100 ml.

Dissoudre 50 g de carbonate de sodium (point 3.11) dans de l’eau, ajuster à 1 litre et ajouter du chlorure de sodium (point 3.12) jusqu’à saturation de la solution.

3. 17. Acide chlorhydrique, environ 0,1 mol/l.

Diluer avec de l’eau 10 ml d’acide chlorhydrique (point 3.7) jusqu’à 1 litre.

3. 18. Solution tampon d’acétate d’ammonium, environ 0,25 mol/l.

Dissoudre 19,3 g d’acétate d’ammonium (point 3.3) et 30 ml d’acide acétique (point 3.5) dans de l’eau (point 3.14) et ajuster à 1 litre.

3. 19. Préparation de la résine d’Amberlite XAD-2

Laver une quantité appropriée d’Amberlite (point 3.2) avec de l’eau jusqu’à l’élimination de tous les ions chlorure, indiquée par un essai au nitrate d’argent (point 3.20) réalisé sur la phase aqueuse éliminée. Laver ensuite la résine avec 50 ml de méthanol (point 3.8), écarter le méthanol et conserver la résine sous méthanol frais.

3. 20. Solution de nitrate d’argent, environ 0,1 mol/l

Dissoudre 0,17 g de nitrate d’argent (point 3.9) dans 10 ml d’eau.

3. 21. Phase mobile de la CLHP

Mélanger 500 ml d’acétonitrile (point 3.1) avec 300 ml de solution tampon d’acétate d’ammonium (point 3.18) et 1 200 ml d’eau (point 3.14). Ajuster au moyen d’acide acétique (point 3.5) à pH 4,3. Filtrer à travers un filtre de 0,22 μm (point 4.8) et dégazer la solution (par exemple, par traitement aux ultrasons pendant 10 minutes). Cette solution est stable pendant un mois si elle est conservée à l’abri de la lumière dans un récipient fermé.

4. Appareillage

4. 1. Bain ultrasonique.

4. 2. Évaporateur rotatif.

4. 3. Centrifugeuse.

4. 4. Équipement pour CLHP avec détecteur d’ultraviolets à longueur d’onde variable ou détecteur à barrettes de diodes.

4. 4.1. Colonne de chromatographie liquide, 300 mm × 4 mm, C18, particules de 10 μm, ou équivalent.

4. 5. Colonne de verre (300 mm × 10 mm), munie d’un filtre de verre fritté et d’un robinet.

4. 6. Filtres en fibre de verre, de 150 mm de diamètre.

4. 7. Filtre à membrane de 0,45 μm.

4. 8. Filtre à membrane de 0,22 μm.

5. Mode opératoire

NB: L’halofuginone, en tant que base libre, est instable dans des solutions alcalines et d’acétate d’éthyle. Il ne doit pas rester dans l’acétate d’éthyle pendant plus de 30 minutes.

5. 1. Généralités

5. 1.1. Un aliment blanc doit être analysé afin de vérifier l’absence d’halofuginone ou de substances interférentes.

5. 1.2. Effectuer un test de récupération par analyse de l’aliment blanc auquel a été ajoutée une quantité d’halofuginone pareille à celle présente dans l’échantillon. Pour parvenir à une teneur de 3 mg/kg, ajouter 300 μl de la solution mère de l’étalon (point 3.6.1) à 10 g d’aliment blanc, mélanger et attendre 10 minutes avant de procéder à l’extraction (point 5.2).

NB: Dans le cadre de cette méthode, l’aliment blanc doit être d’un type pareil dans sa composition à celui de l’échantillon et, lors de son analyse, il ne doit pas être détecté d’halofuginone.

5. 2. Extraction

Peser, à 0,1 g près, 10 g de l’échantillon préparé dans un tube à centrifuger de 200 ml, ajouter 0,5 g d’ascorbate de sodium (point 3.10), 0,5 g d’EDTA (point 3.13) et 20 ml d’eau, puis mélanger. Placer le tube pendant 5 minutes au bain-marie (80 °C). Après refroidissement à température ambiante, ajouter 20 ml de solution de carbonate de sodium (point 3.15) et mélanger. Ajouter immédiatement 100 ml d’acétate d’éthyle (point 3.4) et agiter vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Placer ensuite le tube pendant 3 minutes dans le bain ultrasonique (point 4.1) en dévissant le bouchon. Centrifuger pendant 2 minutes et décanter la phase d’acétate d’éthyle à travers un filtre en fibre de verre (point 4.6) dans une ampoule à décanter de 500 ml. Répéter l’extraction de l’échantillon avec une seconde portion de 100 ml d’acétate d’éthyle. Laver les extraits combinés pendant 1 minute avec 50 ml de la solution de carbonate de sodium saturée au chlorure de sodium (point 3.16) et éliminer la phase aqueuse.

Extraire la couche organique pendant 1 minute avec 50 ml d’acide chlorhydrique (point 3.17). Faire passer la couche acide inférieure dans une ampoule à décanter de 250 ml. Réextraire la couche organique pendant 1,5 minute avec 50 ml d’acide chlorhydrique supplémentaires et combiner avec le premier extrait. Laver les extraits d’acide combinés par agitation pendant environ 10 secondes avec 10 ml d’acétate d’éthyle (point 3.4).

Transvaser quantitativement la couche aqueuse dans un ballon à fond rond de 250 ml et éliminer la phase organique. À l’aide d’un évaporateur rotatif (point 4.2), évaporer totalement le reste d’acétate d’éthyle de la solution acide. La température du bain-marie ne doit pas dépasser 40 °C. Sous un vide partiel d’environ 25 mbar, la totalité de l’acétate d’éthyle résiduel sera éliminée en 5 minutes à 38 °C.

5. 3. Purification

5. 3.1. Préparation de la colonne d’Amberlite

Pour chaque extrait d’échantillon, préparer une colonne XAD-2. À l’aide de méthanol (point 3.8), transvaser 10 g d’Amberlite préparée (point 3.19) dans une colonne de verre (point 4.5). Ajouter un petit tampon de laine de verre au sommet du lit de la résine. Laisser le méthanol s’écouler de la colonne et laver la résine avec 100 ml d’eau, en arrêtant le débit lorsque le liquide atteint le sommet du lit de la résine. Laisser la colonne se stabiliser pendant 10 minutes avant de l’utiliser. Ne jamais laisser la colonne aller à sec.

5. 3.2. Purification de l’échantillon

Transvaser l’extrait (point 5.2) quantitativement au sommet de la colonne d’Amberlite préparée (point 5.3.1) et éluer, en écartant l’éluat. La vitesse d’élution ne doit pas dépasser 20 ml/min. Rincer le ballon à fond rond avec 20 ml d’acide chlorhydrique (point 3.17) et utiliser cette solution pour laver la colonne de résine. Faire passer un courant d’air pour éliminer la solution acide restante. Éliminer les liquides du lavage. Ajouter 100 ml de méthanol (point 3.8) à la colonne et laisser éluer 5 à 10 ml en recueillant l’éluat dans un ballon à fond rond de 250 ml. Laisser le reste de méthanol se stabiliser pendant 10 minutes avec la résine et poursuivre l’élution à une vitesse ne dépassant pas 20 ml/min, en recueillant l’éluat dans le même ballon à fond rond. À l’aide d’un évaporateur rotatif (point 4.2), évaporer le méthanol, en veillant à ce que la température du bain-marie ne dépasse pas 40 °C. Transvaser le résidu quantitativement dans une fiole jaugée de 10 ml à l’aide de la phase mobile (point 3.21). Ajuster au trait de jauge avec la phase mobile et mélanger. Une partie aliquote est filtrée à travers un filtre à membrane (point 4.7). Réserver cette solution pour l’analyse par CLHP (point 5.4).

5. 4. Dosage par CLHP

5. 4.1. Paramètres

Les conditions ci-après sont proposées à titre indicatif; d’autres conditions peuvent être appliquées si elles donnent des résultats équivalents.

Colonne de chromatographie liquide (point 4.4.1).

Phase mobile de la CLHP (point 3.21).

Débit: 1,5 à 2 ml/min.

Longueur d’onde de détection: 243 nm

Volume d’injection: 40 à 100 μl.

Vérifier la stabilité du système chromatographique en injectant plusieurs fois la solution d’étalonnage (point 3.6.2) contenant 3,0 μg/ml jusqu’à obtention de hauteurs (ou surfaces) de pic et de temps de rétention constants.

5. 4.2. Courbe d’étalonnage

Injecter plusieurs fois chaque solution d’étalonnage (point 3.6.2) et mesurer les hauteurs (surfaces) des pics pour chaque concentration. Tracer la courbe d’étalonnage en portant les hauteurs ou surfaces moyennes des pics des solutions d’étalonnage en ordonnée et les concentrations correspondantes en μg/ml en abscisse.

5. 4.3. Solution d’échantillon

Injecter plusieurs fois l’extrait d’échantillon (point 5.3.2), en utilisant le même volume que pour les solutions d’étalonnage, et déterminer la hauteur (surface) de pic moyenne de l’halofuginone.

6. Calcul des résultats

À partir de la hauteur (surface) moyenne des pics d’halofuginone de la solution d’échantillon, déterminer la concentration d’halofuginone dans cette solution, en μg/ml, par référence à la courbe d’étalonnage (point 5.4.2).

La teneur en halofuginone w (mg/kg) de l’échantillon est donnée par la formule suivante:

wc × 10m

où:

cconcentration d’halofuginone dans la solution d’échantillon, en μg/ml,

mpoids de la prise d’essai, en grammes.

7. Validation des résultats

7. 1. Identité

L’identité de l’analyte peut être confirmée par cochromatographie ou à l’aide d’un détecteur à barrettes de diodes qui permet de comparer les spectres de l’extrait de l’échantillon et de la solution d’étalonnage (point 3.6.2) contenant 6,0 μg/ml.

7. 1.1. Cochromatographie

Un extrait d’échantillon est supplémenté par ajout d’une quantité appropriée de solution d’étalonnage (point 3.6.2). La quantité d’halofuginone ajoutée doit être pareille à la quantité estimée d’halofuginone trouvée dans l’extrait d’échantillon.

Seule la hauteur du pic d’halofuginone doit être augmentée, compte tenu à la fois de la quantité ajoutée et de la dilution de l’extrait. La largeur du pic, à la moitié de sa hauteur, doit être d’environ 10 % de sa largeur initiale.

7. 1.2. Détection par barrettes de diodes

Évaluer les résultats conformément aux critères suivants:

a) les longueurs d’onde d’absorption maximale des spectres de l’échantillon et de l’étalon, enregistrées au sommet des pics sur le chromatogramme, doivent être identiques, dans une marge déterminée par le pouvoir de résolution du système de détection. Dans le cadre d’une détection par barrettes de diodes, elle est généralement d’environ 2 nm;

b) entre 225 et 300 nm, les spectres de l’échantillon et de l’étalon, enregistrés au sommet des pics sur le chromatogramme, ne peuvent être différents pour les parties du spectre comprises entre 10 et 100 % d’absorbance relative. Ce critère est rempli lorsque les mêmes maxima sont présents et que l’écart observé entre les deux spectres ne dépasse nulle part 15 % de l’absorbance de l’analyte étalon;

c) entre 225 et 300 nm, les spectres de la courbe ascendante, du sommet et de la courbe descendante du pic fourni par l’extrait d’échantillon ne peuvent être visuellement différents les uns des autres pour les parties du spectre comprises entre 10 et 100 % d’absorbance relative. Ce critère est rempli lorsque les mêmes maxima sont présents et que l’écart observé entre les spectres ne dépasse nulle part 15 % de l’absorbance du spectre au sommet du pic.

Si l’un de ces critères n’est pas rempli, la présence de l’analyte n’est pas confirmée.

7. 2. Répétabilité

La différence entre les résultats des deux analyses parallèles effectuées sur le même échantillon ne peut dépasser 0,5 mg/kg pour des teneurs en halofuginone allant jusqu’à 3 mg/kg.

7. 3. Récupération

En ce qui concerne l’échantillon blanc supplémenté, la récupération doit être de 80 % au minimum.

8. Résultats d’une étude collaborative

Dans le cadre d’une étude collaborative, trois échantillons ont été analysés par huit laboratoires.

Résultats

ND= non détecté

SR= écart type de reproductibilité

CVR= coefficient de variation de la reproductibilité (%)

Réc.= récupération (%)

| |

Échantillon A (blanc)

À la réception

| Échantillon B (farine) | Échantillon C (granulés)

| | | À la réception | Après deux mois | À la réception | Après deux mois

| Moyenne [mg/kg] | ND | 2,80 | 2,42 | 2,89 | 2,45

| SR [mg/kg] | — | 0,45 | 0,43 | 0,40 | 0,42

| CVR [%] | — | 16 | 18 | 14 | 17

| Réc. [%] | | 86 | 74 | 88 | 75

E. DOSAGE DE LA ROBÉNIDINE

Chlorhydrate de 1,3-bis [(4-chlorobenzylidène) amino] guanidine

La robénidine doit être dosée:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17299 «Aliments pour animaux — méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Recherche et dosage dans des aliments composés pour animaux des coccidiostatiques autorisés au taux d’additif et de contamination croisée à 1 % et 3 %, de coccidiostatiques non enregistrés et d’un antibiotique aux taux sub-additifs, par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)» ou

— par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) en phase inverse à l’aide d’un détecteur UV, conformément aux points 1 à 8.

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en robénidine des aliments pour animaux. La limite de quantification est de 5 mg/kg.

2. Principe

L’échantillon est extrait à l’aide de méthanol acidifié. L’extrait est séché et une partie aliquote purifiée dans une colonne d’oxyde d’aluminium. La robénidine est éluée de la colonne à l’aide de méthanol, concentrée et portée à un volume adéquat avec la phase mobile. La teneur en robénidine est déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) en phase inverse, à l’aide d’un détecteur d’ultraviolets.

3. Réactifs

3. 1. Méthanol.

3. 2. Méthanol acidifié

Transvaser 4,0 ml d’acide chlorhydrique (ρ20 = 1,18 g/ml) dans une fiole jaugée de 500 ml, ajuster au trait de jauge avec du méthanol (point 3.1) et mélanger. Cette solution doit être préparée peu avant d’être utilisée.

3. 3. Acétonitrile, de qualité CLHP.

3. 4. Tamis moléculaire

Type 3A, perles de 8 à 12 mesh (perles de 1,6 à 2,5 mm, aluminosilicate cristallin, diamètre des pores de 0,3 mm).

3. 5. Oxyde d’aluminium: acide, degré d’activité I pour chromatographie sur colonne

Transvaser 100 g d’oxyde d’aluminium dans un récipient approprié et ajouter 2,0 ml d’eau. Boucher et agiter pendant environ 20 minutes. Conserver dans un récipient bien fermé.

3. 6. Solution de dihydrogénophosphate de potassium, c = 0,025 mol/l

Dissoudre 3,40 g de dihydrogénophosphate de potassium dans de l’eau (qualité CLHP) dans une fiole jaugée de 1 000 ml, ajuster au trait de jauge et mélanger.

3. 7. Solution de monohydrogénophosphate disodique, c = 0,025 mol/l

Dissoudre 3,55 g de monohydrogénophosphate disodique anhydre (ou 4,45 g de dihydrate ou 8,95 g de dodécahydrate) dans de l’eau (de qualité CLHP), dans une fiole jaugée de 1 litre, ajuster au trait de jauge et mélanger.

3. 8. Phase mobile de la CLHP

Mélanger les réactifs suivants:

650 ml d’acétonitrile (point 3.3),

250 ml d’eau (de qualité CLHP),

50 ml de solution de dihydrogénophosphate de potassium (point 3.6),

50 ml de solution de monohydrogénophosphate disodique (point 3.7).

Filtrer à travers un filtre de 0,22 μm (point 4.6) et dégazer la solution (par exemple, par traitement aux ultrasons pendant 10 minutes).

3. 9. Substance étalon

Robénidine pure: chlorhydrate de 1,3-bis [(4-chlorobenzylidène) amino] guanidine

3. 9.1. Solution mère étalon de robénidine: 300 μg/ml

Peser, à 0,1 mg près, 30 mg de substance étalon de robénidine (point 3.9). Dissoudre dans du méthanol acidifié (point 3.2), dans une fiole jaugée de 100 ml, ajuster au trait de jauge avec le même solvant et mélanger. Envelopper la fiole dans une feuille d’aluminium et conserver à l’abri de la lumière.

3. 9.2. Solution étalon intermédiaire de robénidine: 12 μg/ml

Transvaser 10,0 ml de la solution mère de l’étalon (point 3.9.1) dans une fiole jaugée de 250 ml, ajuster au trait de jauge avec la phase mobile (point 3.8) et mélanger. Envelopper la fiole dans une feuille d’aluminium et conserver à l’abri de la lumière.

3. 9.3. Solutions d’étalonnage

Dans une série de fioles jaugées de 50 ml, transvaser 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 et 25,0 ml de la solution étalon intermédiaire (point 3.9.2). Ajuster au trait de jauge avec la phase mobile (point 3.8) et mélanger. Ces solutions ont des concentrations respectives de 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 et 6,0 μg/ml de robénidine. Les solutions doivent être préparées peu avant d’être utilisées.

3. 10. Eau de qualité CLHP.

4. Appareillage

4. 1. Colonne de verre

Colonne construite en verre ambré, munie d’un robinet et d’un réservoir d’une capacité d’environ 150 ml, d’un diamètre intérieur de 10-15 mm, d’une longueur de 250 mm.

4. 2. Agitateur mécanique ou magnétique.

4. 3. Évaporateur rotatif.

4. 4. Équipement pour CLHP avec détecteur d’ultraviolets à longueur d’onde variable ou détecteur à barrettes de diodes fonctionnant dans l’intervalle de 250-400 nm.

4. 4.1. Colonne de chromatographie liquide: 300 mm × 4 mm, C18, particules de 10 μm, ou équivalent.

4. 5. Papier filtre en fibre de verre (Whatman GF/A ou équivalent).

4. 6. Filtre à membrane de 0,22 μm.

4. 7. Filtre à membrane de 0,45 μm.

5. Mode opératoire

NB: La robénidine est photosensible. L’emploi de verrerie ambrée est recommandé pour toutes les opérations.

5. 1. Généralités

5. 1.1. Il est recommandé d’analyser un aliment blanc pour vérifier l’absence de robénidine et de substances interférentes.

5. 1.2. Effectuer un test de récupération par analyse de l’aliment blanc (point 5.1.1) auquel a été ajoutée une quantité de robénidine pareille à celle présente dans l’échantillon. Pour parvenir à une teneur de 60 mg/kg, transvaser 3,0 ml de la solution mère de l’étalon (point 3.9.1) dans une fiole conique de 250 ml. Ramener la solution à environ 0,5 ml par évaporation dans un courant d’azote. Ajouter 15 g de l’aliment blanc, mélanger et laisser reposer 10 minutes avant de procéder à l’extraction (point 5.2).

NB: Dans le cadre de cette méthode, l’aliment blanc doit être d’un type pareil à celui de l’échantillon et, lors de son analyse, il ne doit pas être détecté de robénidine.

5. 2. Extraction

Peser, à 0,01 g près, 15 g de l’échantillon préparé. Transvaser dans une fiole conique de 250 ml et ajouter 100,0 ml de méthanol acidifié (point 3.2), boucher le récipient et agiter pendant une heure avec l’agitateur (point 4.2). Filtrer la solution à travers un papier filtre en fibre de verre (point 4.5) et recueillir la totalité du filtrat dans une fiole conique de 150 ml. Ajouter 7,5 g de tamis moléculaire (point 3.4), boucher le récipient et agiter pendant 5 minutes. Filtrer immédiatement à travers un papier filtre en fibre de verre. Conserver cette solution pour la purification (point 5.3).

5. 3. Purification

5. 3.1. Préparation de la colonne d’oxyde d’aluminium

Munir l’extrémité inférieure d’une colonne de verre d’un petit tampon de laine de verre (point 4.1) et tasser à l’aide d’une baguette de verre. Peser et transvaser dans la colonne 11,0 g d’oxyde d’aluminium préparé (point 3.5). Il convient de réduire l’exposition à l’air au cours de cette opération. Tapoter l’extrémité inférieure de la colonne remplie pour décanter l’oxyde d’aluminium.

5. 3.2. Purification de l’échantillon

À l’aide d’une pipette, transférer sur la colonne 5,0 ml de l’extrait d’échantillon préparé (point 5.2). Maintenir l’embout de la pipette contre la paroi de la colonne et laisser l’oxyde d’aluminium absorber la solution. Éluer la robénidine de la colonne à l’aide de 100 ml de méthanol (point 3.1), à un débit de 2-3 ml/min, et recueillir l’éluat dans un ballon à fond rond de 250 ml. Sécher la solution de méthanol par évaporation, à pression réduite, à 40 °C, à l’aide d’un évaporateur rotatif (point 4.3). Redissoudre le résidu dans 3-4 ml de la phase mobile (point 3.8) et transvaser quantitativement dans une fiole jaugée de 10 ml. Rincer la fiole avec plusieurs fractions de 1-2 ml de la phase mobile et transvaser ces rinçages dans la fiole jaugée. Ajuster au trait de jauge avec le même solvant et mélanger. Une partie aliquote est filtrée à travers un filtre à membrane de 0,45 μm (point 4.7). Réserver cette solution pour l’analyse par CLHP (point 5.4).

5. 4. Dosage par CLHP

5. 4.1. Paramètres

Les conditions ci-après sont proposées à titre indicatif; d’autres conditions peuvent être appliquées si elles donnent des résultats équivalents:

Colonne de chromatographie liquide (point 4.4.1).

Phase mobile de la CLHP (point 3.8).

Débit: 1,5 à 2 ml/minute.

Longueur d’onde de détection: 317 nm.

Volume d’injection: 20 à 50 μl.

Vérifier la stabilité du système chromatographique en injectant la solution d’étalonnage (point 3.9.3) contenant 3,6 μg/ml plusieurs fois jusqu’à obtention de hauteurs de pic et de temps de rétention constants.

5. 4.2. Courbe d’étalonnage

Injecter plusieurs fois chaque solution d’étalonnage (point 3.9.3) et mesurer les hauteurs (surfaces) des pics pour chaque concentration. Tracer la courbe d’étalonnage en portant les hauteurs ou surfaces moyennes des pics des solutions d’étalonnage en ordonnée et les concentrations correspondantes en μg/ml en abscisse.

5. 4.3. Solution d’échantillon

Injecter plusieurs fois l’extrait d’échantillon (point 5.3.2) en utilisant le même volume que pour les solutions d’étalonnage et déterminer la hauteur (surface) moyenne des pics de robénidine.

6. Calcul des résultats

À partir de la hauteur (surface) moyenne des pics de robénidine de la solution d’échantillon, déterminer la concentration de robénidine dans cette solution, en μg/ml, par référence à la courbe d’étalonnage (point 5.4.2).

La teneur en robénidine w (mg/kg) de l’échantillon est donnée par la formule suivante:

wc × 200m

où:

cconcentration de robénidine dans la solution d’échantillon, en μg/ml,

mpoids de la prise d’essai, en grammes.

7. Validation des résultats

7. 1. Identité

L’identité de l’analyte peut être confirmée par cochromatographie ou à l’aide d’un détecteur à barrettes de diodes qui permet de comparer les spectres de l’extrait de l’échantillon et de la solution d’étalonnage (point 3.9.3) contenant 6 μg/ml.

7. 1.1. Cochromatographie

Un extrait d’échantillon est supplémenté par ajout d’une quantité appropriée de solution d’étalonnage (point 3.9.3). La quantité de robénidine ajoutée doit être pareille à la quantité estimée de robénidine trouvée dans l’extrait d’échantillon.

Seule la hauteur du pic de robénidine doit être augmentée, compte tenu à la fois de la quantité ajoutée et de la dilution de l’extrait. La largeur du pic, à la moitié de sa hauteur, doit être d’environ 10 % de sa largeur initiale.

7. 1.2. Détection par barrettes de diodes

Évaluer les résultats conformément aux critères suivants:

a) les longueurs d’onde d’absorption maximale des spectres de l’échantillon et de l’étalon, enregistrées au sommet des pics sur le chromatogramme, doivent être identiques, dans une marge déterminée par le pouvoir de résolution du système de détection. Dans le cadre d’une détection par barrettes de diodes, elle est généralement de plus ou moins 2 nm;

b) entre 250 et 400 nm, les spectres de l’échantillon et de l’étalon, enregistrés au sommet des pics sur le chromatogramme, ne peuvent être différents pour les parties du spectre comprises entre 10 et 100 % d’absorbance relative. Ce critère est rempli lorsque les mêmes maxima sont présents et que l’écart observé entre les deux spectres ne dépasse nulle part 15 % de l’absorbance de l’analyte étalon;

c) entre 250 et 400 nm, les spectres de la courbe ascendante, du sommet et de la courbe descendante du pic fourni par l’extrait d’échantillon ne peuvent être visuellement différents les uns des autres pour les parties du spectre comprises entre 10 et 100 % d’absorbance relative. Ce critère est rempli lorsque les mêmes maxima sont présents et que l’écart observé entre les spectres ne dépasse nulle part 15 % de l’absorbance du spectre au sommet du pic.

Si l’un de ces critères n’est pas rempli, la présence de l’analyte n’est pas confirmée.

7. 2. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser 10 % du résultat le plus élevé pour une teneur en robénidine supérieure à 15 mg/kg.

7. 3. Récupération

En ce qui concerne l’échantillon blanc supplémenté, la récupération doit être de 85 % au minimum.

8. Résultats d’une étude collaborative

Dans le cadre d’une étude collaborative UE, quatre échantillons d’aliments pour volailles et lapins, sous forme de farine ou de granulés, ont été analysés par douze laboratoires. Pour chaque échantillon, les analyses ont été effectuées en double. Les résultats de l’étude figurent dans le tableau ci-après.

sr= écart type de répétabilité

CVr= coefficient de variation de la répétabilité (%)

SR= écart type de reproductibilité

CVR= coefficient de variation de la reproductibilité (%)

| | Volailles | Lapins

| | Farine | Granulés | Farine | Granulés

| Moyenne [mg/kg] | 27,00 | 27,99 | 43,6 | 40,1

| sr [mg/kg] | 1,46 | 1,26 | 1,44 | 1,66

| CVr [%] | 5,4 | 4,5 | 3,3 | 4,1

| SR [mg/kg] | 4,36 | 3,36 | 4,61 | 3,91

| CVR [%] | 16,1 | 12,0 | 10,6 | 9,7

| Récupération [%] | 90,0 | 93,3 | 87,2 | 80,2

F. DOSAGE DU DICLAZURIL

(+)-4-chlorophényl[2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tétrahydro–3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)phényl]acétonitrile.

Le diclazuril doit être dosé:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17299 «Aliments pour animaux — méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Recherche et dosage dans des aliments composés pour animaux des coccidiostatiques autorisés au taux d’additif et de contamination croisée à 1 % et 3 %, de coccidiostatiques non enregistrés et d’un antibiotique aux taux sub-additifs, par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)» ou

— par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) à gradients ternaires et en phase inverse à l’aide d’un détecteur UV, conformément aux points 1 à 9.

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en diclazuril des aliments composés pour animaux et des prémélanges. La limite de détection est de 0,1 mg/kg; la limite de quantification est de 0,5 mg/kg. Les seuils de quantification peuvent être atteints, mais l’utilisateur devra les valider.

2. Principe

Après l’addition d’un étalon interne, l’échantillon est extrait à l’aide de méthanol acidifié. Pour les aliments pour animaux, une partie aliquote de l’extrait est purifiée sur une cartouche C18 pour extraction en phase solide. Le diclazuril est élué de la cartouche à l’aide d’un mélange de méthanol acidifié et d’eau. Après évaporation, le résidu est dissous dans un mélange DMF/eau. Pour les prémélanges, l’extrait est évaporé et le résidu est dissous dans un mélange DMF/eau. La teneur en diclazuril est déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) à gradients ternaires et en phase inverse, à l’aide d’un détecteur UV.

3. Réactifs

3. 1. Eau, de qualité CLHP.

3. 2. Acétate d’ammonium.

3. 3. Hydrogénosulfate de tétrabutylammonium (TBHS).

3. 4. Acétonitrile, de qualité CLHP.

3. 5. Méthanol, de qualité CLHP.

3. 6. N, N-diméthylformamide (DMF).

3. 7. Acide chlorhydrique, ρ20 = 1,19 g/ml.

3. 8. Substance étalon: diclazuril: (+)-4-chlorophényl[2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tétrahydro–3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)phényl]acétonitrile de pureté garantie.

3. 8.1. Solution mère étalon de diclazuril, 500 μg/ml

Peser, à 0,1 mg près, 25 mg de substance étalon de diclazuril (point 3.8) dans une fiole jaugée de 50 ml. Dissoudre dans du DMF (point 3.6), ajuster au trait de jauge avec du DMF (point 3.6) et mélanger. Envelopper le flacon dans une feuille d’aluminium ou utiliser un flacon ambré et le mettre au réfrigérateur. À une température inférieure ou égale à 4 °C, la solution est stable pendant un mois.

3. 8.2. Solution étalon de diclazuril, 50 μg/ml

Transférer 5,00 ml de la solution mère de l’étalon (point 3.8.1) dans une fiole jaugée de 50 ml, ajuster au trait de jauge avec du DMF (point 3.6) et mélanger. Envelopper le flacon dans une feuille d’aluminium ou utiliser un flacon ambré et le mettre au réfrigérateur. À une température inférieure ou égale à 4 °C, la solution est stable pendant un mois.

3. 9. Étalon interne: 2,6 dichloro-α-(4-chlorophényl)-4-(4,5 dihydro–3,5-dioxo-1,2,4-triazine-2 (3H)-yl) α-méthylbenzène-acétonitrile (diclazuril-methyl).

3. 9.1. Solution mère de l’étalon interne, 500 μg/ml

Peser, à 0,1 mg près, 25 mg de substance étalon interne (point 3.9) dans une fiole jaugée de 50 ml. Dissoudre dans du DMF (point 3.6), ajuster au trait de jauge avec du DMF (point 3.6) et mélanger. Envelopper le flacon dans une feuille d’aluminium ou utiliser un flacon ambré et le mettre au réfrigérateur. À une température inférieure ou égale à 4 °C, la solution est stable pendant un mois.

3. 9.2. Solution de l’étalon interne, 50 μg/ml

Transférer 5,00 ml de la solution mère de l’étalon interne (point 3.9.1) dans une fiole jaugée de 50 ml, ajuster au trait de jauge avec du DMF (point 3.6) et mélanger. Envelopper le flacon dans une feuille d’aluminium ou utiliser un flacon ambré et le mettre au réfrigérateur. À une température inférieure ou égale à 4 °C, la solution est stable pendant un mois.

3. 9.3. Solution de l’étalon interne pour prémélanges, p/1 000 mg/ml (p = teneur nominale en diclazuril du prémélange en mg/kg)

Peser, à 0,1 mg près, p/10 mg de l’étalon interne dans une fiole jaugée de 100 ml, dissoudre dans du DMF (point 3.6) dans un bain ultrasonique (point 4.7), ajuster au trait de jauge avec du DMF et mélanger. Envelopper le flacon dans une feuille d’aluminium ou utiliser un flacon ambré et le mettre au réfrigérateur. À une température inférieure ou égale à 4 °C, la solution est stable pendant un mois.

3. 10. Solutions d’étalonnage

3. 10.1. Solution d’étalonnage, 1 μg/ml (diclazuril)

Introduire à la pipette 1,00 ml de solution étalon de diclazuril (point 3.8.2) et 2,00 ml de solution de l’étalon interne (point 3.9.2) dans une fiole jaugée de 50 ml. Ajouter 17 ml de DMF (point 3.6), ajuster au trait de jauge avec de l’eau (point 3.1) et mélanger. Cette solution doit être préparée peu avant d’être utilisée.

3. 10.2. Solution d’étalonnage, 2 μg/ml (diclazuril)

Introduire à la pipette 2,00 ml de solution étalon de diclazuril (point 3.8.2) et 2,00 ml de solution de l’étalon interne (point 3.9.2) dans une fiole jaugée de 50 ml. Ajouter 16 ml de DMF (point 3.6), ajuster au trait de jauge avec de l’eau (point 3.1) et mélanger. Cette solution doit être préparée peu avant d’être utilisée.

3. 10.3. Solution d’étalonnage, 3 μg/ml (diclazuril)

Introduire à la pipette 3,00 ml de solution étalon de diclazuril (point 3.8.2) et 2,00 ml de solution de l’étalon interne (point 3.9.2) dans une fiole jaugée de 50 ml. Ajouter 15 ml de DMF (point 3.6), ajuster au trait de jauge avec de l’eau (point 3.1) et mélanger. Cette solution doit être préparée peu avant d’être utilisée.

3. 10.4. Solution d’étalonnage, 4 μg/ml (diclazuril)

Introduire à la pipette 4,00 ml de solution étalon de diclazuril (point 3.8.2) et 2,00 ml de solution de l’étalon interne (point 3.9.2) dans une fiole jaugée de 50 ml. Ajouter 14 ml de DMF (point 3.6), ajuster au trait de jauge avec de l’eau (point 3.1) et mélanger. Cette solution doit être préparée peu avant d’être utilisée.

3. 10.5. Solution d’étalonnage, 5 μg/ml (diclazuril)

Introduire à la pipette 5,00 ml de solution étalon de diclazuril (point 3.8.2) et 2,00 ml de solution de l’étalon interne (point 3.9.2) dans une fiole jaugée de 50 ml. Ajouter 13 ml de DMF (point 3.6), ajuster au trait de jauge avec de l’eau (point 3.1) et mélanger. Cette solution doit être préparée peu avant d’être utilisée.

NB: Les solutions d’étalonnage (points 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 et 3.10.5) sont valables pour une concentration de diclazuril dans les aliments comprise entre 0,5 et 2,5 mg/kg lorsqu’on utilise le présent protocole.

3. 11. Cartouche C18 pour extraction en phase solide, par exemple Mega Bond Elut, taille: 20 cc, masse de sorption: 5 000 mg (préconditionnement suivant les directives du fournisseur).

3. 12. Solvant d’extraction: méthanol acidifié

Introduire à la pipette 5,0 ml d’acide chlorhydrique (point 3.7) dans 1 000 ml de méthanol (point 3.5) et mélanger.

3. 13. Phase mobile pour CLHP.

3. 13.1. Éluant A: acétate d’ammonium — solution d’hydrogénosulfate de tétrabutylammonium.

Dissoudre 5 g d’acétate d’ammonium (point 3.2) et 3,4 g de TBHS (point 3.3) dans 1 000 ml d’eau (point 3.1) et mélanger.

3. 13.2. Éluant B: acétonitrile (point 3.4).

3. 13.3. Éluant C: méthanol (point 3.5).

4. Appareillage

4. 1. Agitateur mécanique.

4. 2. Équipement pour CLHP à gradients ternaires.

4. 2.1. Colonne pour chromatographie en phase liquide, remplie d’Hypersil ODS de 3 μm, 100 mm × 4,6 mm, ou équivalent.

4. 2.2. Détecteur UV de longueur d’onde variable ou détecteur à barrettes de diodes.

4. 3. Évaporateur rotatif.

4. 4. Filtre à membrane (par exemple du nylon résistant aux substances chimiques) de 0,45 μm.

4. 5. Seringue jetable de 5 ml.

4. 6. Distributeur à vide.

4. 7. Bain ultrasonique.

5. Mode opératoire

5. 1. Généralités

5. 1.1. Aliment blanc

Analyser un aliment blanc pour vérifier l’absence de diclazuril ou de substances interférentes. L’aliment blanc doit être du même type que celui de l’échantillon; il ne doit être détecté ni diclazuril ni substances interférentes.

5. 1.2. Test de récupération

Effectuer un test de récupération par analyse de l’aliment blanc auquel a été ajoutée une quantité de diclazuril pareille à celle présente dans l’échantillon. Pour obtenir une concentration de 1 mg/kg, ajouter 0,1 ml de la solution mère de l’étalon (point 3.8.1) à 50 g de l’aliment blanc, mélanger soigneusement et laisser reposer 10 minutes, mélanger de nouveau plusieurs fois avant de procéder à l’extraction (point 5.2).

En l’absence d’aliment blanc de même type que celui de l’échantillon (voir le point 5.1.1), le test de récupération peut être effectué selon la méthode par addition de l’étalon. Dans ce cas, l’échantillon à analyser est supplémenté d’une quantité de diclazuril semblable à celle déjà présente dans l’échantillon. Cet échantillon est analysé avec l’échantillon non supplémenté et la récupération peut être calculée par différence.

5. 2. Extraction

5. 2.1. Aliments composés pour animaux

Peser, à 0,01 g près, environ 50 g de l’échantillon. Transférer dans une fiole erlenmeyer de 500 ml, ajouter 1,00 ml de la solution de l’étalon interne (point 3.9.2), 200 ml du solvant d’extraction (point 3.12) et boucher la fiole. Secouer le mélange sur l’agitateur (point 4.1) pendant une nuit. Laisser déposer pendant 10 minutes. Transférer une partie aliquote de 20 ml du surnageant dans un récipient en verre approprié et diluer dans 20 ml d’eau (point 3.1). Transférer cette solution dans une cartouche à extraction (point 3.11) et filtrer sous vide (point 4.6). Laver la cartouche à l’aide de 25 ml du mélange de solvant d’extraction (point 3.12) et d’eau (point 3.1), 65 + 35 (V + V). Éliminer les fractions collectées et éluer les composés à l’aide de 25 ml d’un mélange de solvant d’extraction (point 3.12) et d’eau, 80 + 20 (V + V). Évaporer cette fraction jusqu’à ce qu’elle commence à sécher au moyen d’un évaporateur rotatif (point 4.3) à 60 °C. Dissoudre le résidu dans 1,0 ml de DMF (point 3.6), ajouter 1,5 ml d’eau (point 3.1) et mélanger. Faire passer dans un filtre à membrane (point 4.4) monté sur une seringue jetable (point 4.5). Procéder au dosage par CLHP (point 5.3).

5. 2.2. Prémélanges

Peser, à 0,001 g près, environ 1 g de l’échantillon. Transférer dans une fiole erlenmeyer de 500 ml, ajouter 1,00 ml de la solution de l’étalon interne (point 3.9.3), 200 ml du solvant d’extraction (point 3.12) et boucher la fiole. Passer le mélange à l’agitateur (point 4.1) pendant une nuit. Laisser déposer pendant 10 minutes. Transférer une partie aliquote de 10 000/p ml (p = teneur nominale du prémélange en diclazuril en mg/kg) du surnageant dans un ballon à fond rond de dimension appropriée. Évaporer ce mélange jusqu’à ce qu’il commence à sécher, sous une pression réduite et à 60 °C au moyen d’un évaporateur rotatif (point 4.3). Redissoudre le résidu dans 10,0 ml de DMF (point 3.6), ajouter 15,0 ml d’eau (point 3.1) et mélanger. Procéder au dosage par CLHP (point 5.3).

5. 3. Dosage par CLHP

5. 3.1. Paramètres

Les conditions suivantes sont proposées à titre indicatif, d’autres conditions peuvent être appliquées si elles donnent des résultats équivalents ou meilleurs.

— Colonne de chromatographie liquide (point 4.2.1): 100 mm × 4,6 mm, remplie d’Hypersil ODS de 3 μm, ou équivalent

— Phase mobile:

— Éluant A (point 3.13.1): solution aqueuse d’acétate d’ammonium et d’hydrogénosulfate de tétrabutylammonium

— Éluant B (point 3.13.2): acétonitrile

— Éluant C (point 3.13.3): méthanol

— Mode d’élution — gradient linéaire

— Conditions initiales: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)

— Au bout de 10 minutes, élution par gradient pendant 30 min jusqu’à: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V)

— Ensuite, rincer avec B pendant 10 minutes

— Débit: 1,5-2 ml/min

— Volume d’injection: 20 μl

— Longueur d’onde de détection: 280 nm

Vérifier la stabilité du système chromatographique en injectant plusieurs fois la solution d’étalonnage (point 3.10.2) contenant 2 μg/ml de diclazuril et d’étalon interne jusqu’à obtention de hauteurs de pic et de temps de rétention constants.

5. 3.2. Analyse chromatographique des solutions d’étalonnage

Injecter deux fois 20 μl de chaque solution d’étalonnage (points 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 et 3.10.5), identifier et intégrer les pics du diclazuril et de l’étalon interne; tracer la courbe d’étalonnage en utilisant le rapport entre la hauteur ou surface moyenne des pics du diclazuril et la hauteur ou surface moyenne des pics de l’étalon interne en ordonnée et versus en abscisse la concentration de diclazuril dans les solutions d’étalonnage (μg/ml).

5. 3.3. Analyse chromatographique des solutions des échantillons

Injecter 20 μl de la solution d’échantillon (point 5.2.1 ou 5.2.2) deux fois et déterminer la hauteur ou surface moyenne des pics du diclazuril et de l’étalon interne.

6. Calcul des résultats

6. 1. Aliments composés pour animaux

La teneur en diclazuril w (en mg/kg) de l’échantillon est donnée par la formule suivante:

wHeightd,sHeighti,s– ba×10Vm ou wAread,sAreai,s– ba×10Vm

où:

— Hauteur(d,s) est la hauteur du pic de diclazuril dans la solution d’échantillon (point 5.2.1)

— Surface(d,s) est la surface du pic de diclazuril dans la solution d’échantillon (point 5.2.1)

— Hauteur(i,s) est la hauteur du pic de l’étalon interne dans la solution d’échantillon (point 5.2.1)

— Surface(i,s) est la surface du pic de l’étalon interne dans la solution d’échantillon (point 5.2.1)

— b est l’ordonnée à l’origine de la courbe d’étalonnage tracée à partir des solutions d’étalonnage (points 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 et 3.10.5) conformément au point 5.3.2

— a est la pente de la courbe d’étalonnage tracée à partir des solutions d’étalonnage (points 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 et 3.10.5) conformément au point 5.3.2

— m est la masse de la prise d’essai, en grammes

— V est le volume final, en millilitres, de l’extrait d’échantillon après une deuxième dissolution conformément au point 5.2.1 (soit 2,5 ml)

6. 2. Prémélanges

La teneur en diclazuril w (en mg/kg) de l’échantillon est donnée par la formule suivante:

wHeightd,sHeighti,s – ba×0.02Vm × p ou wAread,sAreai,s – ba×0.02Vm× p

où:

— Hauteur(d,s) est la hauteur du pic de diclazuril dans la solution d’échantillon (point 5.2.2)

— Surface(d,s) est la surface du pic de diclazuril dans la solution d’échantillon (point 5.2.2)

— Hauteur(i,s) est la hauteur du pic de l’étalon interne dans la solution d’échantillon (point 5.2.2)

— Surface(i,s) est la surface du pic de l’étalon interne dans la solution d’échantillon (point 5.2.2)

— b est l’ordonnée à l’origine de la courbe d’étalonnage tracée à partir des solutions d’étalonnage (points 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 et 3.10.5) conformément au point 5.3.2

— a est la pente de la courbe d’étalonnage tracée à partir des solutions d’étalonnage (points 3.10.1, 3.10.2, 3.10.3, 3.10.4 et 3.10.5) conformément au point 5.3.2

— m est la masse de la prise d’essai, en grammes

— V est le volume final, en millilitres, de l’extrait d’échantillon après une deuxième dissolution conformément au point 5.2.2 (soit 25 ml)

— p est la teneur nominale en diclazuril du prémélange, en mg/kg

7. Validation des résultats

7. 1. Identité

L’identité de l’analyte peut être confirmée par cochromatographie ou à l’aide d’un détecteur à barrettes de diodes qui permet de comparer les spectres de l’extrait d’échantillon (point 5.2.1 ou 5.2.2) et de la solution d’étalonnage (point 3.10.2).

7. 1.1. Cochromatographie

Un extrait d’échantillon (point 5.2.1 ou 5.2.2) est additionné d’une quantité appropriée de la solution d’étalonnage (point 3.10.2). La quantité de diclazuril ajoutée doit être semblable à la quantité de diclazuril constatée dans l’extrait d’échantillon.

Seule la hauteur du pic du diclazuril et du pic de l’étalon interne doit être augmentée, compte tenu à la fois de la quantité ajoutée et de la dilution de l’extrait. La largeur du pic à mi-hauteur doit se situer à ± 10 % de la largeur initiale du pic du diclazuril ou du pic de l’étalon interne de l’extrait d’échantillon non supplémenté.

7. 1.2. Détection par barrettes de diodes

Évaluer les résultats conformément aux critères suivants:

a) les longueurs d’onde d’absorption maximale des spectres de l’échantillon et de l’étalon, enregistrées au sommet des pics sur le chromatogramme, doivent être identiques, dans une marge déterminée par le pouvoir de résolution du système de détection. Dans le cadre d’une détection par barrettes de diodes, elle est généralement de ± 2 nm;

b) entre 230 et 320 nm, les spectres de l’échantillon et de l’étalon enregistrés au sommet du pic sur le chromatogramme ne doivent pas être différents pour les parties du spectre situées entre 10 et 100 % de l’absorbance relative. Ce critère est rempli lorsque les mêmes maxima sont présents et que, en aucun point, l’écart observé entre les deux spectres ne dépasse 15 % de l’absorbance de l’analyte étalon;

c) entre 230 en 320 nm, les spectres de la courbe ascendante, du sommet et de la courbe descendante du pic produits par l’extrait d’échantillon ne doivent pas être différents les uns des autres pour les parties du spectre situées entre 10 et 100 % de l’absorbance relative. Ce critère est rempli lorsque les mêmes maxima sont présents et que, en aucun point, l’écart observé entre les spectres ne dépasse 15 % de l’absorbance du spectre au sommet du pic.

Si l’un de ces critères n’est pas rempli, la présence de l’analyte n’est pas confirmée.

7. 2. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux mesures indépendantes effectuées sur deux sous-échantillons ne peut dépasser:

— 30 % du résultat supérieur pour les teneurs en diclazuril comprises entre 0,5 et 2,5 mg/kg,

— 0,75 mg/kg pour les teneurs en diclazuril comprises entre 2,5 et 5 mg/kg,

— 15 % du résultat supérieur pour les teneurs en diclazuril supérieures à 5 mg/kg.

7. 3. Récupération

Pour un échantillon (blanc) supplémenté, la récupération doit être de 80 % au moins.

8. Résultats d’une étude collaborative

Deux études collaboratives ont été organisées. Dans le cadre de la première, effectuée par un autre groupe de laboratoires en 1994, les analyses ont porté sur les échantillons de deux prémélanges (O 100 et A 100) et sur trois échantillons d’aliments complémentaires pour volaille (L1, Z1 et K1). L’un des échantillons de prémélange a été mélangé à une matrice organique (O 100) et l’autre à une matrice inorganique (A 100). La teneur théorique est de 100 mg de diclazuril par kg. Les laboratoires avaient pour instruction d’analyser chacun des échantillons une seule fois ou en double (des informations plus détaillées sur la première étude collaborative ont été publiées dans le Journal of AOAC International, volume 77, no 6, 1994, p. 1359-1361).

Les analyses effectuées dans le cadre de la deuxième étude collaborative ont porté sur trois aliments composés destinés à la volaille, dont deux aliments contenant du diclazuril à des concentrations de 0,9 mg/kg (MAT 1) et de 1,5 mg/kg (MAT 2) et un aliment témoin (MAT 3). Des informations détaillées sur la deuxième étude ont été publiées dans le rapport technique du JRC (en 2016) et dans le Journal of AOAC International, volume 102, no 2, 2019, p. 646-652). Les résultats des deux études collaboratives figurent dans le tableau ci-après.

L = nombre de laboratoires

n = nombre de valeurs individuelles

Sr = écart type de répétabilité

CVr = coefficient de variation de la répétabilité

SR = écart type de reproductibilité

CVR = coefficient de variation de la reproductibilité

LQ = limite de quantification

| | Échantillon 1A 100 | Échantillon 2O 100 | Échantillon 3 L1 | Échantillon 4 Z1 | Échantillon 5 K1 |

Échantillon 6

MAT 1

|

Échantillon 7

MAT 2

|

Échantillon 8

MAT 3

| L | 11 | 11 | 11 | 11 | 6 | 10 | 9 | 10

| n | 19 | 18 | 19 | 19 | 12 | 20 | 18 | 10

| Moyenne (mg/kg) | 100,8 | 103,5 | 0,89 | 1,15 | 0,89 | 1,0 | 1,5 | < LQ

| Sr (mg/kg) | 5,88 | 7,64 | 0,15 | 0,02 | 0,03 | 0,11 | 0,07 | —

| CVr (%) | 5,83 | 7,38 | 17,32 | 1,92 | 3,34 | 11,2 | 4,5 | —

| SR (mg/kg) | 7,59 | 7,64 | 0,17 | 0,11 | 0,12 | 0,18 | 0,21 | —

| CVR (%) | 7,53 | 7,38 | 18,61 | 9,67 | 13,65 | 18,1 | 14,3 | —

| Teneur nominale (mg/kg) | 100 | 100 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 0,9 | 1,5 | —

| Référence | 1re étude de 1 994 | 1re étude de 1 994 | 1re étude de 1 994 | 1re étude de 1 994 | 1re étude de 1 994 | 2e étude de 2 015 | 2e étude de 2 015 | 2e étude de 2 015

9. Remarques générales

Il doit être préalablement démontré que la réaction du diclazuril est linéaire sur toute la gamme des concentrations mesurées.

La méthode d’analyse peut être remplacée, au moins pour l’analyse du diclazuril dans les aliments composés à forte teneur en matières grasses (excédant 12 % dans ce cas), par d’autres méthodes basées sur la CLHP, par exemple une méthode basée sur la chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (CLHP-SM), à condition que la méthode de remplacement ait des caractéristiques équivalentes en matière de performances (taux de récupération, précision dans les conditions de répétabilité et de reproductibilité).

G. DOSAGE DU LASALOCIDE-SODIUM

Sel sodique de polyéther de l’acide monocarboxylique, produit par Streptomyces lasaliensis

Le lasolocide-sodium doit être dosé:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17299 «Aliments pour animaux — méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Recherche et dosage dans des aliments composés pour animaux des coccidiostatiques autorisés au taux d’additif et de contamination croisée à 1 % et 3 %, de coccidiostatiques non enregistrés et d’un antibiotique aux taux sub-additifs, par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)» ou

— par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) en phase inverse à l’aide d’un détecteur spectrofluorométrique (spectrométrie de fluorescence), conformément aux points 1 à 8.

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en lasalocide-sodium des aliments pour animaux. La limite de détection est de 5 mg/kg; la limite de quantification est de 10 mg/kg.

2. Principe

Le lasalocide-sodium est extrait d’échantillon par du méthanol acidifié et dosé par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) en phase inverse à l’aide d’un détecteur spectrofluorimétrique (spectrométrie de fluorescence).

3. Réactifs

3. 1. Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4).

3. 2. Acide orthophosphorique, p (p/p) = 85 %.

3. 3. Solution d’acide orthophosphorique, c = 20 %

Diluer 23,5 ml d’acide orthophosphorique (point 3.2) dans de l’eau et ajuster à 100 ml.

3. 4. 6-méthyl-2-heptylamine (1,5-diméthylhexylamine), p (p/p) = 99 %.

3. 5. Méthanol, de qualité CLHP.

3. 6. Acide chlorhydrique, densité = 1,19 g/ml.

3. 7. Solution tampon de phosphate, c = 0,01 mol/l

Dissoudre 1,36 g de KH2PO4 (point 3.1) dans 500 ml d’eau (point 3.11), ajouter 3,5 ml d’acide orthophosphorique (point 3.2) et 10,0 ml de 6-méthyl-2-heptylamine (point 3.4). Ajuster le pH à 4,0 à l’aide de la solution d’acide orthophosphorique (point 3.3), diluer à l’eau et ajuster à 1 000 ml (point 3.11).

3. 8. Méthanol acidifié

Transférer 5,0 ml d’acide chlorhydrique (point 3.6) dans une fiole jaugée de 1 000 ml, ajuster au trait de jauge avec du méthanol (point 3.5) et mélanger. Cette solution doit être préparée peu avant d’être utilisée.

3. 9. Phase mobile pour CLHP, solution tampon de phosphate et méthanol 5 + 95 (V + V)

Mélanger 5 ml de solution tampon de phosphate (point 3.7) avec 95 ml de méthanol (point 3.5).

3. 10. Substance étalon: lasalocide-sodium garanti pur, C34H53O8Na (sel sodique de polyéther de l’acide monocarboxylique, produit par Streptomyces lasaliensis), E763.

3. 10.1. Solution mère étalon de lasalocide-sodium, 500 μg/ml

Peser, à 0,1 mg près, 50 mg de lasalocide-sodium (point 3.10) dans une fiole jaugée de 100 ml, dissoudre dans du méthanol acidifié (point 3.8), ajuster au trait de jauge avec le même solvant et mélanger. Cette solution doit être préparée peu avant d’être utilisée.

3. 10.2. Solution étalon intermédiaire de lasalocide-sodium, 50 μg/ml

Introduire à la pipette 10,0 ml de la solution mère de l’étalon (point 3.10.1) dans une fiole jaugée de 100 ml, ajuster au trait de jauge avec du méthanol acidifié (point 3.8) et mélanger. Cette solution doit être préparée peu avant d’être utilisée.

3. 10.3. Solutions d’étalonnage

Transférer 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 et 10,0 ml de la solution étalon intermédiaire (point 3.10.2) dans une série de fioles jaugées de 50 ml. Ajuster au trait de jauge avec du méthanol acidifié (point 3.8) et mélanger. Ces solutions correspondent respectivement à 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 et 10,0 μg de lasalocide-sodium par ml. Ces solutions doivent être préparées peu avant d’être utilisées.

3. 11. Eau, de qualité CLHP.

4. Appareillage

4. 1. Bain ultrasonique (ou bain-marie vibrant) avec réglage de température.

4. 2. Filtres à membrane, 0,45 μm.

4. 3. Équipement CLHP avec système à injection permettant d’injecter des volumes de 20 μl.

4. 3.1. Colonne de chromatographie liquide, 125 mm × 4 mm, en phase inverse C18, particules de 5 μm, ou équivalent.

4. 3.2. Spectrofluorimètre avec correction des longueurs d’onde variables (sollicitation et émission).

5. Mode opératoire

5. 1. Généralités

5. 1.1. Aliment blanc

Pour procéder au test de récupération (point 5.1.2), analyser un aliment blanc pour vérifier l’absence de lasalocide-sodium ou de substances interférentes. L’aliment blanc doit être du même type que celui de l’échantillon; il ne doit être détecté ni lasalocide-sodium ni substances interférentes.

5. 1.2. Test de récupération

Effectuer un test de récupération par analyse de l’aliment blanc auquel a été ajoutée une quantité de lasalocide-sodium pareille à celle présente dans l’échantillon. Pour obtenir une concentration de 100 mg/kg, transférer 10,0 ml de la solution mère de l’étalon (point 3.10.1) dans une fiole erlenmeyer de 250 ml et concentrer la solution par évaporation à environ 0,5 ml. Ajouter 50 g de l’aliment blanc, mélanger soigneusement et laisser reposer 10 minutes tout en mélangeant de nouveau plusieurs fois avant de procéder à l’extraction (point 5.2).

En l’absence d’aliment blanc de même type que celui de l’échantillon (voir le point 5.1.1), le test de récupération peut être effectué selon la méthode par addition de l’étalon. Dans ce cas, l’échantillon à analyser est supplémenté par ajout d’une quantité de lasalocide-sodium semblable à celle déjà présente dans l’échantillon. Celui-ci est analysé avec l’échantillon non supplémenté et la récupération peut être calculée par différence.

5. 2. Extraction

5. 2.1. Aliments pour animaux

Peser, à 0,01 g près, de 5 g à 10 g de l’échantillon dans une fiole erlenmeyer de 250 ml avec bouchon. Y introduire à la pipette 100,0 ml de méthanol acidifié (point 3.8). Boucher légèrement et agiter pour obtenir une dispersion. Placer la fiole dans le bain ultrasonique (point 4.1) à 40 °C environ pendant 20 minutes, l’enlever et laisser refroidir à température ambiante. Laisser reposer pendant une heure environ, jusqu’à décantation des matières en suspension, et filtrer une partie aliquote sur un filtre à membrane de 0,45 μm (point 4.2) dans un récipient approprié. Procéder au dosage par CLHP (point 5.3).

5. 2.2. Prémélanges

Peser, à 0,001 g près, 2 g de prémélange non broyé dans une fiole jaugée de 250 ml. Ajouter 100,0 ml de méthanol acidifié (point 3.8) et agiter pour obtenir une dispersion. Placer la fiole dans le bain ultrasonique (point 4.1) à 40 °C environ pendant 20 minutes, l’enlever et laisser refroidir à température ambiante. Diluer jusqu’au trait de jauge avec du méthanol acidifié (point 3.8) et mélanger soigneusement. Laisser reposer pendant une heure, jusqu’à décantation des matières en suspension et filtrer une partie aliquote sur un filtre à membrane de 0,45 μm (point 4.2). Diluer un volume adéquat de filtrat clair avec du méthanol acidifié (point 3.8), de manière à obtenir une solution d’essai finale contenant environ 4 μg/ml de lasalocide-sodium. Procéder au dosage par CLHP (point 5.3).

5. 3. Dosage par CLHP

5. 3.1. Paramètres

Les conditions suivantes sont proposées à titre indicatif; d’autres conditions peuvent être appliquées si elles donnent des résultats équivalents:

| Colonne de chromatographie liquide (point 4.3.1): | 125 mm × 4 mm, en phase inverse, C18, particules de 5 μm, ou équivalent

| Phase mobile (point 3.9): | Mélange de solution tampon dephosphate (point 3.7) et de méthanol (point 3.5), 5 + 95 (V+V)

| Débit: | 1,2 ml/min

| Longueurs d’onde de détection: | Sollicitation: 310 nm

| | Émission: 419 nm

| Volume d’injection: | 20 μl

Contrôler la stabilité du système chromatographique, en injectant plusieurs fois la solution d’étalonnage (point 3.10.3) à 4,0 μg/ml, jusqu’à l’obtention de surfaces ou de hauteurs de pics et de temps de rétention constants.

5. 3.2. Courbe d’étalonnage

Injecter chaque solution d’étalonnage (point 3.10.3) plusieurs fois et déterminer les hauteurs (surfaces) moyennes des pics pour chaque concentration. Établir une courbe d’étalonnage en utilisant les hauteurs (surfaces) moyennes des pics des solutions d’étalonnage comme ordonnées et les concentrations correspondantes en μg/ml comme abscisses.

5. 3.3. Solution d’échantillon

Injecter l’extrait d’échantillon (obtenu conformément au point 5.2.1 ou 5.2.2) plusieurs fois en utilisant le même volume que celui retenu pour la solution d’étalonnage et déterminer les hauteurs (surfaces) moyennes des pics du lasalocide-sodium.

6. Calcul des résultats

À partir de la hauteur (surface) moyenne des pics du lasalocide-sodium de la solution d’échantillon (point 5.3.3), déterminer la concentration de lasalocide-sodium (μg/ml) par référence à la courbe d’étalonnage.

6. 1. Aliments pour animaux

La teneur w en lasalocide-sodium, exprimée en mg/kg de l’échantillon, est donnée par la formule suivante:

wc × V1mmgkg

où:

cconcentration de lasalocide-sodium dans la solution d’échantillon (point 5.2.1) en μg/ml,

V1volume de l’extrait d’échantillon selon le point 5.2.1 en ml (soit 100),

mpoids de la prise d’essai, en grammes.

6. 2. Prémélanges

La teneur w en lasalocide-sodium, exprimée en mg/kg de l’échantillon, est donnée par la formule suivante:

wc × V2. × fmmgkg

où:

cconcentration de lasalocide-sodium dans la solution d’échantillon (point 5.2.2) en μg/ml,

V2volume de l’extrait d’échantillon selon le point 5.2.2 en ml (soit 250),

ffacteur de dilution selon le point 5.2.2,

mpoids de la prise d’essai, en grammes.

7. Validation des résultats

7. 1. Identité

Les méthodes fondées sur la spectrofluorimétrie sont moins sujettes aux interférences que celles qui utilisent un détecteur UV. L’identité de l’analyte peut être confirmée par cochromatographie.

7. 1.1. Cochromatographie

Un extrait d’échantillon (point 5.2.1 ou 5.2.2) est additionné d’une quantité appropriée de la solution d’étalonnage (point 3.10.3). La quantité de lasalocide-sodium ajoutée doit être semblable à la quantité de lasalocide-sodium constatée dans l’extrait d’échantillon. Seule la hauteur du pic du lasalocide-sodium doit être augmentée, compte tenu de la quantité ajoutée et de la dilution de l’extrait. La largeur du pic à mi-hauteur doit se situer à ± 10 % de la largeur initiale du pic de lasalocide-sodium de l’extrait d’échantillon non supplémenté.

7. 2. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser:

— 15 % du résultat supérieur pour les teneurs en lasalocide-sodium comprises entre 30 mg/kg et 100 mg/kg,

— 15 mg/kg pour les teneurs en lasalocide-sodium comprises entre 100 mg/kg et 200 mg/kg,

— 7,5 % du résultat supérieur pour les teneurs en lasalocide-sodium supérieures à 200 mg/kg.

7. 3. Récupération

Pour les échantillons d’aliments pour animaux (blancs) supplémentés, la récupération doit être de 80 % au minimum. Pour les échantillons de prémélanges supplémentés, la récupération doit être de 90 % au minimum.

8. Résultats d’une étude collaborative

Dans le cadre d’une étude collaborative, 2 prémélanges (échantillons 1 et 2) et 5 aliments (échantillons 3-7) ont été analysés par 12 laboratoires. Pour chaque échantillon, les analyses ont été effectuées en double. Les résultats de l’étude figurent dans le tableau ci-après:

L= nombre de laboratoires

n= nombre de valeurs individuelles

sr= écart type de répétabilité

sR= écart type de reproductibilité

CVr= coefficient de variation de la répétabilité (%)

CVR= coefficient de variation de la reproductibilité (%)

| |

Échant. 1

Prémél. poulets

|

Échant. 2

Prémél. dindes

|

Échant. 3

Granulés dindes

|

Échant. 4

Miettes poulets

|

Échant. 5

Aliment dindes

|

Échant. 6

Aliment volaille A

|

Échant. 7

Aliment volaille B

| L | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12

| n | 23 | 23 | 23 | 23 | 23 | 23 | 23

| Moyenne [mg/kg] | 5 050 | 16 200 | 76,5 | 78,4 | 92,9 | 48,3 | 32,6

| sr [mg/kg] | 107 | 408 | 1,71 | 2,23 | 2,27 | 1,93 | 1,75

| CVr [%] | 2,12 | 2,52 | 2,24 | 2,84 | 2,44 | 4,00 | 5,37

| sR [mg/kg] | 286 | 883 | 3,85 | 7,32 | 5,29 | 3,47 | 3,49

| CVR [%] | 5,66 | 5,45 | 5,03 | 9,34 | 5,69 | 7,18 | 10,70

| Teneur nominale [mg/kg] | 5 000 | 16 000 | 80 | 105 | 120 | 50 | 35

H. DOSAGE DU CHLORHYDRATE D’AMPROLIUM

Chlorhydrate du chlorure de 1-[(4-amino-2-propyl-5-pirimidinyl)méthyl]-2-méthylpyridinium

1. Objet et champ d’application

La méthode permet de déterminer la teneur en amprolium des aliments pour animaux. La limite de détection est de 1 mg/kg et la limite de quantification de 5 mg/kg.

2. Principe

L’échantillon est soumis à une extraction par un mélange méthanol/eau. Après dilution dans une phase mobile et filtration sur membrane, la teneur en amprolium est déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) avec échange de cations à l’aide d’un détecteur UV.

3. Réactifs

3. 1. Méthanol.

3. 2. Acétonitrile, de qualité CLHP.

3. 3. Eau, de qualité CLHP.

3. 4. Solution de phosphate monosodique, c = 0,1 mol/l

Dissoudre 13,80 g de phosphate monosodique monohydraté dans de l’eau (point 3.3) dans une fiole jaugée de 1 000 ml, ajuster au trait de jauge avec de l’eau (point 3.3) et mélanger.

3. 5. Solution de perchlorate de sodium, c = 1,6 mol/l

Dissoudre 224,74 g de perchlorate de sodium monohydraté dans de l’eau (point 3.3) dans une fiole jaugée de 1 000 ml, ajuster au trait de jauge avec de l’eau (point 3.3) et mélanger.

3. 6. Phase mobile pour CLHP (voir le point 9.1)

Mélange d’acétonitrile (point 3.2), de solution de phosphate monosodique (point 3.4) et de solution de perchlorate de sodium (point 3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v) Avant l’emploi, faire passer dans un filtre à membrane de 0,22 μm (point 4.3) et dégazer la solution [par exemple dans un bain ultrasonique (point 4.4) pendant au moins 15 minutes].

3. 7. Substance étalon: amprolium pur, chlorure de 1-[(4-amino-2-propyl-5-pirimidinyl)méthyl]-2-méthylpyridinium, E 750 (voir le point 9.2).

3. 7.1. Solution mère de l’étalon d’amprolium, 500 μg/ml

Peser, à 0,1 mg près, 50 mg d’amprolium (point 3.7) dans une fiole jaugée de 100 ml, dissoudre dans 80 ml de méthanol (point 3.1) et placer la fiole pendant 10 min dans un bain ultrasonique (point 4.4). Après traitement ultrasonique, porter la solution à température ambiante, l’ajuster au trait de jauge avec de l’eau et mélanger. À une température ≤ 4 °C, la solution est stable pendant un mois.

3. 7.2. Solution étalon intermédiaire d’amprolium, 50 μg/ml

Transférer, au moyen d’une pipette, 5,0 ml de la solution mère de l’étalon (point 3.7.1) dans une fiole jaugée de 50 ml, ajuster au trait de jauge avec le solvant d’extraction (point 3.8) et mélanger. À une température ≤ 4 °C, la solution est stable pendant un mois.

3. 7.3. Solutions d’étalonnage

Transférer 0,5, 1,0 et 2,0 ml de la solution étalon intermédiaire (point 3.7.2) dans une série de fioles jaugées de 50 ml. Ajuster au trait de jauge avec la phase mobile (point 3.6) et mélanger. Ces solutions correspondent respectivement à 0,5, 1,0 et 2,0 μg d’amprolium par ml. Ces solutions doivent être préparées peu avant d’être utilisées.

3. 8. Solvant d’extraction

Mélange de méthanol (point 3.1) et d’eau 2 + 1 (v + v).

4. Appareillage

4. 1. Équipement CLHP avec système à injection permettant d’injecter des volumes de 100 μl.

4. 1.1. Colonne pour chromatographie liquide de 125 mm × 4 mm à échange de cations remplie de Nucleosil 10 SA de 5 ou 10 μm, ou équivalent.

4. 1.2. Détecteur UV de longueur d’onde variable ou détecteur à barrettes de diodes.

4. 2. Filtre à membrane en PTFE de 0,45 μm.

4. 3. Filtre à membrane de 0,22 μm.

4. 4. Bain ultrasonique.

4. 5. Agitateur mécanique ou magnétique.

5. Mode opératoire

5. 1. Généralités

5. 1.1. Aliment blanc

Pour procéder au test de récupération (point 5.1.2), analyser un aliment blanc pour vérifier l’absence d’amprolium ou de substances interférentes. L’aliment blanc doit être du même type que celui de l’échantillon; il ne doit être détecté ni amprolium ni substances interférentes.

5. 1.2. Test de récupération

Effectuer un test de récupération par analyse de l’aliment blanc auquel a été ajoutée une quantité d’amprolium pareille à celle présente dans l’échantillon. Pour obtenir une concentration de 100 mg/kg, transférer 10,0 ml de la solution mère de l’étalon (point 3.7.1) dans une fiole erlenmeyer de 250 ml et concentrer la solution par évaporation à environ 0,5 ml. Ajouter 50 g de l’aliment blanc, mélanger soigneusement et attendre 10 minutes tout en mélangeant de nouveau plusieurs fois avant de procéder à l’extraction (point 5.2).

En l’absence d’aliment blanc de même type que celui de l’échantillon (voir le point 5.1.1), le test de récupération peut être effectué selon la méthode par addition de l’étalon. Dans ce cas, l’échantillon à analyser est supplémenté d’une quantité d’amprolium semblable à celle déjà présente dans l’échantillon. Celui-ci est analysé avec l’échantillon non supplémenté et la récupération peut être calculée par différence.

5. 2. Extraction

5. 2.1. Prémélanges (contenu < 1 % d’amprolium) et aliments pour animaux

Peser, à 0,01 g près, de 5 à 40 g de l’échantillon selon sa teneur en amprolium dans une fiole erlenmeyer de 500 ml et ajouter 200 ml de solvant d’extraction (point 3.8). Placer la fiole dans le bain ultrasonique (point 4.4) pendant 15 minutes. Enlever la fiole du bain ultrasonique et la soumettre pendant 1 heure à une agitation mécanique ou magnétique (point 4.5). Diluer une partie aliquote de l’extrait avec la phase mobile (point 3.6) pour obtenir une teneur en amprolium de 0,5 à 2 μg/ml et mélanger (voir observation point 9.3). Filtrer 5 à 10 ml de cette solution diluée sur un filtre à membrane (point 4.2). Procéder au dosage par CLHP (point 5.3).

5. 2.2. Prémélanges (contenu ≥ 1 % d’amprolium)

Peser, à 0,001 g près, de 1 à 4 g du prémélange selon sa teneur en amprolium dans une fiole erlenmeyer de 500 ml et ajouter 200 ml de solvant d’extraction (point 3.8). Placer la fiole dans le bain ultrasonique (point 4.4) pendant 15 minutes. Enlever la fiole du bain ultrasonique et la soumettre pendant 1 heure à une agitation mécanique ou magnétique (point 4.5). Diluer une partie aliquote de l’extrait avec la phase mobile (point 3.6) pour obtenir une teneur en amprolium de 0,5 à 2 μg/ml et mélanger. Filtrer 5 à 10 ml de cette solution diluée sur un filtre à membrane (point 4.2). Procéder au dosage par CLHP (point 5.3).

5. 3. Dosage par CLHP

5. 3.1. Paramètres

Les conditions suivantes sont proposées à titre indicatif, d’autres conditions peuvent être appliquées si elles donnent des résultats équivalents.

| Colonne de chromatographie liquide (point 4.1.1): | 125 mm x 4 mm avec échange de cations avec Nucleosil 10 SA, 5 ou 10 μm, ou équivalent

| Phase mobile (point 3.6): | Mélange d’acétonitrile (point 3.2), de solution de phosphate monosodique (point 3.4) et de solution de perchlorate de sodium (point 3.5), 450 + 450 + 100 (v + v + v)

| Débit: | 0,7-1 ml/min

| Longueur d’onde de détection: | 264 nm

| Volume d’injection: | 100 μl

Vérifier la stabilité du système chromatographique en injectant plusieurs fois la solution d’étalonnage (point 3.7.3) contenant 1,0 μg/ml jusqu’à obtention de hauteurs de pic et de temps de rétention constants.

5. 3.2. Courbe d’étalonnage

Injecter chaque solution d’étalonnage (point 3.7.3) plusieurs fois et déterminer les hauteurs (surfaces) moyennes des pics pour chaque concentration. Tracer la courbe d’étalonnage en portant les hauteurs (surfaces) moyennes des pics des solutions d’étalonnage en ordonnée et les concentrations correspondantes en μg/ml en abscisse.

5. 3.3. Solution d’échantillon

Injecter l’extrait d’échantillon (point 5.2) plusieurs fois en utilisant le même volume que celui retenu pour les solutions d’étalonnage et déterminer la hauteur (surface) moyenne des pics de l’amprolium.

6. Calcul des résultats

À partir de la hauteur (surface) moyenne des pics de l’amprolium de la solution d’échantillon, déterminer la concentration d’amprolium dans cette solution, en μg/ml, par référence à la courbe d’étalonnage (point 5.3.2).

La teneur w en amprolium, exprimée en mg/kg de l’échantillon, est donnée par la formule suivante:

wV × c × fmmgkg

où:

Vvolume du solvant d’extraction (point 3.8) en ml selon le point 5.2 (c’est-à-dire 200 ml),

cconcentration d’amprolium dans l’extrait d’échantillon (point 5.2) en μg/ml,

ffacteur de dilution selon le point 5.2,

mpoids de la prise d’essai, en grammes.

7. Validation des résultats

7. 1. Identité

L’identité de l’analyte peut être confirmée par cochromatographie ou à l’aide d’un détecteur à barrettes de diodes qui permet de comparer les spectres de l’extrait de l’échantillon (point 5.2) et de la solution d’étalonnage (point 3.7.3) contenant 2,0 μg/ml.

7. 1.1. Cochromatographie

Un extrait d’échantillon (point 5.2) est supplémenté par ajout d’une quantité appropriée de la solution d’étalonnage (point 3.7.3). La quantité d’amprolium ajoutée doit être semblable à la quantité d’amprolium constatée dans l’extrait d’échantillon.

Seule la hauteur du pic de l’amprolium doit être augmentée, compte tenu de la quantité ajoutée et de la dilution de l’extrait. La largeur du pic à mi-hauteur doit se situer à ± 10 % de la largeur initiale du pic d’amprolium de l’extrait d’échantillon non supplémenté.

7. 1.2. Détection par barrettes de diodes

Évaluer les résultats conformément aux critères suivants:

a) les longueurs d’onde d’absorption maximale des spectres de l’échantillon et de l’étalon, enregistrées au sommet des pics sur le chromatogramme, doivent être identiques, dans une marge déterminée par le pouvoir de résolution du système de détection. Dans le cadre d’une détection par barrettes de diodes, elle est généralement de ± 2 nm;

b) entre 210 et 320 nm, les spectres de l’échantillon et de l’étalon enregistrés au sommet du pic sur le chromatogramme ne doivent pas être différents pour les parties du spectre situées entre 10 et 100 % de l’absorbance relative. Ce critère est rempli lorsque les mêmes maxima sont présents et que, en aucun point, l’écart observé entre les deux spectres ne dépasse 15 % de l’absorbance de l’analyte étalon;

c) entre 210 et 320 nm, les spectres de la courbe ascendante, du sommet et de la courbe descendante du pic produits par l’extrait d’échantillon ne doivent pas être différents les uns des autres pour les parties du spectre situées entre 10 et 100 % de l’absorbance relative. Ce critère est rempli lorsque les mêmes maxima sont présents et que, en aucun point, l’écart observé entre les spectres ne dépasse 15 % de l’absorbance du spectre au sommet du pic.

Si l’un de ces critères n’est pas rempli, la présence de l’analyte n’est pas confirmée.

7. 2. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles effectués sur le même échantillon ne peut dépasser:

— 15 % du résultat supérieur pour les teneurs en amprolium comprises entre 25 et 500 mg/kg,

— 75 mg/kg pour les teneurs en amprolium comprises entre 500 et 1 000 mg/kg,

— 7,5 % du résultat supérieur pour les teneurs en amprolium supérieures à 1 000 mg/kg.

7. 3. Récupération

Pour un échantillon (blanc) supplémenté, la récupération doit être de 90 % au moins.

8. Résultats d’une étude collaborative

Dans le cadre d’une étude collaborative, trois aliments pour volaille (échantillons 1-3), un aliment minéral (échantillon 4) et un prémélange (échantillon 5) ont été analysés. Les résultats de l’étude figurent dans le tableau ci-après:

L: nombre de laboratoires

n: nombre de valeurs individuelles

sr: écart type de répétabilité

CVr: coefficient de variation de la répétabilité

sR: écart type de reproductibilité

CVR: coefficient de variation de la reproductibilité

| | Échantillon 1 (aliment blanc) | Échantillon 2 | Échantillon 3 | Échantillon 4 | Échantillon 5

| L | 14 | 14 | 14 | 14 | 15

| n | 56 | 56 | 56 | 56 | 60

| Moyenne [mg/kg] | — | 45,5 | 188 | 5 129 | 25 140

| sr [mg/kg] | — | 2,26 | 3,57 | 178 | 550

| CVr [%] | — | 4,95 | 1,90 | 3,46 | 2,20

| sR [mg/kg] | — | 2,95 | 11,8 | 266 | 760

| CVR [%] | — | 6,47 | 6,27 | 5,19 | 3,00

| Teneur nominale [mg/kg] | — | 50 | 200 | 5 000 | 25 000

9. Observations

9. 1. Si l’échantillon contient de la thiamine, le pic de la thiamine dans le chromatogramme apparaît peu avant le pic de l’amprolium. D’après cette méthode, l’amprolium et la thiamine doivent être séparés. Si l’amprolium et la thiamine ne sont pas séparés par la colonne (point 4.1.1) utilisée dans cette méthode, remplacer jusqu’à 50 % de la portion d’acétonitrile de la phase mobile (point 3.6) par du méthanol.

9. 2. Selon la pharmacopée britannique, le spectre de la solution d’amprolium (c = 0,02 mol/l) dans l’acide chlorhydrique (c = 0,1 mol/l) présente des maxima à 246 nm et à 262 nm. L’absorbance sera de 0,84 à 246 nm et de 0,80 à 262 nm.

9. 3. L’extrait doit toujours être dilué avec la phase mobile, faute de quoi le temps de rétention du pic d’amprolium peut changer de façon significative en raison des variations de la force ionique.

I. DOSAGE DE LA NARASINE

La narasine doit être dosée:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17299 «Aliments pour animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Recherche et dosage dans des aliments composés pour animaux des coccidiostatiques autorisés au taux d’additif et de contamination croisée à 1 % et 3 %, de coccidiostatiques non enregistrés et d’un antibiotique aux taux sub-additifs, par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)» ou

— selon la méthode établie par la norme EN ISO 14183 «Aliments des animaux — Détermination des teneurs en monensine, narasine et salinomycine — Méthode par chromatographie liquide utilisant la dérivatisation post-colonne».

J. DOSAGE DE LA NICARBAZINE

La nicarbazine doit être dosée:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17299 «Aliments pour animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Recherche et dosage dans des aliments composés pour animaux des coccidiostatiques autorisés au taux d’additif et de contamination croisée à 1 % et 3 %, de coccidiostatiques non enregistrés et d’un antibiotique aux taux sub-additifs, par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)» ou

— selon la méthode établie par la norme EN 15782 «Aliments des animaux — Détermination de la nicarbazine — Méthode de chromatographie liquide hautes performances».

K. DOSAGE DU DÉCOQUINATE

Le décoquinate doit être dosé:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17299 «Aliments pour animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Recherche et dosage dans des aliments composés pour animaux des coccidiostatiques autorisés au taux d’additif et de contamination croisée à 1 % et 3 %, de coccidiostatiques non enregistrés et d’un antibiotique aux taux sub-additifs, par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)» ou

— selon la méthode établie par la norme EN 16162 «Aliments des animaux — Dosage du décoquinate par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) avec détection par fluorescence».

L. DOSAGE DE LA MONENSINE

La monensine doit être dosée:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17299 «Aliments pour animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Recherche et dosage dans des aliments composés pour animaux des coccidiostatiques autorisés au taux d’additif et de contamination croisée à 1 % et 3 %, de coccidiostatiques non enregistrés et d’un antibiotique aux taux sub-additifs, par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)» ou

— selon la méthode établie par la norme EN ISO 14183 «Aliments des animaux — Détermination des teneurs en monensine, narasine et salinomycine — Méthode par chromatographie liquide utilisant la dérivatisation post-colonne».

M. DOSAGE DE LA SALINOMYCINE

La salinomycine doit être dosée:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17299 «Aliments pour animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Recherche et dosage dans des aliments composés pour animaux des coccidiostatiques autorisés au taux d’additif et de contamination croisée à 1 % et 3 %, de coccidiostatiques non enregistrés et d’un antibiotique aux taux sub-additifs, par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)» ou

— selon la méthode établie par la norme EN ISO 14183 «Aliments des animaux — Détermination des teneurs en monensine, narasine et salinomycine — Méthode par chromatographie liquide utilisant la dérivatisation post-colonne».

N. DOSAGE DE LA SEMDURAMICINE

La semduramicine doit être dosée:

— selon la méthode d’analyse établie par la norme EN 17299 «Aliments pour animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Recherche et dosage dans des aliments composés pour animaux des coccidiostatiques autorisés au taux d’additif et de contamination croisée à 1 % et 3 %, de coccidiostatiques non enregistrés et d’un antibiotique aux taux sub-additifs, par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à une détection par spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)» ou

— selon la méthode établie par la norme EN ISO 16158 «Aliments des animaux — Dosage de la semduramicine — Chromatographie liquide utilisant une approche analytique en arbre».

O. NORMES EN

Les normes EN énumérées ci-après sont à prendre en considération aux fins de l’application de l’article 34, paragraphe 2, point a), du règlement (UE) 2017/625:

EN ISO 30024 «Aliments des animaux — Détermination de l’activité phytasique»

EN 17050 «Aliments des animaux — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Dosage de l’iode dans les aliments pour animaux par spectrométrie de masse à plasma induit par haute fréquence (ICP-MS)»

EN 17550 «Aliments des animaux — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Détermination de la teneur en caroténoïdes des aliments composés et des prémélanges pour animaux par chromatographie liquide à haute performance couplée à une détection UV (CLHP-UV)»

EN 15784 «Aliments des animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Détection et dénombrement des souches de Bacillus spp. utilisées comme additifs pour l’alimentation animale»

EN 15785 «Aliments des animaux — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Isolement et dénombrement du Bifidobacterium spp.»

EN 15786 «Aliments des animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Détection et dénombrement des souches de Pediococcus spp. utilisées comme additifs pour l’alimentation animale»

EN 15787 «Aliments des animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Détection et dénombrement des souches de Lactobacillus spp. utilisées comme additifs pour l’alimentation animale»

EN 15788 «Aliments des animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Détection et dénombrement des souches de Enterococcus (E. faecium) spp. utilisées comme additifs pour l’alimentation animale»

EN 15789 «Aliments des animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Détection et dénombrement des souches de Saccharomyces cerevisiae utilisées comme additifs pour l’alimentation animale»

EN 15510 «Aliments des animaux — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Détermination des teneurs en calcium, sodium, phosphore, magnésium, potassium, fer, zinc, cuivre, manganèse, cobalt, molybdène et plomb par ICP-AES» (pour l’analyse du cobalt et du molybdène en tant qu’additifs pour l’alimentation animale)

EN 15621 «Aliments pour animaux: méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Dosage du calcium, du sodium, du phosphore, du magnésium, du potassium, du soufre, du fer, du zinc, du cuivre, du manganèse et du cobalt après digestion sous pression par ICP-AES» (pour l’analyse du cobalt en tant qu’additif pour l’alimentation animale)

EN 16159 «Aliments pour animaux — Dosage du sélénium par spectrométrie d’absorption atomique par génération d’hydrures (SAAGH) après digestion par micro-ondes (extraction avec de l’acide nitrique à 65 % et du peroxyde d’hydrogène à 30 %)» (pour l’analyse du sélénium en tant qu’additif pour l’alimentation animale)

EN 17053 «Aliments pour animaux — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse — Dosage par ICP-MS (multiméthode) des éléments traces, métaux lourds et autres éléments inorganiques présents dans les aliments» (pour l’analyse du cobalt, du molybdène et du sélénium en tant qu’additifs pour l’alimentation animale).