1. MÉTHODE
1. 1. INTRODUCTION
L'irritation cutanée désigne l'apparition de lésions réversibles de la peau après application d'une substance d'essai pendant une durée pouvant aller jusqu'à 4 heures [selon la définition du système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH)] (1). La présente méthode d'essai propose une procédure in vitro qui, en fonction des informations requises, peut permettre de déterminer le pouvoir d'irritation cutanée des substances et constituer un essai de substitution à part entière, dans le cadre d'une stratégie d'essai fondée sur la force probante des données (2).
Traditionnellement, l’évaluation de l'irritation cutanée impliquait le recours à des animaux de laboratoire (voir méthode B.4) (3). En considération des préoccupations relatives au bien-être des animaux, la méthode B.4 permet de déterminer la corrosion/l'irritation cutanée au moyen d'une stratégie d'essai séquentielle faisant appel à des méthodes d'essai in vitro et ex vivo validées, afin d'éviter de faire souffrir des animaux. Trois méthodes ou lignes directrices d'essai in vitro validées [B.40, B 40 bis et TG 435 (4, 5, 6)] sont utiles pour le volet corrosivité de la stratégie d'essai séquentielle proposée par la méthode B.4.
La présente méthode d'essai s'appuie sur des modèles d'épiderme humain reconstitué qui, par leur conception globale (utilisation de kératinocytes prélevés sur l'épiderme humain en tant que source; tissu et architecture cellulaire représentatifs) reproduisent fidèlement les propriétés biochimiques et physiologiques des couches supérieures de la peau humaine, c'est-à-dire l'épiderme. La procédure décrite dans la présente méthode d'essai permet de caractériser les substances irritantes correspondant à la catégorie de danger 2 selon le SGH des Nations unies. La présente méthode d'essai inclut également une série de normes de performance pour l'évaluation de méthodes d'essai similaires sur épiderme humain reconstitué ou de variantes de ces méthodes (7).
Des études de prévalidation, d'optimisation et de validation ont été réalisées pour deux méthodes d'essai in vitro (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17) disponibles dans le commerce — EpiSkinTM et EpiDermTM –, qui utilisent des modèles d'épiderme humain reconstitué. Ces références ont été fondées sur la phrase de risque R38. Certains aspects de recalcul aux fins du SGH sont abordés dans la référence 25. Les méthodes dont la performance est équivalente à celle d'EpiSkinTM (méthode de référence validée 1) sont recommandées en tant que méthodes d'essai de substitution à part entière pour remplacer l'essai in vivo sur le lapin aux fins de la classification en tant que substance irritante de catégorie 2 selon le SGH. Les méthodes de performance équivalente à celle d'EpiDermTM (méthode de référence validée 2) ne sont recommandées qu'en tant que méthodes d'essai de dépistage, ou dans le cadre d'une stratégie d'essai séquentielle fondée sur la force probante des données, aux fins de la classification en tant que substance irritante de catégorie 2 selon le SGH. Avant de pouvoir utiliser à des fins réglementaires une méthode d'essai in vitro d'évaluation de l'irritation cutanée sur modèle d'épiderme humain reconstitué, il convient de déterminer la fiabilité, la précision et les limitations de cette méthode pour l'usage préconisé, de manière à s'assurer que ces caractéristiques sont comparables à celles de la méthode de référence validée 1, conformément aux normes de performance figurant dans la présente méthode d'essai (appendice).
Deux autres méthodes d'essai in vitro sur modèle d'épiderme humain reconstitué ont été validées conformément aux exigences de la présente méthode d'essai et donnent des résultats similaires à ceux de la méthode de référence validée 1 (18). Il s'agit de la méthode d'essai EpiDermTM modifiée (méthode de référence modifiée 2) et de la méthode d'essai SkinEthic RHETM (méthode réplique 1)
1. 2. DÉFINITIONS
Aux fins de la présente méthode d'essai, les définitions suivantes s'appliquent:
Précision: degré de concordance entre les résultats de la méthode d'essai et les valeurs de référence acceptées. C'est une mesure de la performance de la méthode d'essai et un aspect de la pertinence. Le terme est souvent utilisé de façon interchangeable avec «concordance» pour désigner la proportion de résultats corrects d'une méthode d'essai.
Substance témoin de lot: substance de référence induisant une viabilité cellulaire moyenne du tissu.
Viabilité cellulaire: paramètre mesurant l’activité totale d’une population cellulaire (par exemple, capacité des déshydrogénases mitochondriales cellulaires à réduire le colorant vital MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, bleu de thiazol]), qui, selon l’effet mesuré et le protocole utilisé pour l’essai, correspond au nombre total de cellules vivantes et/ou à la vitalité des cellules.
TE50: temps d'exposition nécessaire pour réduire la viabilité cellulaire de 50 % après application de la substance marqueur à une concentration fixe spécifiée, voir également CI50
Taux de faux négatifs: proportion des substances positives faussement déclarées négatives par une méthode d'essai. C'est un indicateur de la performance de la méthode d'essai.
Taux de faux positifs: proportion des substances négatives (non actives) qui sont faussement déclarées positives. C'est un indicateur de la performance de la méthode d'essai.
Dose infinie: quantité de substance d'essai appliquée sur la peau qui dépasse la quantité requise pour recouvrir entièrement et uniformément la surface la peau.
SGH (système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques): système de classification des substances et des mélanges en fonction de types normalisés et de niveaux de danger physique, sanitaire et environnemental, qui élabore les éléments de communication correspondants tels que pictogrammes, mentions d'avertissement, mentions de danger ou de mise en garde et fiches de sécurité, de manière à fournir des informations sur les effets indésirables des produits dans un souci de protection des personnes (employeurs, travailleurs, transporteurs, consommateurs et services d'intervention d'urgence) et de l'environnement (1); ce système est mis en œuvre dans l'UE par le règlement (CE) no 1272/2008.
CI50: concentration d'une substance marqueur qui réduit la viabilité des tissus de 50 % (CI50) après un temps d'exposition déterminé, voir également TE50.
Normes standard: normes, fondées sur une méthode de référence validée, permettant d'évaluer la comparabilité d'une méthode d'essai proposée qui est structurellement et fonctionnellement similaire. Elles comprennent: I) les éléments essentiels de la méthode d'essai; II) une liste minimale de substances de référence choisies parmi les substances utilisées pour démontrer les performances acceptables de la méthode de référence validée; et III) en fonction des résultats obtenus pour la méthode de référence validée, les niveaux comparables d'exactitude et de fiabilité devant être obtenus pour la méthode d'essai proposée évaluée à l'aide des substances de référence de la liste minimale.
Fiabilité: mesure dans laquelle une méthode d'essai peut être reproduite au fil du temps par un même laboratoire et par plusieurs laboratoires utilisant le même protocole. Elle est évaluée en calculant la reproductibilité intra et interlaboratoire.
Sensibilité: proportion des substances actives/positives correctement classées par l'essai. La sensibilité permet de mesurer la précision d'une méthode d'essai qui donne des résultats relatifs à des catégories, et c'est un aspect important pour l'évaluation de la pertinence d'une méthode d'essai.
Spécificité: proportion des substances inactives/négatives correctement classées par l'essai. La spécificité de mesurer la précision d'une méthode d'essai qui donne des résultats relatifs à des catégories, et c'est un aspect important pour l'évaluation de la pertinence d'une méthode d'essai.
Irritation cutanée: apparition de lésions réversibles sur la peau à la suite de l’application d’une substance d’essai pendant une durée pouvant aller jusqu’à quatre heures. L'irritation cutanée est une réaction locale, non immunogène, qui se manifeste après une stimulation (24). Elle se caractérise essentiellement par un processus réversible impliquant des réactions inflammatoires et par la plupart des signes cliniques caractéristiques de l'irritation (érythème, œdème, démangeaisons et douleur) qui sont associés au processus inflammatoire.
1. 3. CHAMP D'APPLICATION ET LIMITES
Une des limitations des essais sur modèles d'épiderme humain reconstitué relevant de la présente méthode d'essai est qu'ils permettent uniquement la classification des substances dans la catégorie 2 des substances irritantes pour la peau selon le SGH des Nations unies. Comme ils ne permettent pas de classer les substances dans la catégorie facultative 3 définie dans le SGH, toutes les autres substances ne sont pas classées (sans catégorie). En fonction des besoins de réglementation et de l'inclusion ultérieure de nouveaux critères d'évaluation, de l'amélioration ou du développement de nouvelles répliques des essais, une révision de la présente méthode pourra se révéler nécessaire.
La présente méthode d'essai permet de caractériser le danger des substances irritantes à un seul constituant (19), mais elle ne fournit pas d'informations appropriées sur la corrosion cutanée. Les gaz et les aérosols ne peuvent pas être testés, et les mélanges n'ont pas encore fait l'objet d'une étude de validation.
1. 4. PRINCIPE DE L'ESSAI
La substance d'essai est appliquée localement sur un modèle tridimensionnel d'épiderme humain reconstitué, consistant en kératinocytes normaux prélevés sur un épiderme humain et mis en culture pour former un modèle multicouche hautement différencié d'épiderme humain. Il se compose d'une couche basale, d'un stratum spinosum et d'une couche granulaire organisés, ainsi que d'un stratum corneum multicouche contenant des couches lipidiques lamellaires intercellulaires dont la disposition est identique à celle que l'on observe in vivo.
Le principe de l'essai sur modèle d'épiderme humain reconstitué s’appuie sur l'hypothèse selon laquelle les substances irritantes sont capables de pénétrer dans le stratum corneum par diffusion et sont cytotoxiques pour les cellules des couches sous-jacentes. La viabilité cellulaire est mesurée par le virage, obtenu par une déshydrogénase, du colorant vital MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, bleu de thiazol; numéro EINECS 206-069-5, numéro CAS 298-93-1)] en un sel de formazan bleu que l'on mesure quantitativement après extraction des tissus (20). Les substances irritantes sont détectées par leur capacité à abaisser la viabilité cellulaire sous un seuil déterminé (≤ 50 % pour les substances irritantes de catégorie 2 selon le SGH des Nations unies). Les substances qui donnent des viabilités cellulaires supérieures au seuil défini ne seront pas classées (> 50 %, sans catégorie).
Les systèmes de modèles d'épiderme humain reconstitué peuvent être utilisés pour tester des solides, des liquides, des semi-solides et des cires. Les liquides peuvent être aqueux ou non, et les solides peuvent être solubles ou insolubles dans l'eau. Chaque fois que possible, il convient de tester les solides sous la forme d'une poudre fine. Dans la mesure où cinquante-huit substances soigneusement sélectionnées et représentant un large éventail de classes ont été utilisées pour la validation des systèmes d'essai sur modèle d'épiderme humain reconstitué, les méthodes devraient pouvoir être appliquées d'une manière générale à l'ensemble des classes chimiques (16). La validation porte sur treize substances irritantes de catégorie 2 selon le SGH. Acides non corrosifs, bases, sels et autres substances inorganiques non irritantes n'ont pas été inclus dans l'étude de validation. Certaines classes connues de substances irritantes organiques comme les hydroperoxydes, les phénols et les surfactants n'ont pas été inclus non plus, ou alors seulement de façon limitée.
1. 5. DÉMONSTRATION DES COMPÉTENCES
Avant d'appliquer de manière systématique une méthode validée conforme à la présente méthode d'essai, les laboratoires peuvent souhaiter faire la preuve de leur compétence technique à l'aide des dix substances recommandées dans le tableau 1. Dans le cadre de la présente méthode d'essai, la catégorie 3 facultative selon le SGH des Nations unies ne correspond à aucune catégorie. Dans le cas de nouvelles méthodes d'essai similaires (répliques) mises au point conformément à la présente méthode, qui sont structurellement et fonctionnellement similaires aux méthodes de référence validées, ou dans le cas de modifications des méthodes validées, il convient d'utiliser les normes de performance décrites dans l'appendice de la présente méthode d'essai pour démontrer que la nouvelle méthode d'essai a une fiabilité et une précision comparables avant de l'utiliser à des fins réglementaires.
Tableau 1
Substances de vérification, constituant un sous-ensemble des substances de référence énumérées dans l'appendice
| Substance | Numéro CAS | Score in vivo | État physique | Catégorie SGH
| Acide naphtylacétique | 86-87-3 | 0 | S | Sans cat.
| Isopropanol | 67-63-0 | 0,3 | L | Sans cat.
| Stéarate de méthyle | 112-61-8 | 1 | S | Sans cat.
| Butyrate d'heptyle | 5870-93-9 | 1,7 | L | Cat. 3 facultative
| Salicylate d'hexyle | 6259-76-3 | 2 | L | Cat. 3 facultative
| 3-p-cuményl-2-méthylpropionaldéhyde | 103-95-7 | 2,3 | L | Cat. 2
| 1-bromohexane | 111-25-1 | 2,7 | L | Cat. 2
| Méthacrylate de butyle | 97-88-1 | 3 | L | Cat. 2
| 1-méthyl-3-phényl-1-pipérazine | 5271-27-2 | 3,3 | S | Cat. 2
| Heptanal | 111-71-7 | 4 | L | Cat. 2
1. 6. DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Les éléments et le protocole d'un essai d'évaluation de l'irritation cutanée sur modèle d'épiderme humain reconstitué sont décrits ci-après. Le modèle d'épiderme humain reconstitué peut être constitué, préparé ou obtenu dans le commerce (par exemple, les modèles EpiSkin™, EpiDerm™ et SkinEthic RHE™). Les protocoles d'essai standard pour les modèles EpiSkin™, EpiDerm™ et SkinEthic RHE™ peuvent être obtenus à l'adresse suivante: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu](21, 22, 23). Les essais doivent être réalisés comme indiqué ci-après:
1. 6.1. Éléments du modèle d'épiderme humain reconstitué
1. 6.1.1. Conditions générales applicables au modèle
L’épithélium doit être constitué à partir de kératinocytes humains normaux. Plusieurs couches de cellules épithéliales viables (couche basale, stratum spinosum, stratum granulosum) doivent être présentes au-dessous d'un stratum corneum fonctionnel. Le stratum corneum doit comporter plusieurs couches présentant le profil lipidique nécessaire pour constituer une barrière fonctionnelle suffisamment robuste pour résister à la pénétration rapide des substances marqueurs cytotoxiques comme le dodécylsulfate de sodium (SDS) ou le Triton X-100. La fonction de barrière doit être évaluée soit en déterminant la concentration à laquelle une substance marqueur réduit de 50 % la viabilité des tissus (CI50) après un temps d'exposition donné, soit en déterminant le temps d'exposition requis pour réduire la viabilité cellulaire de 50 % (TE50) après application de la substance marqueur à une concentration fixe déterminée. Le modèle doit présenter des propriétés de confinement telles que la substance d’essai ne puisse contourner le stratum corneum pour pénétrer dans les tissus viables, ce qui nuirait à la qualité de la modélisation de l'exposition de la peau. Enfin, le modèle de peau ne doit présenter aucune contamination bactérienne (y compris mycoplasmique), virale ou mycosique.
1. 6.1.2. Conditions applicables au modèle fonctionnel:
1. 6.1.2.1. Viabilité
La viabilité est de préférence mesurée au moyen du colorant MTT (20). Dans ces cas, la densité optique (DO) du colorant (solubilisé) extrait du tissu traité par le témoin négatif (TN) doit être au moins vingt fois supérieure à la DO du solvant d’extraction seul. Le tissu traité par le témoin négatif doit être stable en culture (c’est-à-dire qu’il doit présenter des mesures de viabilité comparables) pendant la durée de la période d’exposition.
1. 6.1.2.2. Fonction de barrière
Le stratum corneum et sa composition lipidique doivent être suffisants pour résister à la pénétration rapide de substances marqueurs cytotoxiques tels que le SDS ou le Triton X-100, évaluée par la CI50 ou le TE50.
1. 6.1.2.3. Morphologie
L'examen histologique de la peau/l'épiderme reconstitué(e) doit être réalisé par un personnel dûment qualifié qui montrera que le modèle présente une structure semblable à celle de la peau/de l'épiderme humain.
1. 6.1.2.4. Reproductibilité
La reproductibilité dans le temps des résultats de la méthode sur un modèle donné doit être démontrée, de préférence à l'aide d'une substance témoin de lot (référence) appropriée (voir appendice).
1. 6.1.2.5. Contrôles de qualité (CQ) du modèle
Chaque lot de modèle d'épiderme utilisé doit satisfaire à certains critères de fabrication dont les plus importants sont ceux relatifs à la viabilité (paragraphe 1.6.1.2.1) et à la fonction de barrière (paragraphe 1.6.1.2.2). Il convient que le fournisseur du modèle de peau (ou l'expérimentateur en cas d'utilisation d'un modèle «maison») définisse une plage de valeurs acceptables (limites inférieure et supérieure) pour la CI50 et le TE50. Les propriétés de barrière des tissus doivent être vérifiées par le laboratoire après réception des tissus. Seuls les résultats obtenus avec des tissus présentant les qualités requises pourront être retenus pour prédire de façon fiable les effets irritants. À titre d'exemple, les plages de valeurs acceptables pour les méthodes de référence validées sont indiquées ci-dessous.
Tableau 2
Exemples de critères de contrôle de qualité des lots
| | Limite inférieure d'acceptation | Moyenne de la plage de valeurs acceptables | Limite supérieure d'acceptation
| Méthode de référence validée 1 (18 heures de traitement par SDS) | CI50 = 1,0 mg/ml | CI50 = 2,32 mg/ml | CI50 = 3,0 mg/ml
| Méthode de référence validée 2 (1 % Triton X100) | TE50 = 4,8 h | TE50 = 6,7 h | TE50 = 8,7 h
1. 6.1.3. Application des substances d’essai et des substances témoins
Un nombre suffisant de tissus (répliques) doit être utilisé pour chaque traitement et pour les témoins (au moins trois répliques par essai). Pour les substances liquides comme pour les substances solides, il convient d'appliquer une quantité suffisante de substance d'essai pour recouvrir uniformément la surface de la peau, sans pour autant utiliser une dose infinie (voir 1.2. Définitions), c'est-à-dire au minimum 25 μL/cm2 ou 25 mg/cm2. Dans le cas de substances solides, il convient d'humidifier la surface de l'épiderme avec de l'eau déionisée ou distillée avant application, afin d'assurer un bon contact avec la peau. Chaque fois que possible, il convient de tester les solides sous la forme d'une poudre fine. À la fin de la période d'exposition, la surface cutanée doit être nettoyée avec soin à l'aide d'un tampon aqueux ou de NaCl à 0,9 %, afin d'éliminer la substance d'essai. En fonction du modèle d'épiderme humain reconstitué utilisé, la période d'exposition peut varier entre 15 et 60 minutes et la température d'incubation entre 20 et 37 °C. Pour de plus amples informations, voir les modes opératoires standard pour les trois méthodes (21, 22, 23).
Des témoins négatifs (TN) et positifs (TP) doivent être utilisés simultanément pour chaque étude afin de démontrer que la viabilité (TN), la fonction de barrière et la sensibilité tissulaire qui en résulte (TP) se situent dans une fourchette historique définie de valeurs acceptables. La substance recommandée en tant que TP est une solution aqueuse de SDS à 5 %. On recommande comme substance TN de l'eau ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
1. 6.1.4. Mesures de la viabilité cellulaire
La condition essentielle du protocole est que les mesures de la viabilité ne soient pas réalisées immédiatement après l'exposition aux substances d'essai, mais après une période d'incubation post-traitement suffisamment longue des tissus rincés dans un milieu frais. Cette période permet non seulement la récupération des tissus après des effets faiblement irritants, mais aussi l'apparition d'effets cytotoxiques manifestes. Durant la phase d'optimisation de l'essai (9, 10, 11, 12, 13), une période d'incubation post-traitement de 42 heures s'est révélée optimale et a donc été utilisée pour la validation des méthodes d'essai de référence.
Le test de virage du MTT est une méthode quantitative validée qui devrait être utilisée pour mesurer la viabilité cellulaire. Elle est compatible avec une utilisation sur un modèle tissulaire tridimensionnel. L’échantillon de peau est placé dans une solution MTT à la concentration appropriée (par exemple, 0,3-1 mg/ml) pendant 3 heures. Le précipité bleu de formazan est ensuite extrait à l’aide d’un solvant (isopropanol), et l'on mesure la concentration du formazan en déterminant sa DO à 570 nm avec une bande passante de ±30 nm au maximum.
Les propriétés optiques de la substance d'essai ou son action chimique sur le MTT sont susceptibles d'interférer avec la détermination et de conduire à une estimation erronée de la viabilité (car la substance d'essai peut aussi bien inhiber ou faire disparaître la coloration que la provoquer). Cela peut survenir lorsque la substance d'essai n'a pas été totalement éliminée de la peau par rinçage ou lorsqu'elle a pénétré dans l'épiderme. Si la substance d'essai agit directement sur le MTT, si elle est naturellement colorée ou si elle se colore durant le traitement du tissu, des contrôles supplémentaires doivent être pratiqués pour détecter et corriger les interférences de la substance d'essai avec la mesure de la viabilité. Pour de plus amples précisions sur la manière de tester la réduction directe du MTT, veuillez consulter le protocole des méthodes de référence validées (21, 22, 23). Une coloration non spécifique (CNS) dues à ces interférences ne doit pas dépasser 30 % des TN (pour les corrections). Si CNS > 30 %, la substance d'essai est considérée comme incompatible avec l'essai.
1. 6.1.5. Critères d'acceptabilité des déterminations
Pour chaque détermination réalisée sur des lots valables (voir paragraphe 1.6.1.2.5), les tissus traités par le témoin négatif (TN) doivent présenter une DO rendant compte de la qualité des tissus ayant été soumis à toutes les étapes d'expédition et de réception et à l'intégralité du protocole d'irritation. Les valeurs de DO des témoins ne doivent pas être inférieures aux limites inférieures historiques. De la même façon, les résultats obtenus pour les tissus traités par le témoin positif (TP), c'est-à-dire la solution aqueuse de SDS à 5 %, doivent rendre compte de la sensibilité conservée par les tissus et de leur capacité à réagir à une substance irritante dans les conditions de chaque détermination (par exemple, viabilité ≤ 40 % pour la méthode de référence validée 1 et ≤ 20 % pour la méthode de référence validée 2). Il y a lieu de définir les mesures associées et appropriées de la variabilité entre les répliques de tissu (par exemple, si l'écart-type est utilisé, il doit être ≤ 18 %).
2. RÉSULTATS
2. 1. RÉSULTATS
Pour chaque traitement, il convient de présenter, sous forme de tableau, les résultats obtenus pour chaque échantillon de tissu (par exemple, les valeurs de DO et le pourcentage de viabilité cellulaire calculé pour chaque substance d'essai, ainsi que la classification correspondante), y compris les résultats obtenus, le cas échéant, en reproduisant les expériences. Pour chaque essai, on précisera en outre les valeurs moyennes ± écart-type. Les interactions observées entre le réactif MTT et les substances d'essai colorées seront signalées pour chaque substance testée.
2. 2. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
La valeur de DO obtenue pour chaque échantillon d'essai peut être utilisée pour calculer le pourcentage de viabilité cellulaire par rapport au témoin négatif, lequel correspond à une viabilité cellulaire arbitrairement fixée à 100 %. La valeur seuil du pourcentage de viabilité cellulaire, qui établit la distinction entre les substances d'essai irritantes et les substances d'essai non classifiées, de même que les procédures statistiques utilisées pour évaluer les résultats et identifier les substances irritantes, doivent être clairement définies et documentées, et il convient de démontrer qu'elles sont appropriées. Les valeurs seuils permettant de déterminer l'irritation qui sont associées aux méthodes de référence validées sont indiquées ci-dessous:
La substance d'essai est considérée comme irritante pour la peau conformément à la catégorie 2 du SGH des Nations unies:
i) si la viabilité du tissu après exposition et incubation post-traitement est inférieure ou égale (≤) à 50 %.
La substance d'essai est considérée comme étant sans catégorie:
ii) si la viabilité du tissu après exposition et incubation post-traitement est supérieure (>) à 50 %.
3. RAPPORTS
3. 1. RAPPORT D'ESSAI
Le rapport d'essai doit mentionner les informations suivantes:
Substances d’essai et témoins:
— nom(s) chimique(s), tels que le nom IUPAC ou CAS, et le cas échéant, le numéro CAS,
— pureté et composition de la substance (en pourcentage en poids),
— propriétés physicochimiques utiles pour la conduite de l'essai (par exemple, état physique, stabilité et volatilité, pH, hydrosolubilité),
— le cas échéant, traitement des substances d’essai/témoins avant l’essai (par exemple, chauffage, réduction en poudre),
— conditions de stockage,
justification du choix du modèle de peau et du protocole utilisés.
Conditions d'essai:
— système cellulaire utilisé,
— informations sur l’étalonnage du dispositif et de la bande passante utilisés pour la mesure de la viabilité cellulaire (spectrophotomètre, par exemple),
— informations complètes sur le modèle spécifique de peau utilisé, et notamment sur ses performances. Il s'agit notamment de:
i) la viabilité;
ii) la fonction de barrière;
iii) la morphologie;
iv) la reproductibilité et la valeur prédictive;
v) les contrôles de qualité (CQ) du modèle;
— détails du protocole utilisé,
— doses d'essai utilisées, durée de l'exposition et de la période d'incubation post-traitement,
— description de toute modification éventuelle du protocole,
— référence aux données historiques du modèle. Il s'agit notamment de:
i) l'acceptabilité des données de CQ par rapport aux données historiques des lots;
ii) l'acceptabilité des valeurs des témoins positifs et négatifs par rapport aux moyennes et aux fourchettes des témoins positifs et négatifs;
— description des critères d'évaluation utilisés, notamment la justification du choix des valeurs-seuils pour le modèle prédictif.
Résultats:
— présentation sous forme de tableau des résultats de chaque échantillon d’essai,
— description des autres effets observés.
Discussion des résultats
Conclusions
4. BIBLIOGRAPHIE
1. Nations unies (NU) (2007). Système général harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques (SGH), deuxième édition révisée, Nations unies, New York et Genève, 2007. Accessible à l'adresse suivante: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_f.html.
2. REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Available at: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649
3. Méthode d'essai B.4. TOXICITÉ AIGUË; IRRITATION/CORROSION CUTANÉE
4. Méthode d'essai B.40. CORROSION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI DE RÉSISTANCE ÉLECTRIQUE TRANSCUTANÉE (RET).
5. Méthode d'essai B.40 BIS. CORROSION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI SUR MODÈLE DE PEAU HUMAINE
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7. ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Voir la rubrique «Download Study Documents» à l'adresse suivante: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu.
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13. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30,109-129.
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