Méthodes de détection
CHAPITRE I
MÉTHODE DE DÉTECTION DE RÉFÉRENCE
1. La méthode de détection de référence pour l’examen d’échantillons visant à détecter la présence de Trichinella est la méthode figurant dans la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023.
2. Les règles suivantes ne s’appliquent qu’à l’examen de viandes de porcins domestiques:
a) Lorsque les carcasses de porcins domestiques autres que les truies reproductrices et les verrats sont entières, prélever un échantillon d’au moins 1 g sur l’un des piliers du diaphragme, dans la zone de transition entre la partie musculaire et la partie tendineuse. Une pince spéciale peut être utilisée à condition qu’une précision comprise entre 1,00 et 1,15 g puisse être garantie.
Lorsque les carcasses de truies reproductrices et de verrats sont entières, prélever un échantillon plus important, d’au moins 2 g, sur l’un des piliers du diaphragme, dans la zone de transition entre la partie musculaire et la partie tendineuse.
S’il n’y a pas de pilier du diaphragme, prélever un échantillon de 2 g sur la partie du diaphragme située près des côtes ou du sternum, dans les muscles masticateurs, dans la langue ou dans la musculature abdominale des porcins domestiques autres que les truies reproductrices et les verrats, et un échantillon de 4 g sur les mêmes tissus des truies reproductrices et des verrats.
b) Pour les morceaux de viande, prélever un échantillon pesant au moins 5 g dans les muscles striés et contenant peu de graisse, dans la mesure du possible, près des os ou des tendons. Prélever un échantillon de même taille dans la viande non destinée à une cuisson à cœur ou à un autre traitement après abattage.
CHAPITRE II
MÉTHODES ÉQUIVALENTES
A. Méthode de la digestion d'échantillons collectifs avec assistance mécanique/technique de la sédimentation
1. Appareillage et réactifs
a) Un couteau ou des ciseaux pour découper les échantillons.
b) Des plateaux divisés en 50 carrés pouvant contenir chacun des échantillons de viande d'environ 2 g, ou d'autres outils donnant des garanties équivalentes en ce qui concerne la traçabilité des échantillons.
c) Un hache-viande ou un mixeur électrique.
d) Un Stomacher lab-blender 3500, thermo model.
e) Des sacs en plastique adaptés au Stomacher lab-blender.
f) Des ampoules à décantation coniques d'une capacité de 2 litres munies de préférence de robinets de sécurité en Téflon.
g) Des supports avec anneaux et fixations.
h) Des tamis, finesse de la maille 180, d'un diamètre extérieur de 11 cm, pourvus d'un treillis en acier inoxydable ou en laiton.
i) Des entonnoirs d'un diamètre intérieur d'au moins 12 cm, destinés à recevoir les tamis.
j) Des éprouvettes graduées de 100 ml.
k) Un thermomètre d’une précision de 0,5 °C, dont la gamme de températures va de 20 °C à 70 °C.
l) Un vibrateur, par exemple un rasoir électrique sans tête.
m) Un relais s'allumant et s'éteignant toutes les minutes.
n) Un trichinoscope pourvu d'une table horizontale ou un stéréomicroscope à éclairage transmis diascopique d'intensité réglable.
o) Des boîtes de Petri d’un diamètre d’environ 90 mm, quadrillées en carrés d’environ 1 cm, ou un équipement équivalent pour le dénombrement des larves, comme le prévoit le point 6.14 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023.
p) Acide chlorhydrique à 17,5 %.
q) De la pepsine aux concentrations suivantes:
— sous forme de poudre ou de granulés: 1:10 000 NF (US National Formulary), correspondant à 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) et à 2 000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), ou
— sous forme liquide: pepsine liquide stabilisée contenant un minimum de 660 unités Pharmacopée européenne par ml.
D’autres activités pepsiques peuvent être utilisées, à condition que l’activité finale dans le liquide de digestion soit équivalente à l’activité de 10 g de 1:10 000 NF, comme indiqué au point 5.3 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023.
r) Plusieurs poubelles de 10 litres à employer lors de la décontamination de l'appareillage au moyen, par exemple, de formol, et pour les sucs digestifs restant en cas de résultat positif.
s) Une balance étalonnée pour peser les échantillons et/ou la pepsine (précise à ± 0,1 g).
2. Prélèvement des échantillons et quantité à digérer
Se conformer au chapitre I et au point 4.2 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023 (voir également ses annexes A et B pour plus de détails).
3. Procédure
I. Hachage
Hacher préalablement les échantillons de viande dans un hache-viande améliorera la qualité de la digestion. En cas d'utilisation d'un mixeur électrique, faire fonctionner l'appareil trois ou quatre fois pendant environ une seconde chaque fois.
II. Procédé de digestion
Le présent procédé peut être utilisé pour des groupes complets d'échantillons (100 g d'échantillons à la fois) ou pour des groupes de moins de 100 g.
a) Pools complets d'échantillons (100 à la fois):
i) garnir le Stomacher lab-blender 3 500 d'un double sachet en plastique et régler la température à 40 à 41 °C;
ii) verser un litre et demi d'eau chauffée à 40 à 41 °C dans le sachet intérieur;
iii) transférer dans le sachet 25 ml de la solution d'acide chlorhydrique à 17,5 %;
iv) ajouter ensuite 100 échantillons pesant environ 1 g chacun (à 25 à 30 °C) prélevés sur chaque échantillon individuel conformément au point 2;
v) ajouter enfin 6 g de pepsine ou 18 ml de pepsine liquide. Respecter scrupuleusement cet ordre pour éviter la décomposition de la pepsine;
vi) broyer le contenu du sachet dans le Stomacher pendant 25 minutes;
vii) enlever le sachet en plastique du Stomacher, filtrer le liquide de digestion à l'aide du tamis et laisser couler dans un bécher de 3 l;
viii) laver le sachet en plastique avec environ 100 ml d'eau qui sont ensuite utilisés pour rincer le tamis et ajoutés au filtrat contenu dans le bécher;
ix) un maximum de 15 échantillons individuels peuvent être ajoutés à un groupe complet de 100 échantillons et examinés en même temps que ces derniers.
b) Pools plus petits (moins de 100 échantillons):
i) garnir le Stomacher lab-blender 3500 d'un double sachet en plastique et régler la température à + 40 à 41 °C;
ii) préparer un liquide de digestion en mélangeant environ un litre et demi d'eau et 25 ml d'acide chlorhydrique à 17,5 %. Ajouter 6 g de pepsine et mélanger le tout à une température de + 40 à 41 °C. Respecter scrupuleusement cet ordre pour éviter la décomposition de la pepsine;
iii) déterminer un volume de liquide de digestion correspondant à 15 ml par gramme d'échantillon (ainsi, pour 30 échantillons, prélever 30 × 15 ml = 450 ml) et le transférer dans le sachet plastique intérieur en même temps que les échantillons de viande pesant environ 1 g (à + 25 à 30 °C) prélevés sur chaque échantillon individuel conformément au point 2;
iv) verser de l'eau à environ + 41 °C dans le sachet extérieur jusqu'à obtenir un volume total dans les deux sachets d'un litre et demi. Broyer le contenu du sachet dans le Stomacher pendant 25 minutes;
v) enlever le sachet en plastique du Stomacher, filtrer le liquide de digestion à l'aide du tamis et laisser couler dans un bécher de 3 l;
vi) laver le sachet en plastique avec approximativement 100 ml d'eau (à + 25 à 30 °C) qui sont ensuite utilisés pour rincer le tamis et ajoutés au filtrat contenu dans le bécher.
III. Isolement des larves par sédimentation
— Ajouter au liquide de digestion 300 à 400 g de glace en paillettes ou de glace pilée pour obtenir un volume d’environ 2 litres. Agiter ensuite le liquide de digestion jusqu’à ce que la glace ait fondu. Dans le cas de groupes plus petits [voir section II b)], la quantité de glace doit être réduite en conséquence.
— Transférer le liquide de digestion refroidi dans une ampoule à décantation de 2 litres pourvue d’un vibrateur fixé par une pince supplémentaire.
— Pour la sédimentation, laisser le liquide dans l’ampoule à décantation pendant 30 minutes en faisant alterner une minute de vibration et une minute d’arrêt.
— Après 30 minutes, introduire rapidement 60 ml de sédiment dans une éprouvette graduée de 100 ml (après utilisation, rincer l’ampoule à décantation avec une solution détergente).
— Laisser reposer l’échantillon de 60 ml pendant au moins 10 minutes, enlever ensuite par aspiration le liquide surnageant jusqu’à laisser dans l’éprouvette un volume de 15 ml qui sera examiné pour rechercher la présence de larves.
— Pour l’aspiration, une seringue jetable pourvue d’un canon en plastique peut être utilisée. La longueur du canon doit être telle que 15 ml de liquide restent dans l’éprouvette graduée lorsque la collerette de la seringue se trouve au niveau du bord de l’éprouvette.
— Verser les 15 ml restants dans une boîte de Petri ou dans un équipement équivalent pour le dénombrement des larves et procéder à l’examen au trichinoscope ou au stéréomicroscope.
— Laver l’éprouvette graduée avec 5 à 10 ml d’eau du robinet et ajouter le liquide obtenu à l’échantillon.
— Les liquides de digestion doivent être examinés dès qu’ils sont prêts. En aucun cas l’examen ne doit être remis au lendemain.
Lorsque les liquides de digestion sont troubles, ils doivent être clarifiés comme suit:
— verser l’échantillon final de 60 ml dans une éprouvette graduée et laisser reposer pendant 10 minutes; enlever ensuite par aspiration 45 ml du liquide surnageant et ajouter aux 15 ml restants de l’eau du robinet jusqu’à obtenir un volume total de 45 ml,
— après une nouvelle période de repos de 10 minutes, enlever par aspiration 30 ml du liquide surnageant puis verser les 15 ml restants dans une boîte de Petri ou dans un équipement équivalent pour le dénombrement des larves et procéder à leur examen au trichinoscope ou au stéréomicroscope,
— laver l’éprouvette graduée avec 10 ml d’eau du robinet puis ajouter le liquide obtenu à l’échantillon dans la boîte de Petri ou dans l’équipement équivalent pour le dénombrement des larves et procéder à l’examen au trichinoscope ou au stéréomicroscope.
IV. Résultats positifs ou douteux
Lorsque l’examen d’un échantillon collectif donne un résultat positif ou incertain, un nouvel échantillon de 20 g est prélevé sur chaque porc, comme indiqué au point 4.2 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023 (voir également ses annexes A et B pour plus de détails). Les échantillons de 20 g prélevés sur cinq porcs sont regroupés et examinés selon la méthode décrite au présent chapitre. Des échantillons prélevés sur 20 groupes de cinq porcs seront examinés de cette façon. Si Trichinella est détectée dans un groupe d’échantillons de cinq porcs, de nouveaux échantillons de 20 g sont prélevés sur chaque animal du groupe et examinés séparément suivant la méthode décrite au présent chapitre. Les échantillons contenant des parasites doivent être maintenus dans de l’alcool éthylique ayant une concentration située entre 70 et 90 % (concentration finale) en vue de leur conservation et de l’identification des espèces au laboratoire de référence de l’Union européenne ou au laboratoire national de référence. Pour la procédure de décontamination, voir le point 12 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023.
B. Méthode de la digestion d'échantillons collectifs avec assistance mécanique/technique de l'isolement par filtration
1. Appareillage et réactifs
Se conformer à la section A, point 1.
Appareillage supplémentaire:
a) un entonnoir Gelman d'un litre avec support pour filtre (diamètre du support: 45 mm);
b) des disques filtrants composés d'un treillis rond en acier inoxydable, finesse de la maille 35 (diamètre du disque: 45 mm), de deux anneaux en caoutchouc d'une épaisseur de 1 mm (diamètre extérieur: 45 mm, diamètre intérieur: 38 mm); le treillis doit être placé entre les deux anneaux et fixé à l'aide d'une colle à deux composants adaptée aux deux matériaux;
c) un Erlenmeyer de 3 litres muni d'un tube latéral pour aspiration;
d) une trompe à eau;
e) des sachets en plastique d'une capacité d'au moins 80 ml;
f) un soude-sac;
g) rennilase, 1:150 000 unités Soxlet par gramme.
2. Prélèvement des échantillons et quantité à digérer
Se conformer au chapitre I et au point 4.2 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023 (voir également ses annexes A et B pour plus de détails).
3. Procédure
I. Hachage
Hacher préalablement les échantillons de viande dans un hache-viande améliorera la qualité de la digestion. En cas d'utilisation d'un mixeur électrique, faire fonctionner l'appareil trois ou quatre fois pendant environ une seconde chaque fois.
II. Procédé de digestion
Le présent procédé peut être utilisé pour des groupes complets d'échantillons (100 g d'échantillons à la fois) ou pour des groupes de moins de 100 g.
a) Groupes complets d'échantillons (100 à la fois)
Voir section A 3, point II a).
b) Groupes plus petits (moins de 100 échantillons)
Voir section A 3, point II b).
III. Isolement des larves par filtration
a) Ajouter au liquide de digestion 300 à 400 g de glace en paillettes ou de glace pilée pour obtenir un volume d'environ 2 litres. Dans le cas de groupes plus petits, la quantité de glace doit être réduite en conséquence.
b) Agiter le liquide de digestion jusqu'à ce que la glace ait fondu. Laisser reposer le liquide de digestion refroidi pendant 3 minutes au moins pour que les larves puissent s'enrouler.
c) Monter l'entonnoir Gelman muni d'un support pour filtre, dans lequel se trouve un disque filtrant, sur un flacon Erlenmeyer relié à une trompe à eau.
d) Introduire le liquide de digestion dans l'entonnoir Gelman et filtrer. Vers la fin, le passage du liquide à travers le filtre peut être facilité en procédant à une aspiration à l'aide de la trompe à eau. Terminer l'aspiration juste avant que le filtre ne sèche, c'est-à-dire lorsqu'il reste 2 à 5 ml de liquide dans l'entonnoir.
e) Après filtration de tout le liquide de digestion, enlever le disque filtrant et le placer dans un sachet en plastique de 80 ml en ajoutant 15 à 20 ml de solution de rennilase. Pour obtenir la solution de rennilase, on introduit 2 g de rennilase dans 100 ml d'eau du robinet.
f) Pratiquer une double soudure du sachet en plastique et le placer dans le Stomacher entre le sachet intérieur et le sachet extérieur.
g) Broyer dans le Stomacher pendant 3 minutes, par exemple pendant que l'appareil est utilisé pour l'analyse d'un groupe complet ou incomplet d'échantillons.
h) Après 3 minutes, enlever du Stomacher le sachet en plastique contenant le disque filtrant et la solution de rennilase et l’ouvrir à l’aide de ciseaux. Verser le liquide dans une boîte de Petri ou dans un équipement équivalent pour le dénombrement des larves. Laver le sachet avec 5 à 10 ml d’eau puis ajouter cette eau dans la boîte de Petri ou dans l’équipement équivalent pour le dénombrement des larves et procéder à son examen au trichinoscope ou au stéréomicroscope.
i) Les liquides de digestion doivent être examinés dès qu'ils sont prêts. En aucun cas, l'examen ne doit être remis au lendemain.
Note: Ne jamais utiliser des disques filtrants qui ne sont pas parfaitement propres. Ne jamais laisser sécher des disques filtrants qui ne sont pas propres. Il est possible de nettoyer les disques en les laissant tremper dans une solution de rennilase pendant une nuit. Avant leur utilisation, ils doivent être lavés dans le Stomacher à l'aide d'une solution de rennilase.
IV. Résultats positifs ou douteux
Se conformer à la section A 3, point IV.
C. Méthode de digestion automatique pour échantillons collectifs jusqu'à 35 grammes
1. Appareillage et réactifs
a) Un couteau ou des ciseaux pour découper les échantillons.
b) Des plateaux divisés en 50 carrés pouvant contenir chacun des échantillons de viande d'environ 2 g, ou d'autres outils donnant des garanties équivalentes en ce qui concerne la traçabilité des échantillons.
c) Un mixeur Trichomatic 35® avec dispositif de filtration.
d) Solution d'acide chlorhydrique à 8,5 % ± 0,5 % en poids.
e) Des filtres à membrane de polycarbonate transparent d'un diamètre de 50 mm et dont les pores mesurent 14 microns.
f) De la pepsine aux concentrations suivantes:
— sous forme de poudre ou de granulés: 1:10 000 NF (US National Formulary), correspondant à 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) et à 2 000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), ou
— sous forme liquide: pepsine liquide stabilisée contenant un minimum de 660 unités Pharmacopée européenne par ml.
D’autres activités pepsiques peuvent être utilisées, à condition que l’activité finale dans le liquide de digestion soit équivalente à l’activité de 10 g de 1:10 000 NF, comme indiqué au point 5.3 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023.
g) Une balance étalonnée pour peser les échantillons et/ou la pepsine (précise à ± 0,1 g).
h) Des pinces à bouts plats.
i) Plusieurs lamelles porte-objets d'une largeur d'au moins 5 cm ou plusieurs boîtes de Petri d'un diamètre d'au moins 6 cm dont le fond a été divisé en carrés de 10 × 10 mm à l'aide d'un instrument pointu.
j) Un (stéréo)microscope à lumière transmise (grossissement: 15 à 60 fois) ou un trichinoscope à table horizontale.
k) Une poubelle pour récolter les liquides résiduels.
l) Plusieurs poubelles de 10 litres à employer lors de la décontamination de l'appareillage au moyen, par exemple, de formol, et pour les sucs digestifs restant en cas de résultat positif.
m) Un thermomètre d’une précision de 0,5 °C, dont la gamme de températures va de 20 °C à 70 °C.
2. Prélèvement des échantillons et quantité à digérer
Se conformer au chapitre I et au point 4.2 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023 (voir également ses annexes A et B pour plus de détails).
3. Procédure
I. Procédé de digestion
a) Placer le mixeur équipé du dispositif de filtration, relier le tuyau de décharge et l'introduire dans la poubelle.
b) Lorsque le mixeur est allumé, le chauffage commence.
c) Avant de commencer, ouvrir la valve située en dessous de l'enceinte de réaction et la fermer.
d) Ajouter ensuite jusqu'à 35 échantillons pesant environ 1 g chacun (à 25 à 30 °C) prélevés sur chaque échantillon individuel conformément au point 2. S'assurer qu'il n'y a plus de gros morceaux de tendons qui pourraient adhérer au filtre à membrane.
e) Verser de l'eau dans le récipient relié au mixeur (approximativement 400 ml).
f) Verser environ 30 ml d'acide chlorhydrique (8,5 %) dans le récipient plus petit relié au mixeur.
g) Placer un filtre à membrane sous le filtre grossier dans le dispositif de filtrage.
h) Ajouter enfin 7 g de pepsine ou 21 ml de pepsine liquide. Respecter scrupuleusement cet ordre pour éviter la décomposition de la pepsine.
i) Fermer le couvercle de l'enceinte de réaction et des récipients.
j) Sélectionner la période de digestion. Choisir une période de digestion courte (5 minutes) pour les porcs à l'âge normal de l'abattage et une durée de digestion plus longue (8 minutes) pour les autres échantillons.
k) Lorsqu'on appuie sur le bouton de mise en marche du mixeur, le procédé de remplissage et de digestion débute automatiquement, suivi de la filtration. Après 10 à 13 minutes, le procédé est terminé et s'arrête automatiquement.
l) Ouvrir le couvercle de l'enceinte de réaction après avoir vérifié que celle-ci est vide. S'il y a de la mousse ou des restes du liquide de digestion dans l'enceinte, répéter la procédure conformément à la section V.
II. Isolement des larves
a) Enlever le support pour filtre et transférer le filtre à membrane sur une lamelle porte-objet ou dans une boîte de Petri.
b) Examiner le filtre à membrane au (stéréo)microscope ou au trichinoscope.
III. Nettoyage de l'équipement
a) En cas de résultat positif, remplir d'eau bouillante l'enceinte de réaction du mixeur jusqu'aux deux tiers. Verser de l'eau du robinet dans le récipient relié au mixeur jusqu'à ce que le niveau du capteur inférieur soit recouvert. Le nettoyage se fait alors automatiquement. Décontaminer le support pour filtre et tout autre équipement au moyen, par exemple, de formol.
b) À la fin de la journée de travail, remplir d'eau le récipient à liquide du mixeur et mettre en route un programme normal.
IV. Utilisation de filtres à membrane
Aucun filtre à membrane en polycarbonate ne peut être utilisé plus de cinq fois. Retourner le filtre après chaque usage. En outre, vérifier le filtre après chaque usage pour déterminer s'il a subi un dommage le rendant impropre à toute nouvelle utilisation.
V. Méthode à utiliser lorsque la digestion est incomplète et que la filtration ne peut être mise en œuvre
Lorsque le mixeur a achevé un programme automatique conformément à la section I, ouvrir le couvercle de l'enceinte de réaction et vérifier s'il y reste de la mousse ou du liquide. Si c'est le cas, procéder comme suit:
a) fermer la valve située en dessous de l'enceinte de réaction;
b) enlever le support pour filtre et transférer le filtre à membrane sur une lamelle porte-objet ou dans une boîte de Petri;
c) placer un nouveau filtre à membrane sur le support pour filtre et monter le support pour filtre;
d) verser de l'eau dans le récipient à liquide du mixeur jusqu'à ce que le capteur inférieur soit recouvert;
e) mettre en œuvre le programme de nettoyage automatique;
f) une fois que le programme de nettoyage est terminé, ouvrir le couvercle de l'enceinte de réaction et vérifier s'il reste du liquide;
g) si l'enceinte est vide, démonter le support pour filtre et transférer le filtre à membrane sur une lamelle porte-objet ou dans une boîte de Petri au moyen d'une pince;
h) examiner les deux filtres à membrane conformément à la section II. Si les filtres ne peuvent être examinés, répéter tout le procédé de digestion pendant une période plus longue conformément à la section I.
VI. Résultats positifs ou douteux
Se conformer à la section A 3, point IV.
D. Méthode de la digestion d'échantillons collectifs utilisant un agitateur magnétique/filtration et détection de larves par test d'agglutination au latex
Cette méthode est jugée équivalente uniquement pour les tests réalisés sur de la viande de porcins domestiques.
1. Appareillage et réactifs
a) Un couteau ou des ciseaux et des pinces pour le prélèvement des échantillons.
b) Des plateaux divisés en 50 carrés pouvant contenir chacun des échantillons de viande d'environ 2 g ou d'autres outils donnant des garanties équivalentes en ce qui concerne la traçabilité des échantillons.
c) Un mixeur muni d'une lame hachoir tranchante. Lorsque les échantillons pèsent plus de 3 g, utiliser un hache-viande pourvu d'orifices de 2 à 4 mm ou des ciseaux. Dans le cas de viande congelée ou de la langue (après ablation de la couche superficielle, qui ne peut être digérée), il est nécessaire d'utiliser un hache-viande et d'augmenter considérablement la taille de l'échantillon.
d) Des agitateurs magnétiques pourvus d'une plaque chauffante avec température contrôlée et des barreaux magnétiques recouverts de Téflon d'une longueur approximative de 5 cm.
e) Des béchers en verre d'une capacité de 3 litres.
f) Des tamis, finesse de la maille 180 μm, d'un diamètre extérieur de 11 cm, pourvus d'un treillis en acier inoxydable.
g) Appareillage de filtration en acier pour filtres à mailles de 20 μm muni d'un entonnoir en acier.
h) Pompe à vide.
i) Des réservoirs en métal ou en plastique d'une capacité de 10 à 15 litres pour récolter les sucs digestifs restants.
j) Un agitateur giratoire 3D.
k) Une feuille d'aluminium.
l) Acide chlorhydrique à 25 %.
m) De la pepsine aux concentrations suivantes:
— sous forme de poudre ou de granulés: 1:10 000 NF (US National Formulary), correspondant à 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) et à 2 000 FIP (Fédération internationale de pharmacie), ou
— sous forme liquide: pepsine liquide stabilisée contenant un minimum de 660 unités Pharmacopée européenne par ml.
D’autres activités pepsiques peuvent être utilisées, à condition que l’activité finale dans le liquide de digestion soit équivalente à l’activité de 10 g de 1:10 000 NF, comme indiqué au point 5.3 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023.
n) Eau du robinet chauffée à 46 à 48 °C.
o) Une balance étalonnée pour peser les échantillons et/ou la pepsine (précise à ± 0,1 g).
p) Des pipettes de différentes tailles (1, 10 ou 25 ml), des micropipettes conformes aux instructions du fabricant de tests d'agglutination au latex, et des supports pour pipettes.
q) Des filtres à mailles en nylon de 20 μm, diamètre adapté au système de filtration.
r) Pinces en plastique ou en acier de 10 à 15 cm.
s) Fioles coniques de 15 ml.
t) Un pilon à bout conique en Téflon ou en acier adapté aux fioles coniques.
u) Un thermomètre d’une précision de 0,5 °C, dont la gamme de températures va de 20 °C à 70 °C.
v) Cartes d'agglutination au latex du matériel de test de détection d'antigène Trichin-L validé sous le code no EURLP_D_001/2011.
w) Solution tampon avec conservateur (diluant type) du matériel de test de détection d'antigène Trichin-L validé sous le code no EURLP_D_001/2011.
x) Tampon complété par un conservateur (contrôle négatif) du matériel de test de détection d'antigène Trichin-L validé sous le code no EURLP_D_001/2011.
y) Tampon complété par des antigènes Trichinella spiralis et un conservateur (contrôle positif) du matériel de test de détection d'antigène Trichin-L validé sous le code no EURLP_D_001/2011.
z) Tampon à particules de polystyrène recouvert d'anticorps complétés par un conservateur (perles de latex) du matériel de test de détection d'antigène Trichin-L validé sous le code no EURLP_D_001/2011.
aa) Bâtons jetables.
2. Prélèvement des échantillons et quantité à digérer
Se conformer au chapitre I et au point 4.2 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023 (voir également ses annexes A et B pour plus de détails).
3. Procédure
I. Pools complets d'échantillons (100 g d'échantillons à la fois)
a) Introduire 16 ± 0,5 ml d'acide chlorhydrique à 25 % (0,2 % du volume final) dans un bécher de 3 litres contenant 2,0 litres ± 200 ml d'eau du robinet chauffée à 46-48 °C; placer un barreau magnétique dans le bécher, poser le bécher sur la plaque préchauffée et mettre en route l'agitation.
b) Ajouter 10 ± 1 g de pepsine en poudre (ou 30 ± 3 ml de pepsine liquide)
c) Hacher dans le mixeur 100-115 g des échantillons prélevés conformément au point 2 avec 150 ml ± 15 ml de tampon de digestion préchauffé.
d) Transférer la viande hachée dans le bécher de 3 litres contenant l'eau, la pepsine et l'acide chlorhydrique.
e) Tremper plusieurs fois le dispositif de hachage du mixeur dans le liquide de digestion se trouvant dans le bécher et rincer le bol du mixeur avec une petite quantité de liquide de digestion pour en ôter la viande y adhérant encore.
f) Couvrir le bécher d'une feuille d'aluminium.
g) L'agitateur magnétique doit être réglé de telle sorte qu'une température constante de 44-46 °C puisse être maintenue pendant le fonctionnement. Durant l'agitation, le liquide de digestion doit tourner à une vitesse suffisamment élevée pour former un profond tourbillon central sans provoquer d'éclaboussures.
h) Agiter le liquide de digestion jusqu'à ce que les particules de viande disparaissent (environ 30 minutes). Ensuite, arrêter l'appareil, filtrer le liquide de digestion au travers du tamis et recueillir le filtrat dans une ampoule à décanter. Des périodes de digestion plus longues (ne dépassant pas 60 minutes) peuvent être nécessaires pour le traitement de certains types de viandes (langue, gibier, etc.).
i) Le procédé de digestion est jugé satisfaisant si 5 % au maximum du poids de l'échantillon initial reste sur le tamis.
j) Placer le filtre à mailles en nylon de 20 μm sur le support de filtration. Fixer l'entonnoir conique de filtration en acier au support à l'aide du système de blocage et placer le tamis en acier à mailles de 180 μm sur l'entonnoir. Connecter la pompe à vide au support de filtration et au réservoir en métal ou en plastique pour collecter le liquide de digestion.
k) Arrêter de remuer et verser le liquide de digestion sur le tamis placé sur l'entonnoir de filtration. Rincer le bécher avec environ 250 ml d'eau chaude. Verser le liquide de rinçage dans la rampe de filtration après filtration du liquide de digestion.
l) À l'aide des pinces, saisir la membrane de filtration en la tenant par un côté. Plier la membrane de filtration (au moins) en quatre et l'insérer dans la fiole conique de 15 ml. Le choix de la fiole conique doit être adapté au pilon.
m) Pousser la membrane de filtration au fond de la fiole conique de 15 ml à l'aide du pilon et appuyer fortement en faisant environ vingt mouvements de va-et-vient successifs à l'aide du pilon, qui doit être placé dans le pli de la membrane de filtration conformément aux instructions du fabricant.
n) Ajouter 0,5 ml ± 0,01 ml de diluant type dans la fiole conique de 15 ml à l'aide d'une pipette et homogénéiser la membrane de filtration à l'aide du pilon en effectuant des mouvements de va-et-vient successifs de faible amplitude pendant environ 30 secondes; éviter les mouvements brusques afin de limiter les éclaboussures conformément aux instructions du fabricant.
o) Avec une pipette, répartir chaque échantillon, le contrôle négatif et le contrôle positif, dans des zones distinctes de la carte d'agglutination, conformément aux instructions du fabricant.
p) À l'aide d'une pipette, ajouter les perles de latex dans chaque zone de la carte d'agglutination, conformément aux instructions du fabricant, sans les mettre en contact avec le ou les échantillons et les contrôles. À l'aide d'un bâton jetable, mélanger doucement les perles de latex dans chaque zone jusqu'à ce que le liquide homogène couvre l'ensemble de la zone.
q) Placer la carte d'agglutination sur l'agitateur 3D et agiter pendant 10 ± 1 minutes conformément aux instructions du fabricant.
r) À l'issue du laps de temps prescrit dans les instructions du fabricant, arrêter d'agiter et placer la carte d'agglutination sur une surface plane et lire immédiatement les résultats de la réaction, conformément aux instructions du fabricant. Si l'échantillon est positif, des agrégats de perles doivent apparaître. Si l'échantillon est négatif, la suspension reste homogène sans agrégats de perles.
II. Groupes d’échantillons de moins de 100 g, tels que définis au point 8 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023
Si nécessaire, il est possible d’ajouter jusqu’à 15 g à un groupe complet de 100 g et de les examiner en même temps que celui-ci, conformément à la section I. Une quantité de plus de 15 g doit être examinée en tant que groupe complet. Pour les groupes jusqu’à 50 g, il est possible de diminuer les quantités de liquide de digestion et des ingrédients à 1 l d’eau, 8 ml d’acide chlorhydrique et 5 g de pepsine.
III. Résultats positifs ou douteux
Lorsque l’examen d’un échantillon collectif suivant la procédure d’agglutination au latex donne un résultat positif ou incertain, un nouvel échantillon de 20 g est prélevé sur chaque porcin, conformément au point 4.2 de la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023 (voir également ses annexes A et B pour plus de détails). Les échantillons de 20 g prélevés sur cinq porcins sont regroupés et examinés suivant la méthode décrite à la section I. Des échantillons prélevés sur 20 groupes de cinq porcins doivent être examinés de cette façon.
Lorsque le test d’agglutination au latex effectué sur un groupe de cinq porcins donne un résultat positif, de nouveaux échantillons de 20 g sont prélevés sur chaque animal du groupe et examinés séparément suivant la méthode décrite à la section I.
Lorsque le test d’agglutination au latex donne un résultat positif ou incertain, au moins 20 g de muscle porcin doivent être envoyés au laboratoire national de référence pour confirmation suivant la norme ISO 18743:2015/Amd1:2023 ou l’une des méthodes équivalentes décrites ci-dessus.
Les échantillons contenant des parasites doivent être maintenus dans de l’alcool éthylique ayant une concentration située entre 70 et 90 % (concentration finale) en vue de leur conservation et de l’identification des espèces au laboratoire de référence de l’Union européenne ou au laboratoire national de référence.
Après le prélèvement des parasites, les liquides positifs doivent être décontaminés en les chauffant à une température d’au moins 60 °C.
IV. Procédure de nettoyage et de décontamination après un résultat positif ou douteux
Lorsque l'examen d'un échantillon collectif ou individuel suivant la procédure d'agglutination au latex donne un résultat positif ou douteux, tout le matériel ayant été en contact avec la viande (bol et lame du mixeur, pilon à bout conique, bécher, barreau magnétique, capteur de température, entonnoir conique de filtration, tamis et pinces) doit être soigneusement décontaminé en étant trempé quelques secondes dans l'eau chaude (65 à 90 °C). Les résidus de viande ou les larves inactivées qui adhéreraient aux surfaces de ce matériel peuvent être enlevés avec une éponge propre et de l'eau du robinet. Si nécessaire, ajouter quelques gouttes de détergent pour dégraisser l'équipement. Il est alors recommandé de rincer chaque pièce complètement afin d'enlever toutes les traces de détergent.
E. Test de digestion artificielle pour la détection in vitro des larves de Trichinella spp. dans les échantillons de viande au moyen du kit de digestion artificielle alternative «PrioCHECK® Trichinella AAD».
Cette méthode est jugée équivalente uniquement pour les tests réalisés sur les viandes de porcins domestiques.
Le kit «PrioCHECK® Trichinella AAD» doit être utilisé conformément au manuel d'instructions fourni avec le kit, au moyen d'ampoules à décanter (Lenz, NS 29/32) et d'une éprouvette en verre de 80 ml.
F. Détection automatisée de Trichinella spp. par la méthode lumiVAST Trichinella
Cette méthode est jugée équivalente uniquement pour les tests réalisés sur les viandes de porcins domestiques
La préparation et l’analyse des échantillons doivent être effectuées conformément aux instructions fournies par le fabricant. Tous les appareils utilisés pour cette méthode doivent être étalonnés et entretenus conformément aux instructions fournies par le ou les fabricants.
Lorsque l’examen d’un échantillon collectif donne un résultat positif ou incertain, un nouvel échantillon de 20 g doit être prélevé sur l’un des piliers du diaphragme ou sur un autre tissu de chaque porc conformément au chapitre I.
Les échantillons de 20 g prélevés sur cinq porcs sont regroupés et examinés selon la même méthode.
Lorsqu’un résultat positif est obtenu sur un groupe de cinq porcs, un nouvel échantillon de 20 g est prélevé sur chaque animal du groupe et examiné séparément suivant la même méthode.
Lorsque le test donne un résultat positif ou incertain, au moins 20 g de muscle porcin sont envoyés au laboratoire national de référence pour confirmation suivant la méthode de référence décrite au chapitre I.
Les échantillons contenant des parasites sont maintenus dans de l’alcool éthylique entre 70 % et 90 % en vue de leur conservation et de l’identification des espèces au laboratoire de référence de l’Union européenne ou au laboratoire national de référence.