LAIT ÉCRÉMÉ EN POUDRE
PARTIE I
Échantillonnage et analyse du lait écrémé en poudre offert à l'intervention
1. Le prélèvement des échantillons par lot est effectué selon la procédure prévue par la norme internationale ISO 707. Les États membres peuvent toutefois utiliser une autre méthode d'échantillonnage, pour autant que cette dernière soit conforme aux principes de la norme précitée.
2. Nombre d'emballages à sélectionner pour le prélèvement des échantillons aux fins d'analyse:
a) offres contenant jusqu'à 800 sacs de 25 kilogrammes: 8 au moins;
b) offres contenant plus de 800 sacs de 25 kilogrammes: 8 + 1 pour chaque tranche ou partie d'une tranche supplémentaire de 800 sacs, au moins.
3. Poids de l'échantillon: des échantillons d'au moins 200 grammes sont prélevés de chaque emballage.
4. Groupement des échantillons: au maximum neuf échantillons sont réunis dans un échantillon global.
5. Analyse des échantillons: chaque échantillon global est soumis à une analyse susceptible de vérifier toutes les caractéristiques qualitatives prévues à l'annexe V, partie II, du règlement délégué (UE) 2016/1238.
6. En cas de défaut de l'échantillon:
a) si un échantillon composite présente un défaut pour un paramètre, la quantité représentée par cet échantillon est rejetée;
b) si un échantillon composite présente un défaut pour plusieurs paramètres, la quantité représentée par cet échantillon est rejetée et le reste des quantités de l'offre qui proviennent de la même usine est soumis à un deuxième échantillonnage; l'analyse de ces échantillons est déterminante. Dans ce cas:
— le nombre d'échantillons prévu au point 2 est doublé,
— si un échantillon composite présente un défaut pour un ou plusieurs paramètres, la quantité représentée par cet échantillon est rejetée.
PARTIE I BIS
Méthodes d'analyse du lait écrémé en poudre destiné à l'intervention publique
| Paramètre | Méthode
| Protéines | ISO 8968 partie 1
| Matières grasses | ISO 1736
| Eau | ISO 5537
| Acidité | ISO 6091
| Lactates | ISO 8069
| Test de la phosphatase | ISO 11816 partie 1
| Indice d'insolubilité | ISO 8156
| Particules brûlées | ADPI
| Micro-organismes | ISO 4833 partie 1
| Babeurre | Appendice I
| Lactosérum présure | Appendices II et III
| Lactosérum acide | ISO 8069 ou inspections sur place
| Contrôles organoleptiques | ISO 22935 parties 2 et 3.
Appendice I
LAIT ÉCRÉMÉ EN POUDRE: DOSAGE DE LA PHOSPHATIDYLSÉRINE ET DE LA PHOSPHATIDYLÉTHANOLAMINE
Méthode: CLHP en phase inverse
1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION
La méthode décrit une procédure de dosage de la phosphatidylsérine (PS) et de la phosphatidyléthanolamine (PE) dans le lait écrémé en poudre (LEP) et permet de mettre en évidence les solides du babeurre présents dans le LEP.
2. DÉFINITION
Teneur en PS + PEla fraction massique de la substance déterminée selon la présente procédure. Le résultat est exprimé en mg de phosphatidyléthanolamine dipalmitoyl (PEDP) pour 100 grammes de poudre.
3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE
Extraction au méthanol des aminophospholipides de la poudre de lait reconstitué. Dosage de la PS et de la PE sous forme de dérivés de o-phtaldialdéhyde (OPA) par CLHP en phase inverse (PI) et détection par fluorescence. Dosage de la PS et de la PE dans l'échantillon d'essai par rapport à un échantillon étalon contenant une quantité connue de PEDP.
4. RÉACTIFS
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue. L'eau doit être distillée ou avoir un degré de pureté au moins équivalent sauf spécification contraire.
4. 1. Matériel de référence: PEDP, d'une pureté minimale de 99 %
Note: le matériel de référence doit être stocké à – 18 °C.
4. 2. Réactifs pour la préparation de l'échantillon étalon et de l'échantillon d'essai
4. 2.1.
Méthanol de qualité CLHP
4. 2.2.
Chloroforme de qualité CLHP
4. 2.3.
Monohydrochlorure de tryptamine
4. 3. Réactifs pour dérivatisation de l'o-phtaldialdéhyde
4. 3.1.
Hydroxyde de sodium, solution aqueuse à 12 M
4. 3.2.
Acide borique, solution aqueuse à 0,4 M ajustée à un pH de 10,0 à l'aide d'hydroxyde de sodium (4.3.1)
4. 3.3.
2-mercaptoéthanol
4. 3.4.
o-phtaldialdéhyde (OPA)
4. 4. Solvants d'élution pour CLHP
4. 4.1.
Préparer les solvants d'élution à l'aide de réactifs de qualité CLHP.
4. 4.2.
Eau de qualité CLHP
4. 4.3.
Méthanol d'une pureté fluorimétrique testée
4. 4.4.
Tétrahydrofuranne
4. 4.5.
Phosphate de sodium dihydrogéné
4. 4.6.
Acétate de sodium
4. 4.7.
Acide acétique
5. INSTRUMENTS
5. 1.
Balance analytique pesant au mg près et d'une lisibilité de 0,1 mg
5. 2.
Béchers d'une capacité de 25 et 100 ml
5. 3.
Pipettes permettant de délivrer des quantités de 1 et 10 ml
5. 4.
Agitateur magnétique
5. 5.
Pipettes graduées pouvant délivrer des quantités de 0,2, 0,5 et 5 ml
5. 6.
Ballons jaugés d'une capacité de 10, 50 et 100 ml
5. 7.
Seringues d'une capacité de 20 et 100 μl
5. 8.
Bain ultrasonique
5. 9.
Centrifugeuse pouvant fonctionner à 27 000 × g
5. 10.
Fioles de verre, d'une capacité d'environ 5 ml
5. 11.
Tube gradué d'une capacité de 25 ml
5. 12.
pH-mètre d'une précision de 0,1 unité de pH
5. 13. Équipement de CLHP
5. 13.1.
Système de pompage réglable, capable de fonctionner à un débit de 1,0 ml/min sous 200 bars
5. 13.2.
Autoéchantillonneur avec possibilité de dérivatisation
5. 13.3.
Dispositif de chauffage de colonne capable de maintenir la colonne à 30 °C ± 1 °C
5. 13.4.
Détecteur de fluorescence réglé à une longueur d'onde d'excitation de 330 nm et à une longueur d'onde d'émission de 440 nm
5. 13.5.
Intégrateur ou logiciel de traitement de données capable de mesurer une aire de pic
5. 13.6.
Colonne LiChrospher® — 100 (250 × 4,6 mm) ou une colonne équivalente garnie d'octadécylsilane (C 18) d'une granulométrie de 5 μm
6. ÉCHANTILLONNAGE
L'échantillonnage doit être effectué conformément à la norme ISO 707.
7. MODE OPÉRATOIRE
7. 1. Préparation de la solution étalon interne
7. 1.1.
Peser 30,0 ± 0,1 mg de monohydrochlorure de tryptamine (4.2.3) dans une fiole jaugée de 100 ml (5.6) et porter jusqu'à la marque avec du méthanol (4.2.1).
7. 1.2.
À l'aide d'une pipette, verser 1 ml (5.3) de cette solution dans une fiole jaugée de 10 ml (5.6) et porter jusqu'à la marque avec du méthanol (4.2.1) pour obtenir une concentration de tryptamine de 0,15 mM.
7. 2. Préparation de la solution d'échantillon d'essai
7. 2.1.
Peser 1,000 ± 0,001 g de l'échantillon de LEP dans un bécher de 25 ml (5.2). Ajouter 10 ml d'eau distillée à 40 °C ± 1 °C à l'aide d'une pipette (5.3) et remuer à l'aide d'un agitateur magnétique (5.4) pendant 30 minutes pour dissoudre tout amas.
7. 2.2.
À l'aide d'une pipette, verser 0,2 ml (5.5) de lait reconstitué dans une fiole jaugée de 10 ml (5.6), ajouter 100 μl de la solution de tryptamine à 0,15 mM (7.1) à l'aide d'une seringue (5.7) et porter jusqu'au trait avec du méthanol (4.2.1). Mélanger soigneusement par retournement et soniquer (5.8) pendant 15 minutes.
7. 2.3.
Centrifuger (5.9) à 27 000 × g pendant 10 minutes et recueillir la phase surnageante dans une fiole de verre (5.10).
Note: stocker la solution de l'échantillon d'essai à 4 °C jusqu'au moment de l'analyse CLHP.
7. 3. Préparation de la solution étalon externe
7. 3.1.
Peser 55,4 mg de PEDP (4.1) dans une fiole jaugée de 50 ml (5.6) et ajouter environ 25 ml de chloroforme (4.2.2) à l'aide d'un tube gradué (5.11). Chauffer le ballon à bouchon rodé pour le porter à 50 °C ± 1 °C et mélanger soigneusement jusqu'à dissolution du PEDP. Refroidir le ballon à 20 °C, porter jusqu'au trait avec du méthanol (4.2.1) et mélanger par retournement.
7. 3.2.
À l'aide d'une pipette, transvaser 1 ml (5.3) de la solution dans une fiole jaugée de 100 ml (5.6) et porter jusqu'au trait avec du méthanol (4.2.1). À l'aide d'une pipette, transvaser 1 ml (5.3) de la solution dans une fiole jaugée de 10 ml (5.6), ajouter 100 μl (5.7) de la solution de tryptamine à 0,15 mM (7.1) et porter jusqu'au trait avec du méthanol (4.2.1). Mélanger par retournement.
Note: stocker la solution de l'échantillon de référence à 4 °C jusqu'au moment de l'analyse CLHP.
7. 4. Préparation du réactif de dérivatisation
Peser 25,0 ± 0,1 mg d'OPA (4.3.4) dans une fiole jaugée de 10 ml (5.6), ajouter 0,5 ml (5.5) de méthanol (4.2.1) et mélanger soigneusement pour dissoudre l'OPA. Porter jusqu'à la marque avec une solution d'acide borique (4.3.2) et ajouter 20 μl de 2-mercaptoéthanol (4.3.3) à l'aide d'une seringue (5.7).
Note: conserver le réactif de dérivatisation à 4 °C dans une fiole de verre sombre; celui-ci reste stable pendant une semaine.
7. 5. Dosage par CLHP
7. 5.1. Solvants d'élution (4.4)
Solvant A: solution de phosphate de sodium dihydrogéné à 0,3 mM et d'acétate de sodium à 3 mM (ajustée à un pH de 6,5 ± 0,1 à l'aide d'acide acétique), méthanol et tétrahydrofurane dans la proportion de 558:440:2 (v/v/v)
Solvant B: méthanol
7. 5.2. Degré d'élution préconisé
| Temps (min.) | Solvant A (%) | Solvant B (%) | Débit (ml/min)
| Initial | 40 | 60 | 0
| 0,1 | 40 | 60 | 0,1
| 5,0 | 40 | 60 | 0,1
| 6,0 | 40 | 60 | 1,0
| 6,5 | 40 | 60 | 1,0
| 9,0 | 36 | 64 | 1,0
| 10,0 | 20 | 80 | 1,0
| 11,5 | 16 | 84 | 1,0
| 12,0 | 16 | 84 | 1,0
| 16,0 | 10 | 90 | 1,0
| 19,0 | 0 | 100 | 1,0
| 20,0 | 0 | 100 | 1,0
| 21,0 | 40 | 60 | 1,0
| 29,0 | 40 | 60 | 1,0
| 30,0 | 40 | 60 | 0
Note: le degré d'élution peut obliger à une légère modification en vue d'obtenir la résolution indiquée au schéma 1.
Température de la colonne: 30 °C.
7. 5.3.
Volume d'injection: 50 μl de réactif de dérivatisation et 50 μl de la solution échantillon
7. 5.4. Équilibrage de la colonne
En commençant l'expérience sur une base quotidienne, rincer la colonne à l'aide d'un solvant B à 100 % pendant 15 minutes puis la régler selon la formule A:B = 40:60 et équilibrer à 1 ml/min pendant 15 minutes. Effectuer un passage à blanc par injection de méthanol (4.2.1).
Note: avant un stockage de longue durée, rincer la colonne à l'aide d'une solution de méthanol et de chloroforme dans la proportion de 80:20 (v/v) pendant 30 minutes.
7. 5.5.
Dosage de la PS et de la PE dans l'échantillon d'essai
7. 5.6.
Effectuer la série d'analyses chromatographiques sans modifier le temps de passage à passage afin d'obtenir des temps de rétention constants. Injecter la solution étalon externe (7.3) toutes les 5 à 10 injections de solution d'échantillon d'essai afin d'évaluer le coefficient de réponse.
Note: nettoyer la colonne par rinçage à l'aide de solvant B à 100 % (7.5.1) pendant au moins 30 minutes tous les 20 à 25 passages.
7. 6. Mode d'intégration
7. 6.1. Pic de PEDP
Éluer le PEDP sous forme d'un seul pic. Déterminer l'aire du pic par intégration de vallée à vallée.
7. 6.2. Pic de tryptamine
Éluer la tryptamine sous forme d'un pic unique (figure 1). Déterminer l'aire du pic par intégration de vallée à vallée.
7. 6.3. Groupes de pics de PS et de PE
Dans les conditions décrites (figure 1), la PS est éluée sous forme de 2 pics en partie non résolus précédés d'un pic mineur. La PE est éluée sous forme de 3 pics principaux en partie non résolus. Déterminer l'aire totale de chaque grappe de pics en fixant la ligne de base comme indiqué sur la figure 1.
8. CALCUL ET EXPRESSION DES RÉSULTATS
Les teneurs en PS et PE de l'échantillon d'essai sont calculées comme suit:
C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2))
où:
Cteneur en PS ou PE (mg/100 g de poudre) dans l'échantillon d'essai
A1aire du pic de PEDP de la solution d'échantillon étalon (7.3)
A2aire du pic de PS ou de PE de la solution d'échantillon d'essai (7.2)
T1aire du pic de la tryptamine de la solution d'échantillon étalon (7.3)
T2aire du pic de la tryptamine de la solution d'échantillon d'essai (7.2).
9. PRÉCISION DE LA MÉTHODE
Note: les valeurs relatives à la répétabilité ont été calculées conformément à la norme internationale FIL (*).
9. 1. Répétabilité
L'écart type relatif de répétabilité, qui exprime la variabilité des résultats d'analyse indépendants obtenus, dans un court intervalle de temps, par le même opérateur utilisant le même appareillage dans les mêmes conditions sur le même échantillon d'essai ne devrait pas dépasser 2 % en valeur relative. Si deux dosages sont effectués dans ces conditions, la différence relative entre les deux résultats ne devrait pas dépasser 6 % de la moyenne arithmétique des résultats.
9. 2. Reproductibilité
Si deux résultats sont obtenus par des opérateurs travaillant dans des laboratoires différents et utilisant des appareillages différents dans des conditions différentes pour l'analyse du même échantillon d'essai, la différence relative entre les deux résultats ne devrait pas dépasser 11 % de la moyenne arithmétique des résultats.
10. RÉFÉRENCES
10. 1.
Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., «Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids.» Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).
Figure 1
Modèle de CLHP des dérivés d'OPA de la phosphatidylsérine (PS) et de la phosphatidyléthanolamine (PE) dans un échantillon de lait écrémé en poudre reconstitué extrait au méthanol. Le mode d'intégration des pics de PS, PE et de la tryptamine (étalon interne) est indiqué.
Minutes
Fluorescence (unités arbitraires)
Appendice II
DÉTECTION DU LACTOSÉRUM PRÉSURE DANS LE LAIT ÉCRÉMÉ EN POUDRE DESTINÉ AU STOCKAGE PUBLIC, AU MOYEN DU DOSAGE DES CASÉINOMACROPEPTIDES PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE À HAUTE PERFORMANCE (CLHP)
1. OBJET ET DOMAINE D'APPLICATION
Cette méthode permet de mettre en évidence la présence de lactosérum présure dans le lait écrémé en poudre destiné au stockage public, par dosage des caséinomacropeptides.
2. RÉFÉRENCE
Norme Internationale ISO 707 - Lait et produits laitiers - Lignes directrices relatives aux méthodes d'échantillonnage.
3. DÉFINITION
La teneur en lactosérum présure sec est définie comme le pourcentage (en masse) déterminé par la teneur en caséinomacropeptides obtenue par la procédure décrite.
4. PRINCIPE
— Reconstitution du lait écrémé en poudre, élimination des matières grasses et des protéines à l'acide trichloracétique, suivies d'une centrifugation ou d'une filtration.
— Détermination de la quantité de caséinomacropeptides (CMP) présents dans le surnageant par chromatographie liquide à haute performance (CLHP).
— Évaluation du résultat obtenu par rapport à des échantillons étalons constitués de lait écrémé en poudre exempts ou additionnés d'un pourcentage connu de lactosérum en poudre.
5. RÉACTIFS
Tous les réactifs sont de qualité analytique reconnue. L'eau utilisée est de l'eau distillée ou de l'eau ayant une pureté au moins équivalente.
5. 1. Solution d'acide trichloracétique
Dissoudre 240 g d'acide trichloracétique (CCl3COOH) dans de l'eau et compléter à 1 000 ml. La solution doit être transparente et incolore.
5. 2. Solution éluante, pH 6,0
Dissoudre 1,74 g de phosphate dipotassique (K2HPO4), 12,37 g de phosphate monopotassique (KH2PO4) et 21,41 g de sulfate de sodium (Na2SO4) dans 700 ml d'eau environ. Ajuster, si nécessaire, à un pH de 6,0 à l'aide d'une solution d'acide phosphorique ou d'hydroxyde de potassium.
Compléter jusqu'à 1 000 ml avec de l'eau et homogénéiser.
Note: la composition de l'éluant peut être adaptée en fonction du certificat de conformité aux normes ou des recommandations du fabricant du matériau de garnissage de la colonne.
Filtrer la solution éluante, avant l'utilisation, sur une membrane filtrante de 0,45 micromètre (μm) de diamètre de pore.
5. 3. Solution de lavage
Mélanger un volume d'acétonitrile (CH3CN) à 9 volumes d'eau. Filtrer le mélange, avant utilisation, sur une membrane filtrante de 0,45 μm de diamètre de pore.
Note: toute autre solution de lavage ayant un effet bactéricide et n'altérant pas l'efficacité de résolution des colonnes peut être utilisée.
5. 4. Échantillons étalons
5. 4.1.
Lait écrémé en poudre répondant aux exigences du présent règlement, soit [0]
5. 4.2.
Le même lait écrémé en poudre adultéré à 5 % (m/m) par du lactosérum en poudre de type présuré de composition standard, soit [5]
6. INSTRUMENTS
6. 1.
Balance analytique
6. 2.
Centrifugeuse (facultative) pouvant atteindre une force centrifuge de 2 200 g et munie de tubes à centrifuger bouchés d'une capacité d'environ 50 ml
6. 3.
Agitateur mécanique
6. 4.
Agitateur magnétique
6. 5.
Entonnoirs en verre, d'environ 7 cm de diamètre
6. 6.
Papiers filtres, filtration moyenne, d'environ 12,5 cm de diamètre
6. 7.
Dispositif de filtration en verre muni de membrane filtrante de 0,45 micromètre de diamètre de pore
6. 8.
Pipettes graduées, permettant de délivrer 10 ml (ISO 648, classe A ou ISO/R 835) ou système pouvant délivrer 10,0 ml en deux minutes
6. 9.
Système pouvant délivrer 20,0 ml d'eau à 50 °C environ
6. 10.
Bain-marie thermostaté réglé à 25 ± 0,5 °C
6. 11.
Équipement CLHP comprenant:
6. 11.1. Pompe
6. 11.2. Injecteur, manuel ou automatique, d'une capacité de 15 à 30 μl
6. 11.3. Deux colonnes en série TSK 2 000-SW (longueur 30 cm, diamètre intérieur 0,75 cm) ou colonnes équivalentes (ex. une TSK 2 000-SWxl et une Agilent Technologies Zorbax GF 250) et une précolonne (3 cm × 0,3 cm) garnie de I 125 ou d'un matériau d'efficacité équivalente
6. 11.4. Four à colonne thermostaté réglé à 35 ± 1 °C
6. 11.5. Détecteur UV à longueur d'onde variable, permettant d'effectuer des mesures à 205 nm à une sensibilité de 0,008 Å
6. 11.6. Intégrateur pouvant intégrer de vallée à vallée
Note: il est possible de travailler avec des colonnes maintenues à température ambiante mais leur pouvoir de résolution est légèrement plus faible. Dans ce cas, les variations de température au cours d'une même série d'analyses doivent être inférieures à ± 5 °C.
7. ÉCHANTILLONNAGE
7. 1.
Le prélèvement des échantillons est effectué selon la procédure prévue par la norme internationale ISO 707. Les États membres peuvent toutefois utiliser une autre méthode d'échantillonnage pour autant que cette dernière soit conforme aux principes de la norme précitée
7. 2.
Conserver l'échantillon dans des conditions telles qu'aucune détérioration ou modification de composition ne puisse intervenir
8. MODE OPÉRATOIRE
8. 1. Préparation de l'échantillon d'essai
Transvaser le lait en poudre dans un récipient d'une capacité équivalant environ au double du volume de la poudre, muni d'un couvercle étanche à l'air. Fermer le récipient immédiatement. Bien mélanger le lait en poudre par retournements successifs du récipient.
8. 2. Prise d'essai
Peser 2,000 ± 0,001 g d'échantillon d'essai dans un tube à centrifuger (point 6.2) ou dans un ballon à bouchon rodé (50 ml).
8. 3. Élimination des matières grasses et des protéines
8. 3.1.
Ajouter 20,0 ml d'eau chaude (50 °C) à la prise d'essai. Dissoudre la poudre en agitant pendant 5 minutes à l'aide de l'agitateur mécanique (6.3). Placer le tube dans le bain-marie (6. 10) et ramener la température du tube à 25 °C.
8. 3.2.
Ajouter, en deux minutes, 10,0 ml de la solution d'acide trichloracétique (5.1) à 25 °C environ, tout en agitant vigoureusement à l'aide de l'agitateur magnétique (6.4). Placer le tube dans le bain-marie (6.10) et l'y maintenir 60 minutes.
8. 3.3.
Centrifuger (6.2) à 2 200 g pendant 10 minutes ou filtrer sur papier (6.6). Rejeter les 5 premiers millilitres de filtrat.
8. 4. Détermination chromatographique
8. 4.1.
Injecter de 15 à 30 μl, mesurés exactement, de surnageant ou de filtrat (8.3.3) dans l'appareil CLHP (6.11) sous un débit de 1,0 ml de solution éluante (5.2) par minute.
Note 1: en fonction du diamètre intérieur des colonnes utilisées ou des instructions du fabricant de la colonne, un autre débit peut être utilisé.
Note 2: lors de chaque interruption, rincer les colonnes à l'eau. Ne jamais y laisser la solution éluante (5.2).
Avant toute interruption supérieure à 24 heures, rincer les colonnes à l'eau puis les laver avec la solution (5.3) pendant au moins 3 heures sous un débit de 0,2 ml par minute.
8. 4.2.
Les résultats de l'analyse chromatographique de l'échantillon d'essai [E] sont obtenus sous la forme d'un chromatogramme où chaque pic est identifié par son temps de rétention RT, soit:
| Pic II: | deuxième pic du chromatogramme dont le RT est de 12,5 minutes environ.
| Pic III: | troisième pic du chromatogramme, correspondant aux CMP, dont le RT est de 15,5.
La qualité des colonnes peut influer considérablement sur le temps de rétention des différents pics.
L'intégrateur (6.11.6) calcule automatiquement l'aire A de chaque pic, soit:
| AII: | aire du pic II,
| AIII: | aire du pic III,
Afin de détecter les anomalies éventuelles dues soit à un mauvais fonctionnement de l'appareillage ou des colonnes, soit à l'origine et à la nature de l'échantillon analysé, il est nécessaire d'observer l'aspect de chaque chromatogramme avant toute interprétation quantitative.
En cas de doute, répéter l'analyse.
8. 5. Étalonnage
8. 5.1.
Appliquer aux échantillons étalons (5.4) le mode opératoire exact décrit aux points 8.2 à 8.4.2
Utiliser des solutions fraîchement préparées car les CMP se dégradent en milieu trichloracétique à 8 %. En effet, leur teneur diminue approximativement de 0,2 % par heure à 30 °C.
8. 5.2.
Avant de procéder à toute détermination chromatographique des échantillons, conditionner les colonnes par injections répétées de la solution (8.5.1) de l'échantillon étalon (5.4.2) jusqu'à ce que l'aire et le temps de rétention du pic correspondant aux CMP soient constants
8. 5.3.
Déterminer les coefficients de réponse R en injectant le même volume de filtrat (8.5.1) que celui utilisé pour les échantillons
9. EXPRESSION DES RÉSULTATS
9. 1. Mode de calcul et formules
9. 1.1. Calcul des coefficients de réponse R:
| Pic II: | RII = 100/(AII[0])
où:
RIIle coefficient de réponse des pics II,
AII [0]l'aire des pics II de l'échantillon étalon [0] obtenue au point 8.5.3.
| Pic III: | RIII = W/(AIII[5] – AIII[0])
où:
RIIIle coefficient de réponse du pic III,
AIII [0] and AIII [5]les aires du pic III obtenues au point 8.5.3 respectivement dans les échantillons étalons [0] et [5],
Wla quantité de lactosérum contenue dans l'échantillon étalon [5], soit 5.
9. 1.2. Calcul de l'aire relative des pics de l'échantillon [E]
SII[E] = RII × AII[E]
SIII[E] = RIII × AIII[E]
SIV[E] = RIV × AIV[E]
où:
SII [E], SIII [E], SIV [E]respectivement les aires relatives des pics II, III et IV dans l'échantillon [E],
AII [E], AIII [E]respectivement les aires des pics II et III dans l'échantillon [E] obtenues au point 8.4.2,
RII, RIIIle coefficient de réponse calculé au point 9.1.1.
9. 1.3. Calcul du temps de rétention relatif du pic III de l'échantillon [E]:
RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5])
où:
RRTIII [E]le temps de rétention relatif du pic III dans l'échantillon [E],
RTIII [E]le temps de rétention du pic III dans l'échantillon [E] obtenu au point 8.4.2,
RTIII [5]le temps de rétention du pic III de l'échantillon témoin [5] obtenu au point 8.5.3.
9. 1.4. Les expériences ont révélé qu'il existe une relation linéaire entre le temps de rétention relatif du pic III, soit RRTIII [E], et le pourcentage de lactosérum en poudre ajouté pour atteindre 10 %
— RRTIII [E] est < 1,000 quand la teneur en lactosérum est > 5 %,
— RRTIII [E] est ≥ 1,000 quand la teneur en lactosérum est ≤ 5 %.
Une marge d'erreur de ± 0,002 est appliquée aux valeurs de RRTIII.
Normalement, la valeur de RRTIII [0] s'écarte très peu de 1,034. Selon l'état des colonnes, cette valeur peut se rapprocher de 1,000 mais elle doit toujours lui être supérieure.
9. 2. Calcul du pourcentage de lactosérum présure en poudre dans l'échantillon
W = SIII[E] – [1, 3 + (SIII[0] – 0, 9)]
où:
Wle pourcentage m/m de lactosérum présure présent dans l'échantillon [E];
SIII [E]l'aire relative du pic III de l'échantillon d'essai [E] obtenue au point 9.1.2;
1,3représente l'aire moyenne relative du pic III exprimée en grammes de lactosérum présure pour 100 g déterminée dans du lait écrémé en poudre non adultéré d'origines diverses (chiffre obtenu expérimentalement);
SIII [0]représente l'aire relative du pic III qui est égale à RIII × AIII [0] (valeurs obtenues respectivement aux points 9.1.1 et 8.5.3);
(SIII [0] – 0,9)représente la correction à apporter à l'aire relative de 1,3 quand SIII [0] est différent de 0,9. Expérimentalement, l'aire moyenne relative du pic III de l'échantillon témoin [0] est de 0,9.
9. 3. Précision de la procédure
9. 3.1. Reproductibilité
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou dans un court intervalle de temps par le même analyste utilisant le même appareillage sur le même matériel d'essai ne doit pas dépasser 0,2 % m/m.
9. 3.2. Reproductibilité
La différence entre deux résultats individuels et indépendants obtenus dans deux laboratoires différents sur du matériel d'essai identique ne doit pas dépasser 0,4 % m/m.
9. 4. Interprétation
9. 4.1.
Conclure à l'absence de lactosérum si l'aire relative du pic III, SIII [E], exprimée en grammes de lactosérum présure pour 100 grammes de produit, est ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9),
où:
| 2,0 | = la valeur maximale autorisée pour l'aire relative du pic III compte tenu de l'aire moyenne relative du pic III, à savoir 1,3, de la marge d'erreur due aux variations de la composition du lait écrémé en poudre et de la reproductibilité de la méthode (9.3.2)
| (SIII [0] – 0,9) | = la correction à apporter quand la surface SIII [0] est différente de 0,9 (voir point 9.2)
9. 4.2.
Si l'aire relative du pic III, SIII [E] est > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) et l'aire relative du pic II, SII [E] ≤ 160, déterminer la teneur en lactosérum présure comme indiqué au point 9.2.
9. 4.3.
Si l'aire relative du pic III, SIII [E] est > 2,0 + (SIII [0] – 0,9) et l'aire relative du pic II, SII [E] ≤ 160, déterminer la teneur en matières protéiques totales (P %); examiner ensuite les graphiques 1 et 2.
9. 4.3.1. Les données obtenues après analyse d'échantillons de laits écrémés en poudre non adultérés, à teneur en matières protéiques totales élevée, sont regroupées dans les graphiques 1 et 2.
La droite figurant en trait plein représente la droite de régression linéaire dont les coefficients sont calculés par la méthode des moindres carrés.
La droite figurant en trait discontinu fixe la limite supérieure de l'aire relative du pic III, avec une probabilité de ne pas être dépassée dans 90 % des cas.
Les équations des droites en trait discontinu des graphiques 1 et 2 sont respectivement égales à:
| SIII = 0,376 P % – 10,7 | (graphique 1)
| SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93 | (graphique 2)
où, respectivement:
SIIIl'aire relative du pic III calculée soit d'après la teneur en matières protéiques totales, soit d'après l'aire relative du pic SII [E];
P%la teneur en matières protéiques totales exprimée en pourcentage pondéral,
SII [E]l'aire relative de l'échantillon calculée au point 9.1.2.
Ces équations sont équivalentes au chiffre 1,3 mentionné au point 9.2.
L'écart (T1 et T2) entre la surface relative SIII [E] trouvée et la surface relative SIII est donné par les relations suivantes: T1 = SIII[E] – [(0,376 P% – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)]
9. 4.3.2.
| Si T1 et/ou T2 | sont inférieurs ou égaux à zéro, la présence de lactosérum présure ne peut être établie.
| Si T1 et/ou T2 | sont supérieurs à zéro, l'échantillon contient du lactosérum présure.
La teneur en lactosérum présure est calculée selon la formule suivante: W = T2 + 0,91
où:
0,91 représente l'écart sur l'axe vertical entre la droite en trait plein et la droite en trait discontinu.
Pic II
Lait écrémé en poudre
Teneur en matières protéiques totales (en %)
Pic III
Pic III
Lait écrémé en poudre
Appendice III
DÉTERMINATION DU LACTOSÉRUM PRÉSURE SEC DANS LE LAIT ÉCRÉMÉ EN POUDRE
1. OBJECTIF: DÉTECTION D'ADDITION DE LACTOSÉRUM PRÉSURE SEC DANS LE LAIT ÉCRÉMÉ EN POUDRE
2. RÉFÉRENCES: NORME INTERNATIONALE ISO 707
3. DÉFINITION
La teneur en lactosérum présure sec est définie comme le pourcentage en masse déterminé par la teneur en caséinomacropeptides par la procédure décrite.
4. PRINCIPE
Les échantillons sont analysés pour détecter les caséinomacropeptides A par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (méthode CLHP). L'évaluation du résultat est obtenue par référence aux échantillons étalons constitués de lait écrémé en poudre avec et sans addition de lactosérum en poudre. Des résultats supérieurs à 1 % (m/m) indiquent la présence de lactosérum présure sec.
5. RÉACTIFS
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue. L'eau utilisée est de l'eau distillée ou de l'eau ayant une pureté au moins équivalente. L'acétonitrile doit être de qualité spectroscopique ou de qualité CLHP.
5. 1. Solution d'acide trichloracétique
Dissoudre 240 g d'acide trichloracétique (CCl3COOH) dans de l'eau et compléter jusqu'à 1 000 ml. La solution doit être transparente et incolore.
5. 2. Éluants A et B
Éluant A: introduire, dans une fiole jaugée de 1 000 ml, 150 ml d'acétonitrile (CH3CN), 20 ml d'isopropanol (CH3CHOHCH3), et 1,00 ml d'acide trifluoracétique (TFA, CF3COOH). Compléter jusqu'à 1 000 ml avec de l'eau.
Éluant B: introduire, dans une fiole jaugée de 1 000 ml, 550 ml d'acétonitrile, 20 ml d'isopropanol et 1,00 ml de TFA. Compléter jusqu'à 1 000 ml avec de l'eau. Filtrer la solution éluante, avant l'utilisation, sur une membrane filtrante de 0,45 micromètre (μm) de diamètre de pore.
5. 3. Conservation de la colonne
Après les analyses, la colonne est rincée avec l'éluant B (à l'aide d'un gradient) puis rincée avec de l'acétonitrile (à l'aide d'un gradient pendant 30 minutes). La colonne est conservée dans l'acétonitrile.
5. 4. Échantillons étalons
5. 4.1.
Lait écrémé en poudre répondant aux exigences pour le stockage public, soit [0].
5. 4.2.
Le même lait écrémé en poudre adultéré à 5 % (m/m) par du lactosérum en poudre de type présuré de composition standard, soit [5].
5. 4.3.
Le même lait écrémé en poudre adultéré à 50 % (m/m) par du lactosérum en poudre de type présuré de composition standard, soit [50].
6. INSTRUMENTS
6. 1.
Balance analytique
6. 2.
Centrifugeuse (facultative) pouvant atteindre une force centrifuge de 2 200 g et munie de tubes à centrifuger bouchés d'une capacité d'environ 50 ml
6. 3.
Agitateur mécanique
6. 4.
Agitateur magnétique
6. 5.
Entonnoirs en verre, d'environ 7 cm de diamètre
6. 6.
Papiers filtres, filtration moyenne, d'environ 12,5 cm de diamètre
6. 7.
Dispositif de filtration en verre muni de membrane filtrante de 0,45 micromètre de diamètre de pore
6. 8.
Pipettes graduées, permettant de délivrer 10 ml (ISO 648, classe A ou ISO/R 835) ou un système pouvant délivrer 10,0 ml en deux minutes
6. 9.
Système pouvant délivrer 20,0 ml d'eau à 50 °C environ
6. 10.
Bain-marie thermostaté réglé à 25 ± 0,5 °C
6. 11.
Équipement CLHP comprenant:
6. 11.1. Pompe à gradient binaire
6. 11.2. Injecteur, manuel ou automatique, de 100 microlitres (μl) de capacité
6. 11.3. Une colonne Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (longueur: 25 cm, diamètre intérieur: 0,46 cm) ou une colonne en phase inverse équivalente, à base de silice, à larges pores
6. 11.4. Four à colonne thermostaté réglé à 35 ± 1 °C
6. 11.5. Détecteur UV à longueur d'onde variable, permettant d'effectuer des mesures à 210 nm (si nécessaire, une longueur d'onde supérieure pouvant atteindre 220 nm peut être utilisée) à une sensibilité de 0,02 Å
6. 11.6. Intégrateur pouvant intégrer la ligne de base commune ou intégrer de vallée à vallée
Note: il est possible de travailler avec des colonnes maintenues à température ambiante à condition que cette température ambiante ne fluctue pas plus de 1 °C; sinon, on constate des variations assez grandes dans le temps de rétention des CMPA.
7. ÉCHANTILLONNAGE
7. 1.
Le prélèvement des échantillons est effectué selon la procédure prévue par la norme internationale ISO 707. Les États membres peuvent toutefois utiliser une autre méthode d'échantillonnage pour autant que cette dernière soit conforme aux principes de la norme précitée.
7. 2.
Conserver l'échantillon dans des conditions telles qu'aucune détérioration ou modification de composition ne puisse intervenir
8. MODE OPÉRATOIRE
8. 1. Préparation de l'échantillon d'essai
Transvaser le lait en poudre dans un récipient d'une capacité équivalant environ au double du volume de la poudre, muni d'un couvercle étanche à l'air. Fermer le récipient immédiatement. Bien mélanger le lait en poudre par retournements successifs du récipient.
8. 2. Prise d'essai
Peser 2,00 ± 0,001 g d'échantillon d'essai dans un tube à centrifuger (point 6.2) ou dans un ballon à bouchon rodé (50 ml).
Note: en cas de mélanges, peser une quantité d'échantillon d'essai permettant d'aboutir à une prise d'échantillon dégraissée correspondant à 2,00 g.
8. 3. Élimination des matières grasses et des protéines
8. 3.1.
Ajouter 20,0 ml d'eau chaude (50 °C) à la prise d'essai. Dissoudre la poudre en agitant pendant cinq minutes à l'aide de l'agitateur mécanique (point 6.3). Placer le tube dans le bain-marie (6. 10) et ramener la température du tube à 25 °C.
8. 3.2.
Ajouter, en deux minutes, 10,0 ml de la solution d'acide trichloracétique à 25 °C (5.1), tout en agitant vigoureusement à l'aide de l'agitateur magnétique (6.4). Placer le tube dans le bain-marie (6.10) et l'y maintenir 60 minutes.
8. 3.3.
Centrifuger (6.2) à 2 200 g pendant dix minutes, ou filtrer sur papier (6.6), rejeter les cinq premiers millilitres de filtrat.
8. 4. Détermination chromatographique
8. 4.1.
La méthode CLHP en phase inverse exclut la possibilité de résultats faux positifs dus à la présence de babeurre acide en poudre.
8. 4.2.
Avant de mettre en œuvre l'analyse CLHP en phase inverse, il faut optimiser les conditions de gradient. Un temps de rétention de 26 minutes ± 2 minutes pour les CMPA est idéal pour les systèmes à gradient ayant un volume mort d'environ 6 ml (volume du point où les solvants se retrouvent au volume de la boucle de l'injecteur compris). Dans le cas de systèmes à gradient ayant un volume mort inférieur (par exemple 2 ml), on devrait appliquer comme temps de rétention optimal une durée de 22 minutes.
Préparer les échantillons étalons (5.4) sans et avec 50 % de lactosérum présure.
Injecter 100 μl de surnageant ou de filtrat (8.3.3) dans l'appareil CLHP en utilisant les conditions du gradient de référence indiquées au tableau 1.
Tableau 1
Conditions du gradient de référence pour l'optimalisation de la chromatographie
|
Temps
(min.)
|
Débit
(ml/min.)
| % A | % B | Courbe
| Début | 1,0 | 90 | 10 | *
| 27 | 1,0 | 60 | 40 | linéaire
| 32 | 1,0 | 10 | 90 | linéaire
| 37 | 1,0 | 10 | 90 | linéaire
| 42 | 1,0 | 90 | 10 | linéaire
La comparaison des deux chromatogrammes doit faire apparaître le pic de CMPΑ.
À l'aide de la formule ci-dessous, la composition du solvant initial à utiliser pour le gradient normal (voir le point 8.4.3) peut être calculée comme % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 1,11
où:
RTcmpAtemps de rétention des CMPΑ dans le gradient de référence
10le % B initial du gradient de référence
2,5% B au point central moins % B au début dans le gradient normal
13,5temps à mi-parcours du gradient de référence
26temps de rétention nécessaire pour les CMPA
6rapport des pentes du gradient de référence et du gradient normal
30% B initial moins % B à 27 minutes dans le gradient de référence
27temps de parcours du gradient de référence.
8. 4.3. Injection des échantillons d'essai:
Injecter 100 μl, mesurés exactement, de surnageant ou de filtrat (8.3.3) dans l'appareil CLHP sous un débit de 1,0 ml de solution éluante (5.2) par minute.
La composition de l'éluant au début de l'analyse découle du point 8.4.2. Elle est normalement proche de A:B = 76:24 (point 5.2). Immédiatement après l'injection, on démarre le gradient linéaire pour arriver après 27 minutes à un pourcentage B supérieur de 5 %. Puis, on démarre le gradient linéaire qui amène la composition de l'éluant B à 90 % en cinq minutes. Cette composition est maintenue pendant cinq minutes. Puis, toujours à l'aide d'un gradient linéaire, revenir à la composition initiale en 5 minutes. Selon le volume interne du système de pompage, l'injection suivante peut être faite 15 minutes après avoir atteint les conditions initiales.
Note 1: le temps de rétention des CMPA doit être de 26 minutes ± 2 minutes, ce qui peut être obtenu en modifiant les conditions initiales et les conditions finales du premier gradient. Cependant, la différence dans le % B entre les conditions initiales et les conditions finales du premier gradient doit rester de 5 % B.
Note 2: les éluants doivent être dégazés suffisamment et doivent également être conservés dégazés. Cette exigence est indispensable au bon fonctionnement du système de pompage du gradient. L'écart type concernant le temps de rétention du pic de CMPA doit être inférieur à 0,1 minute (n = 10).
Note 3: tous les cinq échantillons, il y a lieu d'injecter et d'utiliser l'échantillon de référence [5] pour calculer un nouveau coefficient de réponse R (voir 9.1.1).
8. 4.4. Les résultats de l'analyse chromatographique de l'échantillon d'essai (E) sont obtenus sous la forme d'un chromatogramme où le pic de CMPA est identifié par son temps de rétention d'environ 26 minutes
L'intégrateur (6.11.6) calcule automatiquement la hauteur de pic H du pic de CMPA. La ligne de base doit être vérifiée pour chaque chromatogramme. L'analyse ou l'intégration doit être répétée si la ligne de base est incorrectement située.
Note: si le pic de CMPA est suffisamment séparé des autres pics, il convient d'utiliser la ligne de base de vallée à vallée. Dans le cas contraire, appliquer des perpendiculaires de transfert vers une ligne de base commune dont le point de départ doit être voisin du pic de CMPA (et donc à un moment différent de t = 0 min!). Utiliser le même type d'intégration pour l'étalon et les échantillons et vérifier, en cas d'utilisation d'une ligne de base commune, qu'elle est cohérente pour les échantillons et l'étalon.
Afin de détecter les anomalies éventuelles dues soit à un mauvais fonctionnement de l'appareillage ou de la colonne, soit à l'origine et à la nature de l'échantillon analysé, il est nécessaire d'observer l'aspect de chaque chromatogramme avant toute interprétation quantitative. En cas de doute, répéter l'analyse.
8. 5. Étalonnage
8. 5.1.
Appliquer aux échantillons étalons (points 5.4.1 et 5.4.2) le mode opératoire exact décrit aux points 8.2 à 8.4.4. Utiliser des solutions fraîchement préparées car le CMP se dégrade en milieu d'acide trichloracétique à 8 %, à température ambiante. À 4 °C la solution reste stable pendant 24 heures. Dans le cas de longues séries d'analyses, il est opportun d'utiliser un plateau d'échantillon refroidi dans l'injecteur automatique.
Note: le point 8.4.2 peut être omis si le % B aux conditions initiales est connu à partir d'analyses antérieures.
Le chromatogramme de l'échantillon de référence [5] doit être conforme à la figure 1. Sur cette figure, le pic du CMPA est précédé par deux petits pics. Il est indispensable d'obtenir une séparation comparable.
8. 5.2.
Avant de procéder à toute détermination chromatographique des échantillons, injecter 100 μl de l'échantillon étalon sans lactosérum présure [0] (5.4.1).
Le chromatogramme ne doit pas présenter de pic au temps de rétention du pic de CMPA.
8. 5.3.
Déterminer les coefficients de réponse R en injectant le même volume de filtrat (8.5.1) que celui utilisé pour les échantillons.
9. EXPRESSION DES RÉSULTATS
9. 1. Mode de calcul et formules
9. 1.1. Calcul du coefficient de réponse R:
pic de CMPA: R = W/H
où:
Rle coefficient de réponse du pic de CMPA
Hla hauteur du pic de CMPA
Wla quantité de lactosérum dans l'échantillon étalon [5].
9. 2. Calcul du pourcentage de lactosérum présure en poudre dans l'échantillon
W(E) = R × H(E)
où:
W(E)le pourcentage (m/m) de lactosérum présure dans l'échantillon (E)
Rle coefficient de réponse du pic de CMPA (9.1.1)
H(E)la hauteur du pic de CMPA de l'échantillon (E)
Si W(E) est supérieur à 1 % et si la différence entre le temps de rétention et celui de l'échantillon étalon [5] est inférieure à 0,2 minute, la présence de lactosérum présure sec est démontrée.
9. 3. Précision de la procédure
9. 3.1. Répétabilité
La différence entre les résultats de deux déterminations effectuées simultanément ou dans un court intervalle de temps par le même analyste utilisant le même appareillage sur le même matériel d'essai ne doit pas dépasser 0,2 % m/m.
9. 3.2. Reproductibilité
Non déterminée.
9. 3.3. Linéarité
Jusqu'à 16 % de lactosérum présure, on obtient une relation linéaire avec un coefficient de corrélation > 0,99.
9. 4. Interprétation
La limite de 1 % tient compte d'une marge d'erreur due à la reproductibilité.
Figure 1
Étalon Ni-4.6
Absorbance (220 nm)
Temps (minutes)
CMP A
(*) Norme FIL internationale 135B/1991. Lait et produits laitiers. Caractéristiques de fidélité des méthodes d'analyse. Schéma d'une méthode d'étude en collaboration.
PARTIE II
Livraison et conditionnement du lait écrémé en poudre
1. Le lait écrémé en poudre est emballé dans des sacs neufs propres, secs et intacts, répondant aux exigences suivantes:
a) les sacs se composent d'un minimum de trois plis qui, ensemble, correspondent à un minimum de 420 J/m2 TEA average;
b) le deuxième pli est recouvert d'un pli de polyéthylène de 15 g/m2 au minimum;
c) à l'intérieur des plis en papier se trouve un sac de polyéthylène d'une épaisseur minimale de 0,08 mm, soudé au fond;
d) les sacs sont conformes à la norme EN 770;
e) lors du remplissage, le sac doit être bien tassé. La pénétration de poudre en vrac entre les différents plis ne peut en aucun cas être permise.
2. Le sac porte au moins les indications suivantes, le cas échéant, transcrites en code:
a) le numéro d'agrément identifiant l'usine et l'État membre de production;
b) la date de fabrication ou, le cas échéant, la semaine de fabrication;
c) le numéro du lot de fabrication;
d) la dénomination «lait écrémé en poudre spray».
3. Le stockeur tient un registre dans lequel les indications visées au point 2 sont inscrites le jour de l'entrée en stock.