L’annexe du règlement ((CE) No 440/2008 est modifiée comme suit:
(1) Dans la partie B, le chapitre B.4 est remplacé par le texte suivant the following:
«B.4 EFFET IRRITANT/CORROSIF AIGU SUR LA PEAU
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 404 (2015) de l’OCDE. Régulièrement mises à jour, les lignes directrices de l’OCDE pour les essais de produits chimiques intègrent les meilleures données scientifiques disponibles. La révision de la ligne directrice 404 a porté plus particulièrement sur les possibilités d’améliorer le traitement des animaux de laboratoire et sur l’évaluation de toutes les informations existantes se rapportant aux produits chimiques testés en vue d’éviter les tests inutiles sur animaux. Cette nouvelle version de la ligne directrice 404 (initialement adoptée en 1981 et révisée en 1992, 2002 et 2015) comprend une référence au Document Guide sur les Approches Intégrées en matière d’Essai et d’Évaluation pour l’irritation et la corrosion de la peau (1). Ce Document Guide propose une approche modulaire pour les tests d’irritation et de corrosion de la peau. L’approche intégrée décrit plusieurs modules qui regroupent les sources d’information et les outils d’analyse, et i) fournit des guides sur la façon d’intégrer et d’utiliser les informations existantes sur les données d’essai et autres données pour l’évaluation du potentiel irritant et corrosif pour la peau des produits chimiques testés, et ii) propose une approche dans les cas où des tests supplémentaires sont recommandés (1). La présente méthode d’essai recommande également d’opter, si cela s’avère nécessaire, pour une application successive plutôt que simultanée des trois timbres sur l’animal dans l’essai in vivo initial.
2. Les définitions de l’irritation et de la corrosion cutanées sont données en annexe à cette méthode d’essai.
CONSIDÉRATIONS INITIALES
3. Pour assurer à la fois la fiabilité des résultats scientifiques et le bien-être animal, on ne procédera pas aux essais in vivo tant que toutes les données relatives au caractère éventuellement corrosif ou irritant pour la peau du produit chimique d’essai n’auront pas été évaluées au cours d’une analyse de leur valeur, telle que décrite dans le Document Guide sur les Approches Intégrées en matière d’Essai et d’Évaluation pour l’irritation et la corrosion de la peau (1), c’est-à-dire selon chacune des trois parties de ce Guide et de chacun des modules correspondants. De façon concise, la partie 1 couvre les données existantes reparties dans sept modules comprenant les données humaines in vivo, les données in vitro, les propriétés physico-chimiques (par exemple le pH, en particulier s’il est fortement acide ou alcalin) et les données autres que provenant d’essais. La partie 2 comprend une analyse des données existantes. Si cette analyse ne permet pas de conclure, la partie 3 doit être mise en œuvre avec des essais supplémentaires, en partant des essais in vitro, étant donné que les essais in vivo ne seront considérés qu’en dernier ressort. Cette analyse doit donc permettre de diminuer le recours aux essais in vivo de l’effet corrosif ou irritant sur la peau des produits chimiques pour lesquels des études précédentes ont déjà livré suffisamment d’informations quant à ces deux aspects.
PRINCIPE DE L’ESSAI IN VIVO
4. Une seule dose du produit chimique d’essai est appliquée sur la peau de l’animal choisi pour l’expérience, les zones non traitées de la peau de l’animal servant de témoin. L’expérimentateur observe et note selon une échelle de valeurs le degré d’irritation ou de corrosion à intervalles déterminés, et le décrit de façon plus détaillée afin de fournir une évaluation complète des effets. La durée de l’étude doit être suffisante pour permettre d’évaluer la réversibilité des effets observés.
5. Les animaux qui manifestent des signes persistants de détresse et/ou de douleurs aiguës à n’importe quel stade de l’essai doivent être euthanasiés, et ces symptômes seront pris en compte dans l’évaluation du produit chimique d’essai. Les critères régissant la décision d’euthanasier les animaux moribonds et souffrants fortement sont exposés dans un autre document d’orientation (2).
PRÉPARATION DE L’ESSAI IN VIVO
Sélection de l’espèce animale
6. On choisira de préférence de jeunes adultes sains parmi les lapins albinos. L’utilisation d’une autre espèce sera justifiée, le cas échéant.
Préparation des animaux
7. Environ 24 heures avant l’essai, la région dorsale du tronc des animaux sera tondue à ras. On prendra soin de ne pas égratigner leur peau et seuls des animaux présentant une peau saine et intacte seront utilisés.
8. La fourrure de certaines souches de lapins est plus touffue par endroits et ce phénomène est plus marqué à certaines périodes de l’année. Ces plages à forte pilosité ne doivent pas recevoir la substance d’essai.
Conditions d’hébergement et d’alimentation
9. Les animaux sont placés dans des cages individuelles. La température du local expérimental est réglée à 20 °C (±3 °C) pour les lapins. Si l’humidité relative doit atteindre au moins 30 pour cent sans excéder de préférence 70 pour cent, en dehors des heures de nettoyage du local, on s’efforcera de maintenir le taux d’humidité autour de 50 à 60 pour cent. On appliquera un éclairage artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. Les lapins seront nourris avec un mélange classique pour animaux de laboratoire et boiront de l’eau potable à volonté.
MODE OPÉRATOIRE
Application de la substance d’essai
10. Le produit chimique d’essai est appliqué sur une petite zone (environ 6 cm2) de la peau et recouverte par une compresse de gaze, assujettie au moyen d’un sparadrap non irritant. Si l’application directe est impossible (dans le cas de liquides ou de certaines pâtes, par exemple), le produit chimique d’essai est d’abord appliqué sur la compresse de gaze, laquelle est ensuite placée sur la peau. La compresse doit être maintenue en contact souple avec la peau à l’aide d’un pansement semi-occlusif durant la période d’exposition. Si le produit chimique d’essai est déposé sur la compresse, celle-ci doit être fixée sur la peau de façon à ce que le produit chimique soit réparti uniformément et entre bien en contact avec celle-ci. On fera en sorte que l’animal n’ait pas accès à la compresse et ne puisse ingérer ou inhaler le produit chimique d’essai.
11. Les produits chimiques liquides sont généralement testés à l’état non dilué. Si le produit chimique est solide (il peut être pulvérisé si nécessaire), il y a lieu de l’humidifier avec la plus petite quantité d’eau (ou au besoin d’un autre véhicule approprié) nécessaire à assurer un bon contact avec la peau. Lorsqu’on utilise un véhicule autre que l’eau, l’influence éventuelle du véhicule sur l’irritation de la peau par le produit chimique d’essai doit être minimale.
12. À la fin de la période d’exposition, qui dure normalement 4 heures, on enlève ce qui peut l’être du produit chimique d’essai restant, avec de l’eau ou un solvant approprié sans interférer avec la réaction ni altérer l’intégrité de l’épiderme.
Dose
13. Une dose de 0,5 ml de liquide ou de 0,5 g de solide ou de pâte est appliquée sur la plage à tester.
Essai initial (essai d’irritation/corrosion cutanée in vivo sur un seul animal)
14. Dès lors qu’un produit chimique d’essai est jugé corrosif, irritant ou non classé d’après l’analyse des données existantes ou d’essais in vitro préalables, tout essai sur animal s’avère superflu. Toutefois, si l’on estime que des données supplémentaires sont nécessaires, le test in vivo est conduit initialement en utilisant un seul animal et en respectant la procédure suivante. Jusqu’à trois timbres d’essai sont appliqués successivement sur l’animal. Le premier timbre est enlevé après trois minutes. Si aucune réaction cutanée grave n’est constatée, un deuxième timbre est appliqué à un endroit différent et retiré après une heure. Si les observations effectuées à ce stade indiquent que l’exposition peut être étendue à quatre heures sans que cela fasse trop souffrir l’animal, l’expérimentateur appliquera un troisième timbre durant quatre heures et attribuera une cote à la réaction.
15. Si un effet corrosif est détecté à l’issue d’une des trois expositions séquentielles, l’essai s’achève immédiatement. Si aucun effet corrosif n’est relevé après l’enlèvement du troisième timbre, l’animal est gardé en observation durant 14 jours, à moins qu’un effet corrosif se déclare avant.
16. Dans les cas où l’on s’attend à ce que le produit chimique d’essai soit peut-être irritant, mais pas corrosif, un seul timbre sera appliqué sur un animal durant quatre heures.
Essai confirmatoire (essai d’irritation cutanée sur des animaux supplémentaires)
17. Si l’essai initial ne révèle aucun effet corrosif, il convient de confirmer la réaction irritante ou négative sur deux animaux supplémentaires, traités chacun avec un timbre maintenu durant quatre heures. Si l’essai initial produit un effet irritant, l’essai confirmatoire peut être conduit en mode séquentiel ou par l’exposition simultanée de deux animaux supplémentaires. Au cas exceptionnel où l’essai initial ne serait pas pratiqué, deux ou trois animaux peuvent être traités au moyen d’un seul timbre appliqué durant quatre heures. Si l’on utilise deux animaux et qu’ils expriment la même réaction, il n’est pas nécessaire de poursuivre l’essai. Dans le cas contraire, le troisième animal est également testé. L’utilisation d’animaux supplémentaires pourra être requise si les réactions sont équivoques.
Période d’observation
18. La durée de la période d’observation devrait être suffisante pour permettre d’évaluer complètement la réversibilité des effets observés. Il faudra cependant mettre fin à l’expérience dès que l’animal montre des signes persistants de douleur ou de détresse aiguës. La réversibilité des effets est déterminée par l’observation des animaux sur une période s’étendant jusqu’à 14 jours après l’enlèvement des timbres. Si la réaction s’avère réversible avant le quatorzième jour, l’expérience s’achève à ce moment-là.
Observations cliniques et cotation des réactions cutanées
19. L’observation des signes d’érythème et d’oedème chez tous les animaux et la cotation des réactions s’effectuent au bout de 60 minutes et ensuite 24, 48 et 72 heures après l’enlèvement du timbre. S’agissant de l’animal du test initial, la plage soumise à l’épreuve est aussi examinée immédiatement après l’enlèvement du timbre. Les réactions cutanées sont cotées et consignées conformément à l’échelle figurant dans le tableau ci-dessous. Si la peau présente des lésions qui n’accusent pas l’irritation ou la corrosion après 72 heures, il pourra être nécessaire d’observer l’animal jusqu’au quatorzième jour afin de déterminer la réversibilité des effets. En plus de l’observation de l’irritation, tous les effets toxiques locaux, tels que le dégraissage de la peau, et tout effet systémique nocif (par exemple, des effets se manifestant par des signes cliniques de toxicité et sur le poids corporel) doivent être relevés et décrits en détail. L’examen histopathologique est à envisager au cas où il faut éclaircir des réactions équivoques.
20. La cotation des réactions cutanées est forcément subjective. L’harmonisation de la cotation des réactions cutanées et l’appui aux laboratoires d’essai ainsi qu’au personnel chargé d’effectuer et d’interpréter les observations passent par une formation adéquate des expérimentateurs au système de cotation utilisé (voir tableau ci-dessous). Un manuel illustré sur la cotation de l’irritation cutanée et d’autres lésions pourrait être utile (10).
RÉSULTATS ET RAPPORT
21. Les résultats de l’étude devraient être récapitulés dans un tableau joint au rapport d’essai final et couvrir tous les aspects énumérés au paragraphe 24.
Évaluation des résultats
22. Le degré d’irritation cutanée devrait être évalué conjointement avec la gravité des lésions et leur caractère réversible. Les cotes individuelles ne fournissent pas une valeur absolue des propriétés irritantes d’une substance, celles-ci étant évaluées parallèlement à d’autres effets de la substance. En revanche, les cotes individuelles doivent être considérées comme des valeurs de référence, à évaluer en combinaison avec toutes les autres observations effectuées au cours de l’étude.
23. L’évaluation des réactions d’irritation doit tenir compte de la réversibilité des lésions cutanées. Si des réactions, telles que l’alopécie (sur une aire limitée), l’hyperkératose, l’hyperplasie et la desquamation, persistent jusqu’à la fin de la période d’observation de 14 jours, il y a lieu de considérer le produit chimique d’essai comme irritant.
Rapport d’essai
24. Le rapport d’essai doit contenir les informations suivantes:
Justification de l’essai in vivo:
— analyse de la valeur des résultats disponibles avant l’essai, notamment des résultats de la démarche expérimentale séquentielle;
— description des données pertinentes livrées par des essais précédents;
— données obtenues à chaque étape de la démarche expérimentale;
— description des essais in vitro effectués exposant le détail des procédures et les résultats obtenus avec les substances d’essai et de référence;
— comment l’analyse de la valeur des résultats a débouché sur la décision de conduire l’étude in vivo.
Produit chimique d’essai:
— substance mono-constituant:identification chimique, notamment désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro(s) CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale et/ou autres identifiants, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent;
— substance multi-constituants, substance de composition inconnue ou variable, produits réactionnels complexes et matériaux biologiques (UVCB) ou mélange: caractérisation, dans la mesure du possible, par exemple par l’identité chimique (voir ci-dessus), la pureté, les caractéristiques quantitatives et les propriétés physico-chimiques pertinentes (voir ci-dessus) des constituants, selon les données disponibles;
— apparence physique, hydrosolubilité, solubilité dans le DMSO et autres propriétés physico-chimiques pertinentes, selon les données disponibles;
— source et numéro de lot si disponible;
— traitement du produit chimique d’essai avant la conduite de l’essai, s’il y a lieu (par exemple chauffage, broyage);
— stabilité du produit chimique d’essai, date de péremption, ou date de vérification analytique si disponible;
— conditions de stockage et stabilité, selon les données disponibles.
Véhicule:
— identification, concentration (s’il y a lieu), volume utilisé;
— justification du choix du véhicule.
Animaux d’expérience
— espèce/souche utilisée, justification de l’utilisation éventuelle d’un animal autre que le lapin albinos;
— nombre d’animaux de chaque sexe;
— poids de chaque animal au début et à la fin de l’essai;
— âge des animaux au début de l’essai;
— source des animaux, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.
Conditions expérimentales:
— technique de préparation du site d’application;
— détails concernant la composition du timbre et la technique d’application de ce dernier;
— détails sur la préparation, l’application et l’enlèvement du produit chimique d’essai.
Résultats:
— tableau faisant apparaître, pour chaque animal et à chaque relevé, les cotes attribuées aux réactions d’irritation/corrosion observées;
— description de toutes les lésions observées;
— description circonstanciée de la nature et du degré d’irritation ou de corrosion observé, et de tout effet histopathologique;
— description de tout autre effet local néfaste (par exemple le dégraissage de la peau) et des effets systémiques.
Discussion des résultats.
Conclusions
BIBLIOGRAPHIE
(1) OCDE (2014). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No. 203.) Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
(2) OCDE (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as Endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998
(3) OCDE (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
Tableau
Cotation des réactions cutanées
Formation d’érythème et d’escarre
| Pas d’érythème… | 0
| Érythème très léger (à peine perceptible)… | 1
| Érythème bien défini… | 2
| Érythème modéré à grave… | 3
| Érythème grave (rouge violacé) à formation d’escarre empêchant la cotation de l’érythème… | 4
| Maximum possible: 4
Formation d’oedème
| Pas d’oedème… | 0
| Oedème très léger (à peine perceptible)… | 1
| Oedème léger (pourtour de la zone oedémateuse bien délimité par une enflure nette)… | 2
| Oedème modéré (enflure d’environ 1 mm)… | 3
| Oedème grave (enflure de plus de 1 mm s’étendant au-delà de l’aire exposée)… | 4
| Maximum possible: 4
| Un examen histopathologique pourra être conduit pour éclaircir des réactions douteuses.
»
(2) Dans la partie B, le chapitre B.17 est remplacé par le texte suivant:
«B.17 ESSAIS IN VITRO DE MUTATION GÉNIQUE SUR CELLULES DE MAMMIFÈRES UTILISANT LES GÈNES HPRT ET XPRT
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 476 (2016) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Les méthodes d’essai sont régulièrement révisées à la lumière des progrès scientifiques, de l’évolution des exigences règlementaires et du bien-être des animaux. La présente version révisée de la méthode d’essai B.17 reflète les connaissances scientifiques acquises après plus de trente années d’expérience de cet essai et résulte également des évolutions d’une nouvelle méthode d’essai distincte, consacrée aux essais in vitro de mutation génétique sur les cellules de mammifères menés en utilisant le gène TK (thymidine kinase). La méthode B.17 s’inscrit dans une série de méthodes d’essai sur la toxicologie génétique. L’OCDE a élaboré un document qui fournit des éléments d’information concis sur les essais de toxicologie génétique et donne un aperçu des récents changements qui ont été apportés aux lignes directrices de toxicité génétique de l’OCDE(1).
2. L’essai in vitro de mutation génétique sur les cellules de mammifères a pour objectif de détecter des mutations induites par des produits chimiques. Les lignées cellulaires utilisées dans ces essais mesurent les mutations directes dans les gènes rapporteurs, en particulier le gène endogène de l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase (Hprt pour les cellules de rongeur, HPRT pour les cellules humaines; collectivement désignés dans la présente méthode d’essai par gène Hprt et test HPRT), et le transgène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transférase (gpt) (dénommé test XPRT). Les tests de mutation HPRT et XPRT détectent différents éventails d’effets génétiques. Outre les mutations détectées par le test HPRT (substitutions d’une paire de base par une autre, décalages du cadre de lecture, petites délétions et insertions), l’emplacement autosomique du transgène gpt peut permettre de détecter des mutations résultant de délétions importantes et même d’une recombinaison mitotique, qui ne sont pas détectées par le test HPRT parce que le gène Hprt est situé sur le chromosome X (2) (3) (4) (5) (6) (7). À l’heure actuelle, le test XPRT est moins utilisé que le test HPRT à des fins réglementaires.
3. Les définitions des termes employés sont présentées à l’appendice1.
REMARQUES PRÉMIMINAIRES ET LIMITES
4. Les essais conduits in vitro requièrent généralement une source exogène d’activation métabolique, mais celle-ci est incapable de reproduire parfaitement les conditions in vivo.
5. On prendra soin d’éviter les conditions susceptibles de conduire à de faux résultats positifs (à savoir une possible interaction avec le système d’essai) non causés par une interaction directe entre le produit chimique d’essai et le matériel génétique de la cellule; ces conditions peuvent être une modification du pH ou de l’osmolalité (8) (9) (10) une interaction avec les composants du milieu (11) (12) ou une cytotoxicité excessive (13). Une cytotoxicité supérieure aux plafonds recommandés tels que définis au paragraphe 19 est considérée comme excessive pour le test HPRT.
6. Avant d’utiliser la méthode d’essai sur un mélange pour obtenir des données à des fins réglementaires, il convient de vérifier si, et dans l’affirmative pourquoi, elle peut fournir des résultats acceptables dans ce cadre réglementaire. Cette vérification n’est pas nécessaire si l’essai du mélange répond à des exigences réglementaires.
PRINCIPE DE L’ESSAI
7. Des cellules mutantes déficientes en Hprt dans le test HPRT ou en xprt dans le test XPRT sont résistantes aux effets cytostatiques de la 6-thioguanine (TG), un analogue de la purine. Les cellules munies de l’enzyme Hprt (dans le test HPRT) ou du Gpt (dans le test XPRT) sont sensibles à la TG, qui entraîne une inhibition du métabolisme et l’arrêt de la division cellulaire. Ainsi, des cellules mutantes peuvent proliférer en présence de TG, tandis que des cellules normales qui contiennent l’enzyme Hprt (test HPRT) ou gpt (test XPRT), ne le peuvent pas.
8. Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées au produit chimique d’essai, en présence et en l’absence d’une source exogène d’activation métabolique (voir paragraphe 14), pendant une période appropriée (3-6 heures). Les cellules sont repiquées afin de déterminer la cytotoxicité et de laisser le phénotype s’exprimer avant la sélection des mutants (14) (15) (16) (17). On détermine la cytotoxicité en mesurant la survie relative (SR), à savoir l’efficacité de clonage mesurée immédiatement après le traitement et ajustée pendant le traitement en fonction d’une éventuelle perte cellulaire par rapport au témoin négatif (paragraphe 18 et appendice 2). Les cultures traitées sont maintenues dans un milieu de croissance pendant une période de temps suffisante, caractéristique de chaque type de cellule, afin de permettre une expression phénotypique quasi-optimale des mutations induites (habituellement 7-9 jours minimum). Une fois l’expression phénotypique obtenue, on détermine la fréquence des mutants en ensemençant avec un nombre connu de cellules un milieu contenant l’agent sélectif permettant de détecter les colonies de mutants. Dans un milieu exempt d’agent sélectif, on détermine l’efficacité de clonage (viabilité). Après un temps d’incubation approprié, les colonies sont comptées. On corrige le nombre de colonies de mutants de l’efficacité de clonage au moment de la sélection des mutants pour obtenir la fréquence des mutants.
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Préparations
Cellules
9. Les types de cellules utilisés pour les tests de mutation HPRT et XPRT doivent avoir une sensibilité prouvée aux mutagènes chimiques, une efficacité de clonage élevée, un caryotype stable et une fréquence stable de mutants spontanés. Les cellules les plus fréquemment utilisées pour le test HPRT incluent les lignées CHO, CHL et V79 de cellules de hamster chinois, L5178Y de cellules de lymphome de souris, et TK6 de cellules humaines lymphoblastoïdes (18) (19). Les cellules AS52 qui dérivent des lignées CHO et contiennent le transgène gpt (mais pas le gène Hprt) sont utilisées pour le test XPRT (20) (21); L’utilisation d’autres lignées cellulaires doit être justifiée et validée.
10. La stabilité du caryotype et l’absence de contamination par des mycoplasmes sont vérifiées régulièrement dans les lignées cellulaires (22) (23), et les cellules sont écartées si une contamination ou une modification du caryotype est constatée. La durée normale du cycle cellulaire utilisée dans le laboratoire d’essai doit être établie et doit correspondre aux caractéristiques cellulaires publiées. Il convient également de contrôler la fréquence de mutants spontanés dans le stock de cellules maîtresses, et ce stock ne devra pas être utilisé si la fréquence de mutants n’est pas acceptable.
11. Avant d’employer les cultures dans l’essai, il peut être nécessaire de les débarrasser des cellules mutantes qu’elles contiennent, par exemple en utilisant un milieu de culture HAT pour le test HPRT et MPA pour le test XPRT (5) (24) (voir l’appendice 1). Les cellules nettoyées peuvent être cryopréservées, puis décongelées pour servir de stocks de travail. Il est possible d’utiliser pour le test le stock de travail tout juste décongelé une fois atteints les temps de doublement normaux. Dans le cas d’un test XPRT, la culture de routine de cellules AS52 doit se faire dans des conditions qui assurent le maintien du transgène gpt (20).
Milieu et conditions de culture
12. Il convient d’utiliser un milieu de croissance et des conditions d’incubation (récipients de culture, atmosphère humidifiée à 5 % de CO2, et température d’incubation de 37 °C) appropriés pour les cultures. Les cultures cellulaires doivent toujours être maintenues dans des conditions qui garantissent leur croissance en phase exponentielle. Il est particulièrement important de choisir des milieux et des conditions de culture qui stimulent la croissance optimale des cellules pendant la période d’expression et l’efficacité optimale du clonage pour les cellules mutantes et non mutantes.
Préparation des cultures
13. Les lignées cellulaires sont multipliées à partir de cultures mères, placées dans un milieu de culture à une densité telle que les cellules en suspension ou en monocouche poursuivront leur croissance de manière exponentielle pendant les périodes de traitement et d’expression (il convient par exemple d’éviter que les cellules qui se multiplient en monocouche arrivent à confluence).
Activation métabolique
14. Le recours à un système d’activation métabolique exogène est nécessaire en cas d’utilisation de cellules dotées d’une capacité métabolique endogène inadéquate. Le système le plus couramment utilisé, recommandé par défaut, sauf justification contraire, est une fraction post-mitochondriale enrichie en cofacteur (S9), préparée à partir de foies de rongeurs (généralement des rats) traités avec des inducteurs enzymatiques comme l’Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) ou un mélange de phénobarbital et ß-naphthoflavone (29) (30) (31) (32). L’utilisation de ce mélange n’est pas contraire à la Convention de Stockholm sur les polluants organiques persistants (33) et s’est révélée aussi efficace que celle de l’Arcolor 1254 pour l’induction d’oxydases à fonction mixte (29) (31). La fraction S9 est généralement utilisée à une concentration comprise entre 1 et 2 % (v/v) mais peut être portée à 10 % v/v dans le milieu d’essai final. Le choix du type et de la concentration du système d’activation métabolique exogène ou de l’inducteur métabolique utilisé pourra dépendre de la classe des substances chimiques à tester (34) (35) (36).
Préparation du produit chimique d’essai
15. Les produits chimiques solides à tester sont dissous dans un solvant approprié puis, le cas échéant, dilués avant application (voir paragraphe 16). Avant le traitement, les produits chimiques liquides peuvent être ajoutés directement et/ou après dilution au système d’essai. Les produits gazeux ou volatils nécessitent une modification appropriée des protocoles standards, par exemple l’utilisation de récipients de culture hermétiquement clos (37) (38). Il convient de préparer les produits chimiques d’essai juste avant le traitement, à moins que les données concernant la stabilité ne démontrent qu’ils peuvent être stockés.
CONDITIONS EXPÉRIMENTALES
Solvants
16. Le solvant doit être choisi de manière à optimiser la solubilité des produits chimiques d’essai, sans engendrer d’effets néfastes sur la conduite de l’essai, c’est-à-dire sans modifier la croissance cellulaire, nuire à l’intégrité du produit chimique testé, réagir avec les récipients de culture ou détériorer le système d’activation métabolique. On recommande d’envisager d’abord l’utilisation d’un solvant (ou milieu de culture) aqueux chaque fois que cela est possible. L’eau et le diméthylsulfoxyde sont des exemples de solvants couramment utilisés. En règle générale, les solvants organiques ne doivent pas dépasser 1 % (v/v) et les solvants aqueux (salin ou eau) 10 % (v/v) dans le milieu de traitement final. L’emploi d’un solvant inhabituel (éthanol ou acétone, par exemple) doit être justifié par des données faisant état de sa compatibilité avec le produit chimique d’essai et le système d’essai, ainsi que de son absence de génotoxicité aux concentrations utilisées. En l’absence de telles données, il est important d’ajouter dans l’essai des témoins non traités (voir l’appendice 1) afin de démontrer que le solvant choisi n’entraîne aucun effet délétère ou mutagène.
Mesure de la cytotoxicité cellulaire et choix des concentrations d’exposition
17. Lors de la détermination de la plus forte concentration de produit chimique testé, on évitera les concentrations susceptibles de produire de fausses réponses positives, notamment celles qui engendrent une cytotoxicité excessive (voir paragraphe 20), une précipitation dans le milieu de culture (voir paragraphe 21), ou une modification marquée du pH ou de l’osmolalité (voir paragraphe 5). Si le produit chimique testé provoque une modification marquée du pH du milieu au moment de son ajout, il est possible d’ajuster le pH par tamponnage du milieu de traitement final de manière à éviter les faux résultats positifs et à maintenir des conditions de culture appropriées.
18. La concentration est sélectionnée en fonction de la cytotoxicité et d’autres considérations (voir paragraphes 20-22). Un essai préliminaire visant à évaluer la cytotoxicité peut s’avérer utile pour mieux cerner les concentrations à utiliser dans l’essai principal, mais il n’est pas obligatoire. Même si une évaluation initiale de la cytotoxicité a été effectuée, il reste indispensable de mesurer la cytotoxicité pour chaque culture dans le cadre de l’expérience principale. La cytotoxicité est évaluée au regard de la survie relative (SR), à savoir l’efficacité de clonage (EC) des cellules étalées sur plaque immédiatement après le traitement, ajustée en fonction d’une éventuelle perte de cellules en cours de traitement et fondée sur le nombre de cellules, par rapport à l’efficacité ajustée du clonage sur les témoins négatifs (à qui l’on a attribué une survie de 100 %) (voir les formules à l’appendice 2).
19. Il convient d’évaluer au moins quatre concentrations d’essai (sans compter les témoins positifs et les témoins avec solvant) remplissant les critères d’acceptabilité (cytotoxicité appropriée, nombre de cellules, etc.). Alors que l’utilisation de cultures en double exemplaires est recommandée, chacune des cultures réalisées en un seul ou plusieurs exemplaires peut être utilisée à chaque concentration d’essai. Les résultats obtenus pour chacune des répliques (cultures réalisées en plusieurs exemplaires) à une concentration donnée doivent faire l’objet de rapports distincts mais peuvent être regroupés pour l’analyse des données (17). Pour les produits chimiques dont la cytotoxicité est faible ou nulle, des niveaux de concentrations espacés d’un facteur de 2 à 3 environ conviendront généralement. En cas de cytotoxicité, les concentrations d’essai retenues doivent couvrir une plage englobant la concentration produisant une cytotoxicité et les concentrations pour lesquelles une cytotoxicité modérée, faible ou nulle est observée. De nombreux produits chimiques d’essai présentent des courbes concentration-réponse à forte pente et, afin de couvrir toute la plage de valeurs de la cytotoxicité ou pour étudier en détail la relation concentration-réponse, il pourra s’avérer nécessaire d’utiliser des concentrations plus rapprochées et plus de quatre concentrations, notamment dans les cas où il est nécessaire de répéter l’expérience (voir paragraphe 43). Si l’on réalise des cultures en un seul exemplaire, il peut être particulièrement important d’utiliser plus de 4 concentrations.
20. Si la concentration maximale est basée sur la cytotoxicité, la concentration la plus forte doit viser une cytotoxicité comprise entre 20 et 10 % SR. Les résultats positifs présents uniquement à une SR inférieure ou égale à 10 % doivent être interprétés avec prudence (paragraphe 43).
21. Pour les produits chimiques d’essai peu solubles qui ne sont pas cytotoxiques à des concentrations inférieures à la concentration insoluble la plus faible, la plus forte concentration analysée doit produire une turbidité ou un précipité visible à l’œil nu ou à l’aide d’un microscope inversé à la fin du traitement avec le produit chimique testé. Même si une cytotoxicité intervient au-delà de la concentration insoluble la plus faible, il est recommandé de tester une seule concentration produisant une turbidité ou un précipité visible, car de fausses réponses pourraient découler de ce précipité. À la concentration produisant un précipité, il convient de s’assurer que ce dernier n’interfère pas avec la conduite de l’essai. Il peut être utile de déterminer la solubilité dans le milieu de culture préalablement à l’essai.
22. Si aucun précipité ou aucune cytotoxicité limitante ne sont observés, la concentration d’essai maximale doit correspondre à la plus basse parmi 10 mM, 2 mg/ml ou 2 μl/ml (39) (40). Lorsque la composition du produit chimique testé n’est pas définie, par exemple dans le cas de substances de composition inconnue ou variable, de produits de réaction complexes ou de matériels biologiques (substances chimiques UVCB) (41), de produits extraits de l’environnement etc., il peut être nécessaire d’augmenter la concentration maximale (5 mg/ml par exemple), en absence de cytotoxicité suffisante, afin d’accroître la concentration de chacun des composants. Il convient toutefois de noter que ces exigences peuvent être différentes pour les produits pharmaceutiques à usage humain (42).
Témoins
23. Des témoins négatifs concomitants (voir paragraphe 16), constitués uniquement du solvant dans le milieu de traitement et testés de la même façon que les cultures traitées, doivent être inclus pour chaque condition expérimentale.
24. Des témoins positifs concomitants sont nécessaires pour démontrer la capacité du laboratoire d’identifier les mutagènes dans les conditions du protocole d’essai utilisé, ainsi que l’efficacité du système d’activation métabolique exogène, le cas échéant. Le tableau 1 ci-dessous présente des exemples de témoins positifs. D’autres substances chimiques peuvent être utilisées comme témoins positifs, si cela est justifié. Étant donné que les essais in vitro de génotoxicité sur cellules de mammifères sont suffisamment normalisés, les tests appliquant des traitements avec et sans activation métabolique exogène peuvent être menés en utilisant uniquement un témoin positif exigeant une activation métabolique. Dans ce cas, cette seule réponse dans un témoin positif démontrera à la fois l’activité du système d’activation métabolique et la réactivité du système d’essai. Chaque témoin positif doit être utilisé à une ou plusieurs concentrations devant normalement donner lieu à une augmentation reproductible et détectable par rapport à la valeur de fond afin de démontrer la sensibilité du système d’essai, et la réponse ne doit pas être compromise par une cytotoxicité supérieure aux limites fixées dans la présente méthode d’essai (voir paragraphe 20).
Tableau 1
Substances de référence recommandées pour la vérification des compétences du laboratoire et pour la sélection des témoins positifs
| Condition d’activation métabolique | Locus | Substance chimique et No CAS.
| en l’absence d’une activation exogène | Hprt | Méthanesulfonate d’éthyle [no CAS 62-50-0] Ethylnitrosourée [no CAS 759-73-9] Oxyde de nitro-4 quinoléine [no CAS 56-57-5]
| | XPRT | Streptonigrine [no CAS 3930-19-6] Mitomycine C [no CAS 50-07-7]
| en présence d’une activation exogène | Hprt | Méthyl-3 cholantrène [no CAS 56-49-5] Diméthyl7,12 benzanthracène [no CAS 57-97-6] Benzo[a]pyrène [no CAS 50-32-8]
| | XPRT | Benzo[a]pyrène [no CAS 50-32-8]
MODE OPÉRATOIRE
Traitement avec le produit chimique testé
25. Les cellules en prolifération sont traitées avec le produit chimique d’essai en présence et en l’absence d’un système d’activation métabolique. La durée d’exposition doit être suffisante (de 3 à 6 heures sont généralement efficaces).
26. Le nombre minimal de cellules utilisées pour chaque culture d’essai (témoin et traitée) à chaque étape de l’essai doit être basé sur la fréquence de mutants spontanés. Il est conseillé en général de traiter et repiquer suffisamment de cellules pour préserver 10 mutants spontanés dans chaque culture à toutes les phases de l’essai (17). La fréquence des mutants spontanés varie en général entre 5 et 20 × 10-6. Avec une fréquence de mutants spontanés de 5 × 10-6 et pour entretenir un nombre suffisant de mutants spontanés (10 ou plus) même pour les cultures traitées à des concentrations causant une cytotoxicité de 90 % pendant le traitement (10 % de SR), il est nécessaire de traiter au moins 20 × 106 cellules. Il faut en outre qu’un nombre suffisant de cellules (jamais moins de 2 millions) soient cultivées durant la période d’expression et étalées sur plaque pour la sélection des mutants (17).
Délai d’expression phénotypique et mesure de la fréquence des mutants
27. À l’issue de la période de traitement, les cellules sont cultivées de façon à permettre l’expression phénotypique de mutants. Un minimum de 7 à 9 jours suffit en général à l’expression phénotypique presque optimale des mutants Hprt et xprt nouvellement introduits (43) (44). Durant cette période, les cellules sont régulièrement mises en sous-culture pour préserver leur croissance exponentielle. Après l’expression phénotypique, les cellules sont à nouveau étalées sur plaque dans le milieu avec et sans agent sélectif (6-thioguanine) afin de déterminer le nombre de mutants et l’efficacité de clonage au moment de la sélection, respectivement. Cette opération peut se faire avec des boîtes pour cultures monocouche ou avec des plaques micropuits pour cellules en suspension. S’agissant de la sélection des mutants, il convient d’étaler sur des plaques les cellules suivant une densité qui assure la récupération optimale des mutants (en évitant notamment la coopération métabolique) (17). On incube les plaques pendant une durée appropriée à une croissance optimale des colonies (par exemple de 7 à 12 jours), puis on compte les colonies. On corrige le nombre de colonies de mutants par l’efficacité de clonage au moment de la sélection des mutants pour obtenir la fréquence des mutants (voir l’appendice 2 pour les formules).
Compétence du laboratoire
28. Afin d’acquérir une expérience suffisante de l’essai avant de l’utiliser en routine, le laboratoire doit avoir réalisé une série d’expériences avec des substances chimiques positives de référence agissant selon des mécanismes variés (au moins une avec activation métabolique et une sans activation métabolique, sélectionnées parmi les substances chimiques énumérées au tableau 1) et avec plusieurs témoins négatifs (en utilisant divers solvants/véhicules). Ces réponses de témoins positifs et négatifs doivent être cohérentes par rapport à la littérature. Cette exigence ne s’applique pas aux laboratoires possédant déjà une expérience, c’est-à-dire qui disposent d’une base de données historiques telle que définie aux paragraphes 30 à 33.
29. Une sélection de substances chimiques utilisées comme témoins positifs (voir tableau 1) doit être testée en l’absence et en présence d’une activation métabolique, l’objectif étant de démontrer que le laboratoire possède la compétence nécessaire pour détecter des produits chimiques mutagènes, de déterminer l’efficacité du système d’activation métabolique et de prouver l’adéquation des conditions de croissance cellulaire durant le traitement, l’expression phénotypique et la sélection des mutants, ainsi que l’adéquation des procédures d’évaluation. Il conviendra de définir une plage de concentrations des substances chimiques sélectionnées qui permette d’obtenir des augmentations reproductibles et liées à la concentration par rapport aux valeurs de fond, afin de démontrer la sensibilité et la plage dynamique du système d’essai.
Données des témoins historiques
30. Le laboratoire doit établir:
— une plage et une distribution des témoins positifs historiques,
— une plage et une distribution des témoins négatifs (non traités, avec solvant) historiques.
31. Lors de l’acquisition initiale de données en vue d’établir une distribution des témoins négatifs historiques, les données des témoins négatifs concomitants doivent être cohérentes avec les données publiées (22). Puis, à mesure que de nouvelles données expérimentales viennent étoffer la plage de distribution des témoins, les données des témoins négatifs concomitants doivent idéalement se situer dans les limites de contrôle à 95 % de cette distribution (17) (45) (46).
32. La base des données historiques du laboratoire relatives aux témoins négatifs doit à l’origine être constituée à partir d’au moins 10 expériences, sachant qu’il serait préférable qu’elle en compte au moins 20, réalisées dans des conditions expérimentales similaires. Les laboratoires doivent avoir recours à des méthodes de contrôle de la qualité telles que des graphiques statistiques [cartes C ou cartes X-barre, par exemple (47)], afin de déterminer la variabilité de leurs données de témoins positifs et négatifs et de démontrer leur maîtrise de la méthodologie (46). On trouve dans la littérature (45) d’autres recommandations sur la façon de constituer et d’utiliser ces données historiques (critères d’inclusion et d’exclusion des données dans la base et critères d’acceptabilité pour une expérimentation donnée).
33. Les données des témoins négatifs désignent les fréquences des mutants issus de cultures réalisées en un seul exemplaire, ou de préférence de cultures répliquées, comme décrit au paragraphe 23. Les témoins négatifs concomitants se situent idéalement dans les limites de contrôle à 95 % de la distribution des données historiques des témoins négatifs contenues dans la base de données du laboratoire (17) (45) (46). Lorsque les données des témoins négatifs concomitants se situent en dehors des limites de contrôle à 95 %, leur inclusion dans la distribution des témoins historiques peut être acceptable à condition que ces données ne soient pas exagérément extrêmes et qu’il soit prouvé que le système d’essai est «sous contrôle» (voir ci-dessus) et qu’il n’y a pas eu de défaillance technique ou d’erreur humaine.
34. Toute modification du protocole expérimental doit être étudiée en termes de cohérence avec les bases de données des témoins historiques existantes du laboratoire. Toute incohérence majeure doit conduire à l’établissement d’une nouvelle base de données des témoins historiques.
RÉSULTATS ET RAPPORT
Présentation des résultats
35. La présentation des résultats doit inclure toutes les données nécessaires au calcul de la cytotoxicité (exprimée en SR). Les données, tant pour les cultures traitées que témoins, doivent inclure le nombre de cellules à la fin du traitement, le nombre de cellules étalées sur plaque immédiatement après le traitement, et le nombre de colonies (ou de puits sans colonies pour la méthode utilisant des plaques micropuits). Il convient d’exprimer la SR pour chaque culture en pourcentage du témoin concomitant contenant le solvant (Voir les définitions à l’appendice 1).
36. La présentation des résultats doit également inclure toutes les données nécessaires au calcul de la fréquence des mutants. Les données, tant pour les cultures traitées que témoins, doivent inclure: (1) le nombre de cellules étalées sur plaque avec et sans agent sélectif (au moment où les cellules sont étalées sur plaque pour la sélection des mutants), et (2) le nombre de colonies (ou le nombre de puits sans colonies pour la méthode utilisant des micropuits) sur les plaques avec et sans agent sélectif. On corrige le nombre de colonies de mutants (sur les plaques avec agent sélectif) par l’efficacité de clonage (sur les plaques sans agent sélectif) pour obtenir la fréquence des mutants. Il convient d’exprimer la fréquence des mutants en nombre de cellules mutantes par million de cellules viables (Voir les définitions à l’appendice 1).
37. Les données seront présentées séparément pour chaque culture. En outre, toutes les données doivent être résumées sous forme de tableaux.
Critères d’acceptabilité
38. L’acceptation de l’essai repose sur les critères suivants:
— Les données relatives aux témoins négatifs concomitants sont considérées comme pouvant être ajoutées à la base de données des témoins négatifs historiques du laboratoire (voir paragraphe 33).
— Les témoins positifs concomitants (voir paragraphe 24) doivent induire des réponses compatibles avec celles générées dans la base de données des témoins positifs historiques et produire une augmentation statistiquement significative par rapport aux témoins négatifs concomitants.
— Deux conditions expérimentales (à savoir avec et sans activation métabolique) ont été testées, à moins que l’une d’entre elles ait abouti à des résultats positifs (voir paragraphe 25).
— Un nombre adéquat de cellules et de concentrations sont analysables (voir paragraphes 26, 27 et 19).
— Les critères de sélection de la concentration maximale sont cohérents avec ceux décrits aux paragraphes 20, 21 et 22.
Évaluation et interprétation des résultats
39. À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement positif si, dans les conditions expérimentales étudiées:
— au moins une des concentrations d’essai présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant,
— un test de tendance approprié montre que l’augmentation est liée à la concentration,
— des résultats se situent à l’extérieur de la plage de distribution des données des témoins négatifs historiques (limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson, par exemple; voir paragraphe 33).
Lorsque tous ces critères sont remplis, le produit chimique d’essai est considéré comme capable d’induire des mutations génétiques dans les cellules de mammifères en culture dans ce système d’essai. Des recommandations concernant les méthodes statistiques les plus appropriées sont disponibles dans la littérature (46) (48).
40. À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement négatif si, dans toutes les conditions expérimentales étudiées:
— aucune concentration d’essai ne présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;
— un test de tendance approprié montre qu’il n’y a pas d’augmentation liée à la concentration;
— l’intégralité des résultats se situe à l’intérieur de la distribution des données des témoins négatifs historiques (limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson, par exemple; voir paragraphe 33).
Le produit chimique d’essai est alors considéré comme incapable d’induire des mutations génétiques dans les cellules de mammifères en culture dans ce système d’essai.
41. Il n’est pas nécessaire de vérifier une réponse clairement positive ou négative.
42. Lorsque la réponse n’est ni clairement négative ni clairement positive, tel que décrit ci-dessus, ou en vue d’établir la signification biologique d’un résultat, les données doivent être soumises à un jugement d’expert et/ou des investigations plus poussées. Il peut être utile d’examiner des cellules supplémentaires (le cas échéant) ou de répéter l’expérience, éventuellement dans des conditions expérimentales modifiées (espacement des concentrations, autres conditions d’activation métabolique [concentration de S9 ou origine de S9], par exemple).
43. Dans de rares cas, même après de nouvelles investigations, l’ensemble de données ne permettra pas de conclure que les résultats sont positifs ou négatifs. La réponse au produit chimique d’essai devra alors être considérée comme équivoque (et donc potentiellement aussi bien positive que négative).
Rapport d’essai
44. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Produit chimique d’essai:
— source, numéro de lot, date limite d’utilisation, si disponibles;
— stabilité du produit chimique d’essai, si elle est connue;
— solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant, si elles sont connues;
— mesure du pH, de l’osmolalité et de la précipitation dans le milieu de culture auquel le produit chimique d’essai a été ajouté, le cas échéant.
Substance mono-constituant:
— apparence physique, hydrosolubilité, autres propriétés physico-chimiques;
— identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.
Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:
— caractérisée, autant que possible par exemple l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence quantitative et les propriétés physico-chimiques pertinentes des constituants.
Solvant:
— justification du choix du solvant;
— pourcentage de solvant présent dans le milieu de culture final.
Cellules:
Pour les cultures mères du laboratoire:
— type et source des lignées cellulaires;
— nombre de repiquages, le cas échéant, et historique au laboratoire;
— caractéristiques du caryotype et/ou nombre modal de chromosomes;
— méthodes d’entretien des cultures cellulaires;
— absence de mycoplasmes;
— temps de doublement des cellules.
Conditions de l’essai:
— justification du choix des concentrations et du nombre de cultures, y compris données concernant la cytotoxicité et les limites de solubilité, par exemple;
— composition du milieu, concentration de CO2, degré d’humidité;
— concentration du produit chimique d’essai sous la forme de sa concentration finale dans le milieu de culture (par exemple en μg ou mg/ml ou mM du milieu de culture);
— concentration (et/ou volume) de solvant et de produit chimique d’essai ajoutés au milieu de culture;
— température d’incubation;
— temps d’incubation;
— durée du traitement;
— densité des cellules pendant le traitement;
— type et composition du système d’activation métabolique (source du S9, méthode de préparation du mélange S9, concentration ou volume de mélange S9 et de S9 dans le milieu de culture final, contrôles de la qualité du S9);
— substances témoins positives et négatives, concentrations finales pour chacune des conditions de traitement;
— durée de la période d’expression (avec le nombre de cellules déposées et de repiquages et les programmes de nutrition, le cas échéant);
— identité de l’agent sélectif et sa concentration;
— critères d’acceptabilité des essais;
— méthodes utilisées pour dénombrer les cellules viables et les cellules mutantes;
— méthodes utilisées pour mesurer la cytotoxicité;
— toute information supplémentaire concernant la cytotoxicité et la méthode utilisée;
— temps d’incubation après étalement sur une plaque;
— critères pour conclure que l’étude est positive, négative ou équivoque;
— méthodes utilisées pour déterminer le pH, l’osmolalité et la précipitation.
Résultats:
— nombre de cellules exposées et nombre de cellules repiquées pour chaque culture;
— mesures de la cytotoxicité et autres observations le cas échéant;
— signes de précipitation et moment de la détermination;
— nombre de cellules étalées sur plaque dans un milieu sélectif et dans un milieu non sélectif;
— nombre de colonies dans un milieu non sélectif et nombre de colonies résistantes dans un milieu sélectif, et fréquences de mutants correspondantes;
— relation concentration-réponse, si possible;
— données relatives aux témoins négatifs (solvant) et positifs (concentrations et solvants) concomitants;
— données relatives aux témoins négatifs (solvant) et positifs historiques, y compris ordres de grandeur, moyennes, écarts-types et intervalle de confiance (par exemple 95 %) et nombre de données;
— analyses statistiques (pour chaque culture et chaque lot de réplicats, le cas échéant), et valeurs P le cas échéant.
Discussion des résultats.
Conclusion.
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»
(3) Dans la partie B, le chapitre B.22 est remplacé par le texte suivant :
«B.22 ESSAI DE MUTATION LÉTALE DOMINANTE CHEZ LE RONGEUR
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 478 (2016) de l’OCDEpour les essais de produits chimiques. Les méthodes d’essai sont régulièrement mises à jour à la lumière des progrès scientifiques, de l’évolution des exigences réglementaires et de considérations relatives au bien-être des animaux. La présente version modifiée de la méthode d’essai reflète plus de trente années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres essais de toxicité, notamment pour le développement, la reproduction ou encore des essais de génotoxicité; cependant, étant donné les limitations de l’essai et le grand nombre d’animaux utilisés, cet essai n’a pas vocation à être utilisé en première intention, mais plutôt comme méthode d’essai supplémentaire quand il n’existe pas d’alternative pour satisfaire les exigences réglementaires. Combiner différents essais de toxicité permet potentiellement d’épargner un grand nombre d’animaux utilisés dans les tests. L’ODE a élaboré un document qui fournit des éléments d’information concis sur les essais de toxicologie génétique et donne un aperçu des récents changements qui ont été apportés aux lignes directrices de toxicité génétique de l’OCDE(1).
2. L’essai de mutation létale dominante a pour but de détecter si certains produits chimiques engendrent des mutations résultant d’aberrations chromosomiques dans les cellules germinales. En outre, l’essai de mutation létale dominante se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses. L’apparition d’une mutation létale dominante à la suite d’une exposition à un produit chimique d’essai indique que cette substance a affecté le tissu germinal de l’animal étudié.
3. Les mutations létales dominantes provoquent la mort de l’embryon ou du fœtus. L’apparition d’une mutation létale dominante à la suite d’une exposition à un produit chimique indique que cette substance a affecté les cellules germinales de l’animal étudié.
4. Un essai de mutation létale dominante permet de confirmer les résultats positifs d’essais utilisant des indicateurs somatiques in vivo, et constitue un indicateur pertinent pour prédire le risque chez l’homme de pathologies génétiques transmises par le biais des cellules germinales. Cependant cet essai requiert l’utilisation d’un grand nombre d’animaux et mobilise beaucoup de temps de travail, le rendant onéreux et fastidieux à mener. Étant donné la fréquence importante de mutations dominantes létales spontanées, la sensibilité de l’essai pour détecter de faibles augmentations dans la fréquence des mutations est généralement limitée.
5. Les définitions des termes clés figurent à l’appendice 1.
REMARQUES PRÉLIMINAIRES
6. La plupart du temps, l’essai est conduit sur des souris (2) (3) (4), mais d’autres espèces, telles que le rat (5) (6) (7) (8), peuvent être utilisées si cela est justifié sur le plan scientifique. Si, en général, les mutations létales dominantes résultent d’aberrations chromosomiques majeures (anomalies structurales et numériques) (9) (10) (11), l’éventualité de mutations génétiques ne peut être écartée. Une mutation létale dominante est une mutation qui se produit dans une cellule germinale, ou qui se fixe après la fécondation dans le jeune embryon, et qui n’entraîne pas de dysfonctionnement du gamète, mais qui est mortelle pour l’œuf fécondé ou pour l’embryon en cours de développement.
7. Des mâles identifiés sont accouplés successivement avec des femelles vierges, à des intervalles appropriés. Le nombre d’accouplements après le traitement dépend de l’objectif final de l’étude de mutation létale dominante (paragraphe 23) et doit garantir l’évaluation des mutations létales dominantes à toutes les phases de maturation des cellules germinales mâles (12).
8. Cet essai n’est pas pertinent s’il est prouvé que le produit chimique ou son/ses métabolite(s), n’atteindront pas le testicule.
PRINCIPE DE L’ESSAI
9. En général, des animaux mâles sont exposés à un produit chimique d’essai par une voie d’exposition idoine puis accouplés avec des femelles vierges non traitées. Différents types de cellules germinales peuvent être testées en utilisant différents intervalles d’accouplement. À la suite de l’accouplement, les femelles sont euthanasiées après une période de temps appropriée et leur utérus est examiné afin de déterminer le nombre d’embryons implantés, ainsi que celui des embryons vivants et morts. Pour déterminer la létalité dominante d’un produit chimique d’essai, le nombre d’embryons implantés vivants par femelle dans le groupe traité est comparé au nombre d’embryons implantés vivants par femelle dans le groupe témoin véhicule/solvant. L’augmentation du nombre d’embryons implantés morts par femelle dans le groupe traité par rapport au groupe témoin reflète la perte après implantation causée par le produit chimique d’essai. La perte après implantation est calculée en déterminant le rapport du nombre d’embryons implantés morts au nombre total d’embryons implantés dans le groupe traité et en le comparant au rapport du nombre d’embryons implantés morts au nombre total d’embryons implantés dans le groupe témoin. La perte avant implantation peut être évaluée en retranchant au nombre de corps jaunes le nombre total d’embryons implantés, soit le nombre total d’implants par femelle dans le groupe traité et dans le groupe témoin.
VÉRIFICATION DES COMPÉTENCES DU LABORATOIRE
10. La compétence à mener cet essai est établie sur la base d’informations démontrant l’aptitude à reproduire des fréquences de mutations létales dominantes à partir de données publiées (par exemple (13) (14) (15) (16) (17) (18)) avec les substances chimiques utilisées comme témoins positifs (réponses faibles comprises) telles que celles énumérées dans le tableau 1, et les témoins contenant le véhicule, et à obtenir des fréquences de témoin négatif cohérentes avec la plage de données acceptable relatives aux témoins (voir références ci-dessus) ou avec la distribution des données des témoins historiques du laboratoire, le cas échéant.
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Préparations
Choix des espèces animales
11. Il convient d’employer des animaux sains et sexuellement matures issus de souches de laboratoire courantes. Les souris sont habituellement utilisées, mais les rats peuvent également convenir. Toute autre espèce appropriée de mammifère peut être employée à condition qu’une justification scientifique de ce choix soit donnée dans le rapport.
Conditions d’encagement et d’alimentation des animaux
12. Pour les rongeurs, la température de l’animalerie doit être maintenue à 22 °C (±3 °C). L’humidité relative, qui est idéalement de 50 à 60 %, doit atteindre au moins 40 % et de préférence ne pas dépasser 70 %, sauf durant le nettoyage du local. On dispense un éclairage artificiel faisant alterner des séquences de 12 heures de lumière et de 12 heures d’obscurité. Le régime alimentaire des animaux est le régime classique de laboratoire avec eau potable à volonté. Le choix des aliments peut être influencé par la nécessité d’assurer une bonne incorporation du produit chimique dans la nourriture si l’administration se fait par cette voie. Avant le traitement ou l’accouplement, les rongeurs doivent être mis en cage par petits groupes (de cinq maximum) du même sexe si aucun comportement agressif n’est à craindre ou n’est observé, de préférence dans des cages solides dotées d’un enrichissement environnemental approprié. Les animaux peuvent être encagés individuellement si cela est justifié sur le plan scientifique.
Préparation des animaux
13. Des animaux adultes mâles et femelles, sains et sexuellement matures, sont répartis au hasard entre le groupe témoin et les groupes traités. Chaque animal est identifié individuellement selon une méthode sans cruauté, la moins invasive possible (par exemple, baguage, étiquetage, pose d’une puce électronique ou identification biométrique, en évitant l’entaillage des oreilles ou la phalangectomie) et gardés dans leurs cages pendant au moins cinq jours afin qu’ils s’acclimatent aux conditions du laboratoire. Les cages doivent être placées de manière à réduire au minimum l’influence éventuelle de leur disposition sur les résultats. Il convient d’éviter toute contamination croisée entre le témoin positif et le produit chimique d’essai. Au début de l’étude, la variation pondérale des animaux doit être minimale et ne pas dépasser ±20 % du poids moyen de chaque sexe.
Préparation des doses
14. Lorsque les produits chimiques d’essai sont solides, ils sont dissous ou mis en suspension dans des solvants ou des véhicules appropriés, ou incorporés aux aliments ou à l’eau de boisson avant d’être administrés aux animaux. Les produits chimiques liquides peuvent être administrés directement ou dilués avant d’être administrés. En cas d’exposition par inhalation, les produits chimiques d’essai peuvent être administrés sous forme de gaz, de vapeur ou d’aérosol solide ou liquide, en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. On utilisera des préparations fraîches, sauf si l’on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage et définissent les conditions de stockage appropriées.
Conditions de l’essai
Solvant/véhicule
15. Le solvant/véhicule ne doit pas produire d’effets toxiques aux doses utilisées, ni pouvoir réagir avec le produit chimique d’essai. Le recours à des solvants/véhicules inhabituels doit être justifié par des données de référence faisant état de leur compatibilité. On recommande d’envisager d’abord l’utilisation d’un solvant/véhicule aqueux chaque fois que c’est possible. Parmi les exemples de solvants/véhicules compatibles couramment utilisés figurent notamment l’eau, le sérum physiologique, les solutions de méthylcellulose, les solutions de carboxyméthylcellulose sodique, l’huile d’olive et l’huile de maïs.
Témoins positifs
16. Des animaux témoins positifs sont toujours inclus simultanément dans l’essai, à moins que le laboratoire n’ait déjà démontré ses compétences dans la conduite de l’essai et n’ait mené le test en routine récemment (par exemple dans les cinq dernières années). Toutefois, il n’est pas nécessaire de leur administrer le produit témoin positif par la même voie que celle du produit chimique d’essai, ni de réaliser des prélèvements à chaque intervalle d’accouplement. Les substances utilisées comme témoins positifs doivent induire des mutations létales dominantes de façon fiable et dans les mêmes conditions que l’essai. À l’exception du traitement administré, les animaux des groupes témoins sont traités de la même manière que ceux des groupes de traitement.
17. Les doses des substances chimiques utilisées comme témoins positifs sont sélectionnées de manière à produire des effets faibles ou modérés qui permettent d’évaluer de manière critique les performances et la sensibilité de l’essai, mais qui induisent systématiquement des effets létaux dominants. Des exemples de substances chimiques utilisés comme témoins positifs, et des doses idoines, figurent au tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Exemples de substances chimiques utilisées comme témoins positifs
|
Substance chimique [noCAS 51-18-3] (15)
Plage de dose effective (mg/kg)
|
(rongeurs)
Période d’administration
| (en nombre de jours)
| Triéthylènemélamine [no CAS 51-18-3] (15) | 0,25 (souris) | 1
| Cyclophosphamide [no CAS 50-18-0] (19) | 50-150 (souris) | 5
| Cyclophosphamide [no CAS 50-18-0] (5) | 25-100 (rats) | 1
| Méthanesulfonate d’éthyle [no CAS 62-50-0] (13) | 100-300 (souris) | 5
| Acrylamide monomère [no CAS 79-06-1] (17) | 50 (souris) | 5
| Chlorambucil [305-03-3] (14) | 25 (souris) | 1
Témoins négatifs
18. Les animaux témoins négatifs, traités seulement avec le solvant ou avec le véhicule, et traités par ailleurs de manière identique aux groupes témoins, sont inclus à chaque moment de prélèvement (20). En l’absence de données significatives observées ou publiées montrant que le solvant/véhicule choisi n’induit pas de mutation létale dominante ou d’autres effets délétères, des animaux témoins non traités sont également inclus à chaque moment de prélèvement afin d’établir l’acceptabilité du témoin contenant le véhicule.
MODE OPERATOIRE
Nombre d’animaux
19. Des mâles identifiés sont accouplés successivement à des intervalles appropriés prédéterminés (par exemple une fois par semaine, paragraphes 21 et 23) de préférence à une femelle vierge. Un nombre suffisamment important de mâles est prévu (et un nombre correspondant de femelles accouplées à chaque intervalle d’accouplement) afin d’obtenir l’efficacité statistique nécessaire pour détecter une fréquence de mutation létale dominante au moins multipliée par deux (paragraphe 44).
20. Le nombre de femelles par intervalle d’accouplement doit également être défini à l’avance par calculs statistiques, afin de pouvoir détecter au minimum un doublement de la fréquence de mutation létale dominante (c’est-à-dire suffisamment de femelles gravides pour obtenir au moins 400 embryons implantés au total) (20) (21) (22) (23) et escompter au moins un embryon implanté mort par unité d’analyse (soit par groupe d’accouplement et par dose) (24).
Période d’administration et intervalles d’accouplement
21. Le nombre d’accouplements faisant suite au traitement est régi par le déroulement du traitement et doit assurer l’évaluation d’inductions de mutations létales dominantes à toutes les phases de maturation des cellules germinales mâles (12) (25). Pour un traitement unique impliquant jusqu’à cinq doses administrées quotidiennement, il faut compter 8 (pour les souris) ou 10 (pour les rats) accouplements à une semaine d’intervalle après le dernier traitement. En cas d’administrations multiples, le nombre d’accouplements peut être réduit proportionnellement à l’allongement de la période d’administration, tout en conservant pour objectif d’évaluer toutes les phases de la spermatogenèse (par exemple, après une exposition de 28 jours, seuls 4 accouplements par semaine suffisent à évaluer toutes les phases de la spermatogenèse chez la souris). Tous les calendriers de traitement et d’accouplement doivent être scientifiquement justifiés.
22. Les femelles doivent être laissées avec les mâles au moins pendant la durée d’un cycle œstral (par exemple, une semaine couvre un cycle œstral chez la souris et le rat). Les femelles qui ne se sont pas accouplées au cours d’une semaine donnée peuvent être utilisées pour un autre intervalle d’accouplement, ou jusqu’à ce que l’accouplement ait eu lieu, ce qu’indique la présence de sperme dans le vagin ou d’un bouchon vaginal.
23. Le régime d’exposition et d’accouplement retenu dépend de l’objectif final de l’étude de mutation létale dominante. Si elle a pour but de déterminer si un produit chimique donné induit des mutations létales dominantes per se, la méthode retenue consistera alors en l’exposition d’un cycle entier de spermatogenèse (soit 7 semaines chez la souris, à raison de 5 à 7 traitements par semaine) et en un accouplement à la fin du cycle. Cependant, si l’objectif est de recenser le type de cellule germinale sensible à une induction de mutation létale dominante, on préférera une exposition unique ou de 5 jours, suivie d’un accouplement hebdomadaire.
Niveaux de dose
24. Si l’on procède à une étude préliminaire de détermination des doses à administrer parce qu’on ne dispose pas de données fiables pour orienter le choix des doses, cette étude préliminaire doit être effectuée dans le même laboratoire, en utilisant une espèce, une souche, un sexe et un régime de traitement identiques à ceux de l’étude principale (26). Elle devra avoir pour objectif de déterminer la dose maximale tolérée (DMT), définie comme la dose la plus élevée qui sera tolérée sans faire apparaître de toxicité limitante, dans le cadre de la durée de l’étude (par exemple, comportement ou réactions anormaux, baisse mineure du poids corporel ou cytotoxicité du système hématopoïétique), mais ne provoquant pas la mort ou des signes de douleur, de souffrance ou de détresse imposant d’euthanasier les animaux (27).
25. En outre, la DMT ne doit pas affecter l’accouplement (21).
26. Les produits chimiques d’essai ayant une activité biologique spécifique à des niveaux de doses faibles et non toxiques (telles que les hormones et les mitogènes) et ceux dont les propriétés toxicocinétiques sont saturées peuvent être considérés comme des exceptions aux critères de détermination des doses et sont évalués au cas par cas.
27. Pour permettre d’obtenir des informations sur la relation dose-réponse, une étude complète doit comporter un groupe témoin négatif et au moins trois niveaux de doses, espacés en général d’un facteur de 2, mais pas de plus de 4. Si le produit chimique d’essai ne provoque aucune toxicité dans le cadre d’une étude de détermination des doses, ou d’après les données disponibles, la dose la plus élevée pour une administration unique doit être de 2 000 mg/kg de poids corporel. Néanmoins, si le produit chimique d’essai provoque une toxicité, la dose administrée la plus élevée devra correspondre à la DMT et les niveaux de dose employés devront de préférence s’étendre de la dose maximale à une dose induisant peu ou pas de toxicité. Pour les produits chimiques toxiques, la dose limite pour une période d’administration de 14 jours ou plus est de 1 000 mg/kg de poids corporel, et pour des périodes d’administration de moins de 14 jours, la dose limite est de 2 000 mg/kg de poids corporel/jour.
Administration des doses
28. Lors de la conception d’un essai, il convient de tenir compte de la voie d’exposition humaine anticipée. Par conséquent, les voies d’administration telles que l’alimentation, l’eau de boisson, l’inhalation, ainsi que les voies topique, sous-cutanée, intraveineuse, orale (par gavage) ou l’implantation sont autant de choix qui peuvent être considérés comme justifiés. Dans tous les cas, la voie retenue doit permettre une exposition adéquate du/des tissu(s) cible(s). L’injection intrapéritonéale n’est en général pas recommandée, car elle ne constitue pas une voie d’exposition humaine envisagée, et ne sera utilisée qu’en cas de justification scientifique spécifique. Si le produit chimique d’essai est mélangé à l’alimentation ou à l’eau de boisson, surtout dans le cas d’un dosage unique, il convient de s’assurer que le délai entre l’absorption de nourriture et d’eau et l’accouplement est suffisant pour permettre une détection des effets (paragraphe 31). Le volume maximal de liquide administrable en une fois par gavage ou par injection dépend de la taille de l’animal. Ce volume ne doit normalement pas excéder 1 ml/100 g de poids corporel, sauf pour les solutions aqueuses, où un maximum de 2 ml/100 g est acceptable. L’utilisation de volumes plus importants (si la législation relative au bien-être animal le permet) doit être justifiée. Il convient de minimiser la variabilité du volume testé en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant par rapport au poids corporel à tous les niveaux de doses.
Observations
29. Les animaux d’essai font l’objet d’un examen clinique général. Les signes cliniques doivent être consignés au moins une fois par jour, de préférence aux mêmes heures, en prenant en considération la période où les effets anticipés devraient être les plus marqués après l’administration. Au moins deux fois par jour pendant la durée du traitement, l’ensemble des animaux fait l’objet d’un constat de morbidité et de mortalité. Chaque animal doit être pesé au début de l’étude et au moins une fois par semaine pendant les études à doses répétées, ainsi qu’au moment de l’euthanasie. La consommation alimentaire est mesurée au moins une fois par semaine. Si le produit chimique d’essai est administré dans l’eau de boisson, la consommation d’eau est mesurée à chaque changement d’eau et au moins une fois par semaine. Les animaux montrant des signes non létaux de toxicité excessive sont euthanasiés avant la fin de l’essai (27).
Collecte et traitement des tissus
30. Les femelles sont euthanasiées au cours de la seconde moitié de la gestation, au 13e jour de gestation pour les souris et au 14-15e jour de gestation pour les rats. Le contenu de l’utérus est examiné afin de déterminer les effets létaux dominants et de recenser le nombre d’embryons implantés, le nombre d’embryons vivants et morts ainsi que le nombre de corps jaunes.
31. Les cornes utérines et les ovaires sont exposés pour permettre de compter le nombre de corps jaunes, et les fœtus sont ôtés, comptés et pesés. Il convient d’examiner soigneusement l’utérus en vue de déceler et de comptabiliser toutes les résorptions, y compris celles dissimulées par les fœtus vivants. La mortalité fœtale est consignée. Le nombre de femelles fécondées ainsi que le nombre total d’embryons implantés, de pertes avant implantation et de mortalité après implantation (y compris les résorptions précoces et tardives) sont également consignés. De plus, les fœtus visibles peuvent être conservés dans une solution de Bouin pendant au moins 2 semaines, pour un examen ultérieur des principales malformations externes (28) permettant de fournir des informations supplémentaires sur les effets du produit testé sur la reproduction et le développement.
RÉSULTATS ET RAPPORT
Traitement des résultats
32. Les résultats doivent être présentés sous forme d’un tableau qui indique le nombre de mâles accouplés, le nombre de femelles gravides et le nombre de femelles non gravides. Les résultats de chaque accouplement, comprenant l’identité de chaque mâle et de chaque femelle, doivent être mentionnés individuellement. Pour chaque femelle, il convient d’indiquer l’intervalle d’accouplement, le niveau de la dose reçue par les mâles traités et le nombre d’embryons implantés vivants et morts.
33. La perte après implantation est calculée en déterminant le rapport du nombre d’embryons implantés morts au nombre total d’embryons implantés dans le groupe traité et en le comparant au rapport du nombre d’embryons implantés morts au nombre total d’embryons implantés dans le groupe témoin traité avec le véhicule/solvant.
34. La perte avant implantation est calculée comme étant la différence entre le nombre de corps jaunes et le nombre d’embryons implantés ou la réduction du nombre moyen d’embryons implantés par femelle par comparaison avec les accouplements témoins. Quand la perte avant implantation a été évaluée, elle doit être mentionnée.
35. Le facteur létal dominant est estimé comme suit: (embryons morts avant implantation/total des embryons implantés par femelle) × 100.
36. Les données de toxicité et les signes cliniques tels que décrits dans le paragraphe 29 sont consignés dans le rapport.
Critères d’acceptabilité
37. Les critères suivants déterminent l’acceptabilité de l’essai:
— le témoin négatif utilisé simultanément est cohérent avec les normes publiées pour les données relatives aux témoins négatifs historiques ainsi qu’avec les données des témoins historiques du laboratoire, le cas échéant (paragraphes 10 et 18);
— les témoins positifs utilisés simultanément induisent des réponses cohérentes avec les normes publiées pour les données relatives aux témoins positifs historiques ou avec la base de données des témoins positifs historiques du laboratoire, le cas échéant, et produisent une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant (voir paragraphes 17 et 18);
— le nombre idoine d’embryons implantés et de doses est analysé (paragraphe 20);
— les critères de sélection de la dose maximale sont cohérents avec ceux décrits aux paragraphes 24 et 27.
Évaluation et interprétation des résultats
38. Au moins trois groupes de traitement sont analysés pour obtenir des données suffisantes pour l’analyse de la relation dose-réponse.
39. À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement positif si:
— au moins une des doses d’essai présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;
— un test approprié montre que l’augmentation est liée à la dose dans au moins une condition expérimentale (par exemple un intervalle d’accouplement d’une semaine); et
— des résultats se situent à l’extérieur de la plage acceptable relative aux témoins négatifs, ou des données relatives aux témoins négatifs historiques du laboratoire (par exemple, limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson), le cas échéant.
Lorsque tous ces critères sont remplis, le produit chimique d’essai est considéré comme capable d’induire des mutations létales dominantes dans les cellules germinales des animaux testés. Des recommandations concernant les méthodes statistiques les plus appropriées figurent au paragraphe 44; d’autres approches statistiques recommandées sont également disponibles dans la littérature (20) (21) (24) (29). Les méthodes statistiques employées considèrent l’animal comme unité expérimentale.
40. À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement négatif si:
— aucune dose d’essai ne présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;
— aucune condition expérimentale n’a révélé une augmentation liée à la dose; et
— l’intégralité des résultats se situe à l’intérieur de la plage acceptable des données relatives aux témoins négatifs, ou des données relatives aux témoins négatifs historiques du laboratoire (par exemple, limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson), le cas échéant.
Le produit chimique d’essai est alors considéré comme capable d’induire des mutations létales dominantes dans les cellules germinales des animaux testés.
41. Il n’est pas nécessaire de vérifier une réponse clairement positive ou clairement négative.
42. Si la réponse n’est ni clairement négative ni clairement positive, et afin d’établir la signification biologique d’un résultat (par exemple, une augmentation faible ou marginale), les données doivent être soumises à un jugement d’experts et/ou faire l’objet de recherches supplémentaires à l’aide des données expérimentales existantes, notamment les éléments indiquant si le résultat positif se trouve à l’extérieur de la plage acceptable concernant les témoins négatifs1, ou de la distribution des données du laboratoire concernant les témoins négatifs historiques (30).
43. Dans de rares cas, même après de nouvelles investigations, l’ensemble de données ne permettra pas de conclure que les résultats sont positifs ou négatifs; les résultats seront alors déclarés équivoques.
44. Les méthodes statistiques employées considèrent l’animal mâle comme unité expérimentale. S’il est possible que le décompte (par exemple le nombre d’embryons implantés par femelle) suive la loi de Poisson et/ou que certaines proportions (par exemple une proportion d’embryons implantés morts) présentent une distribution binomiale, on observe souvent une surdispersion de ces données (31). Par conséquent, les analyses statistiques doivent d’abord recourir à un test de surdispersion ou de sousdispersion basé sur des tests de la variance tels que le test de variance binomiale de Cochran (32) ou le test de la C (α) de Tarone pour la surdispersion binomiale (31) (33). Si aucun écart par rapport à la dispersion binomiale n’est observé, un test de tendance de Cochran-Armitage peut être effectué pour les tendances de proportions dans les différents niveaux de doses (34) et des comparaisons par paires avec le groupe témoin peuvent être faites à l’aide d’un test exact de Fisher (35). De même, si aucun écart par rapport à la dispersion de Poisson n’est détecté, les tendances des décomptes peuvent être testées à l’aide de la régression de Poisson (36) et des comparaisons par paires avec le groupe témoin peuvent être réalisées dans le contexte du modèle de Poisson, à l’aide de contrastes par paires (36). Si une surdispersion ou une sousdispersion significative est détectée, il est recommandé de recourir à des méthodes non paramétriques (23, 31), notamment les tests par les rangs tels que le test de tendance de Jonckheere-Terpstra (37) et les tests de Mann-Whitney (38) pour les comparaisons par paires avec le groupe témoin traité avec le véhicule/solvant, mais aussi les tests de permutation, de rééchantillonnage ou de bootstrap pour les comparaisons de tendances et les comparaisons par paires avec le groupe témoin (31) (39).
45. Un essai positif de mutation létale dominante met en lumière la génotoxicité du produit chimique d’essai sur les cellules germinales du mâle traité de l’espèce testée.
46. Le fait d’examiner si les valeurs observées se situent à l’intérieur de la plage des témoins historiques peut fournir des indications au moment de l’évaluation de la signification biologique de la réponse (40).
Rapport d’essai
47. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Résumé.
Produit chimique d’essai:
— source, numéro de lot, date limite d’utilisation si disponibles;
— stabilité du produit chimique d’essai, si elle est connue;
— solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant, si elles sont connues;
— mesure du pH, de l’osmolalité et de la précipitation dans le milieu de culture auquel le produit chimique d’essai a été ajouté, le cas échéant.
Substance mono-constituant:
— apparence physique, hydrosolubilité, autres propriétés physico-chimiques importantes pour la conduite de l’étude;
— identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés, s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.
Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:
— caractérisés autant que possible par l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence, la quantité et les propriétés physico-chimiques des constituants.
Préparation du produit chimique d’essai:
— justification du choix du véhicule;
— solubilité et stabilité du produit chimique dans le solvant/véhicule, si elles sont connues;
— préparation des formulations à administrer dans l’alimentation, l’eau de boisson ou par inhalation;
— déterminations analytiques sur les formulations (stabilité, homogénéité, concentrations nominales, par exemple), lorsqu’elles ont été réalisées.
Animaux d’essai:
— espèces/souches utilisées et justification du choix;
— nombre, âge et sexe des animaux;
— source, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.;
— méthode d’identification individuelle des animaux;
— pour les études de courte durée: poids corporel de chaque mâle au début et à la fin de l’essai; pour les études d’une durée supérieure à une semaine: poids individuel des animaux et consommation de nourriture. La plage des poids corporels, ainsi que la moyenne et l’écart type pour chaque groupe doivent également être mentionnés.
Conditions de l’essai:
— données relatives aux témoins positifs et négatifs (solvant/véhicule);
— données de l’étude préliminaire de détermination des concentrations;
— justification du choix des doses;
— détails sur la préparation du produit chimique d’essai;
— détails sur l’administration du produit chimique d’essai;
— justification du choix de la voie d’administration;
— méthodes de mesure de la toxicité animale, y compris, si elles existent, analyses histopathologiques ou hématologiques et fréquence des observations animales et des mesures du poids corporel;
— méthodes permettant de vérifier que le produit chimique d’essai a atteint le tissu cible ou la circulation sanguine en cas de résultats négatifs;
— dose réelle (mg/kg de poids corporel/jour) calculée en fonction de la concentration (ppm) du produit chimique d’essai dans la nourriture ou l’eau de boisson, et de la consommation, s’il y a lieu;
— détails sur la qualité de la nourriture et de l’eau;
— détails de l’enrichissement environnemental des cages;
— description détaillée des programmes de traitement et d’échantillonnage, et justification des choix;
— méthode d’analgésie;
— méthode d’euthanasie;
— procédures d’isolement et de conservation des tissus;
— source et numéros de lot de l’ensemble du matériel et de tous les réactifs (s’il y a lieu);
— méthodes d’énumération des mutations létales dominantes;
— programme d’accouplement;
— méthodes utilisées pour déterminer si l’accouplement a eu lieu;
— moment de l’euthanasie;
— critères permettant d’examiner les effets létaux dominants, y compris les corps jaunes, les embryons implantés, les résorptions et les pertes avant implantation, les embryons implantés vivants, les embryons implantés morts.
Résultats:
— état de santé des animaux avant et pendant la période d’essai, y compris signes de toxicité;
— poids corporel des mâles pendant le traitement et les périodes d’accouplement;
— nombre de femelles accouplées;
— relation dose-réponse, si possible;
— données relatives aux animaux témoins négatifs concomitants et données des témoins négatifs historiques avec plages, moyennes et écarts-types;
— données des témoins positifs concomitants;
— tableau de données pour chaque femelle gravide comprenant: le nombre de corps jaunes; le nombre d’embryons implantés; le nombre de résorptions et de pertes avant implantation; le nombre d’embryons implantés vivants; le nombre d’embryons implantés morts; le poids des fœtus;
— résumé des données ci-dessus pour chaque période d’accouplement et pour chaque dose, avec la fréquence des effets létaux dominants;
— analyses et méthodes statistiques employées.
Discussion des résultats.
Conclusion.
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(4) Dans la partie B, le chapitre B.23 est remplacé par le texte suivant:
«B.23 ESSAI D’ABERRATION CHROMOSOMIQUE SUR SPERMATOGONIES DE MAMMIFÈRES
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 483 (2016) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Les méthodes d’essai sont régulièrement mises à jour à la lumière des progrès scientifiques, de l’évolution des exigences réglementaires et de considérations relatives au bien-être des animaux. La présente version modifiée de la méthode d’essai reflète les connaissances scientifiques acquises après de nombreuses années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres études de toxicité ou de génotoxicité. Combiner différentes études de toxicité permet potentiellement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ces essais. La présente méthode d’essai s’inscrit dans une série de lignes directrices sur la toxicologie génétique. L’OCDE a élaboré un document qui fournit des éléments d’information concis sur les essais de toxicologie génétique et donne un aperçu des récents changements qui ont été apportés aux lignes directrices de toxicologie génétique de l’OCDE (1).
2. L’essai d’aberration chromosomique pratiqué in vivo sur des spermatogonies de mammifères est destiné à détecter les produits chimiques qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules de spermatogonies de mammifère (2) (3) (4). Par ailleurs, cet essai se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité, car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses. Cette méthode d’essai n’est pas conçue pour mesurer les aberrations numériques, et n’est pas utilisée de façon régulière dans ce but.
3. Cet essai mesure les aberrations chromosomiques structurales (de type chromosomique et chromatidique) qui surviennent dans les spermatogonies et devrait par conséquent permettre de prévoir l’induction de mutations héritées dans les cellules germinales.
4. Les définitions des termes clés figurent dans l’appendice.
REMARQUES PRÉLIMINAIRES
5. Les rongeurs sont couramment utilisés dans cet essai, mais dans certains cas, d’autres espèces peuvent convenir si cela est justifié sur le plan scientifique. Les préparations cytogénétiques standard des essais réalisés sur rongeurs permettent l’obtention de métaphases mitotiques (spermatogonies) et méiotiques (spermatocytes). Ces métaphases sont identifiées en fonction de la morphologie des chromosomes (4). Cet essai cytogénétique in vivo détecte les aberrations chromosomiques structurales dans les mitoses des spermatogonies. Les autres cellules cibles ne sont pas concernées par la présente méthode d’essai.
6. Afin de détecter les aberrations chromatidiques dans les cellules de spermatogonies, il faut examiner la première division cellulaire mitotique après le traitement, avant que ces aberrations n’évoluent en aberrations chromosomiques dans les divisions cellulaires ultérieures. Des informations complémentaires peuvent être obtenues après traitement des spermatocytes, à partir de l’analyse des chromosomes méiotiques mettant en évidence les aberrations chromosomiques structurales aux stades de la diacinèse et des métaphases I et II.
7. Les testicules contiennent plusieurs générations de spermatogonies (5). Ces différentes cellules germinales peuvent présenter des sensibilités diverses au traitement chimique. De ce fait, les aberrations détectées sont une réponse globale des populations de cellules de spermatogonies traitées. La majorité des cellules mitotiques présentes dans les préparations de testicules sont des spermatogonies de type B, dont le cycle cellulaire dure environ 26 heures (3).
8. Cet essai n’est pas pertinent s’il est prouvé que le produit chimique d’essai, ou son (ses) métabolite(s), n’atteindront pas le testicule.
PRINCIPE DE LA MÉTHODE D’ESSAI
9. En règle générale, les animaux sont exposés au produit chimique d’essai par une voie d’exposition idoine et sont euthanasiés à des délais appropriés après le traitement. Avant l’euthanasie, les animaux sont traités avec un inhibiteur du fuseau (par exemple la colchicine ou le Colcemid®). Ensuite, les préparations chromosomiques effectuées à partir des cellules germinales sont colorées et les cellules en métaphase sont analysées pour mettre en évidence les aberrations chromosomiques.
VÉRIFICATION DES COMPÉTENCES DU LABORATOIRE
10. La compétence à mener cet essai est établie sur la base d’informations démontrant l’aptitude à reproduire les résultats escomptés concernant la fréquence des aberrations chromosomiques structurales dans les spermatogonies avec des substances chimiques utilisées comme témoins positifs (réponses faibles comprises) telles que celles énumérées dans le tableau 1 et à obtenir une fréquence avec témoins négatifs qui soit cohérente avec la plage acceptable des données publiées dans la littérature [par exemple (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)] ou avec la distribution des données des témoins historiques du laboratoire, le cas échéant.
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Préparations
Choix des espèces animales
11. Il convient d’employer de jeunes animaux adultes sains issus de souches courantes de laboratoire. On utilise communément des souris mâles, mais des mâles d’autres espèces de mammifères appropriées peuvent cependant être employés si cela est justifié sur le plan scientifique, et si cela permet de combiner cette étude à une méthode d’essai. L’utilisation d’une espèce autre que les rongeurs doit être scientifiquement justifiée dans le rapport.
Conditions d’encagement et d’alimentation des animaux
12. Pour les rongeurs, la température de l’animalerie doit être maintenue à 22 °C (±3 °C). L’humidité relative, qui est idéalement de 50 à 60 %, doit atteindre au moins 40 % et de préférence ne pas dépasser 70 %, sauf durant le nettoyage du local. L’éclairage est artificiel, la séquence d’éclairage étant de 12 heures de clarté et 12 heures d’obscurité. Le régime alimentaire des animaux est le régime classique de laboratoire avec eau potable à volonté. Le choix des aliments peut être influencé par la nécessité d’assurer une bonne incorporation du produit chimique dans la nourriture si l’administration se fait par cette voie. Les rongeurs sont mis en cage par petits groupes d’individus (cinq au maximum par cage), si aucun comportement agressif n’est à craindre, de préférence dans des cages à fond plein dotées d’un enrichissement environnemental approprié. Les animaux peuvent être encagés individuellement si cela est justifié sur le plan scientifique.
Préparation des animaux
13. De jeunes adultes mâles en bonne santé (âgés de 8-12 semaines au début du traitement) sont normalement utilisés et sont répartis au hasard dans les groupes témoins et les groupes de traitement. Chaque animal est identifié individuellement selon une méthode sans cruauté, la moins invasive possible (par exemple, baguage, étiquetage, pose d’une puce électronique ou identification biométrique, en évitant l’entaillage des oreilles ou la phalangectomie) et gardés dans leurs cages pendant au moins cinq jours afin qu’ils s’acclimatent aux conditions du laboratoire. Les cages doivent être placées de manière à réduire au minimum l’influence éventuelle de leur disposition sur les résultats. Il convient d’éviter toute contamination croisée entre le témoin positif et le produit chimique d’essai. Au début de l’étude, la variation pondérale entre chaque animal doit être minimale et ne pas dépasser ±20 %.
Préparation des doses
14. Les produits chimiques solides sont dissouts, mis en suspension dans des solvants ou véhicules appropriés ou incorporés dans les aliments ou dans l’eau de boisson avant d’être administrés aux animaux. Les produits chimiques liquides peuvent être administrés directement ou dilués avant d’être administrés. En cas d’exposition par inhalation, les produits chimiques d’essai peuvent être administrés sous forme de gaz, de vapeur ou d’aérosol solide ou liquide, en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. On utilisera des préparations fraîches, sauf si l’on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage et définissent les conditions de stockage appropriées.
Conditions expérimentales - Solvant/véhicule
15. Le solvant/véhicule ne doit pas produire d’effets toxiques aux doses utilisées, ni pouvoir réagir avec les produits chimiques d’essai. Le recours à des solvants/véhicules inhabituels doit être justifié par des données de référence faisant état de leur compatibilité. Il est recommandé d’envisager en premier lieu l’utilisation d’un solvant/véhicule aqueux chaque fois que c’est possible. Parmi les exemples de solvants/véhicules compatibles couramment utilisés figurent notamment l’eau, le sérum physiologique, les solutions de méthylcellulose, les solutions de carboxyméthylcellulose sodique, l’huile d’olive et l’huile de maïs. En l’absence de données observées ou publiées montrant que le véhicule/solvant inhabituel sélectionné n’induit aucune aberration chromosomique structurale ou effet délétère, une étude initiale devra être réalisée afin d’établir l’acceptabilité du témoin de solvant/véhicule.
Témoins positifs
16. Des animaux témoins positifs sont toujours inclus simultanément dans l’essai, à moins que le laboratoire n’ait déjà démontré ses compétences dans la conduite de l’essai et n’ait mené le test en routine récemment (par exemple dans les cinq dernières années). Quand un témoin positif n’est pas testé en parallèle, des témoins d’analyse (lames fixées non colorées) doivent être compris dans chaque expérience. Ceux-ci peuvent être obtenus en incluant dans chaque étude des échantillons de référence en provenance de témoins positifs d’autres études conduites de façon périodique (par exemple tous les 6-18 mois) dans le laboratoire où le test est effectué, par exemple lors d’épreuves de compétence, et de façon plus régulière par la suitery.
17. Les substances utilisées comme témoins positifs doivent produire, de façon fiable, un accroissement détectable de la fréquence des cellules présentant des aberrations chromosomiques par rapport au niveau spontané. Les doses des témoins positifs doivent être choisies de telle sorte que les effets soient nets mais que l’identité des lames codées ne soit pas évidente pour l’examinateur. Des exemples de substances chimiques utilisées comme témoins positifs figurent au tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Exemples de substances chimiques utilisées comme témoins positifs
| Substances chimiques et no CAS (no de référence)
| Cyclophosphamide [no CAS 50-18-0] cyclophosphamide monohydratée [no CAS 6055-19-2] (9)
| Cyclohexylamine [no CAS 108-91-8] (7)
| Mitomycine C [no CAS 50-07-7] (6)
| Acrylamide monomère [no CAS 79-06-1] (10)
| Triéthylènemélamine [no CAS 51-18-3] (8)
Témoins négatifs
18. Les animaux servant de témoins négatifs, traités seulement avec le solvant ou avec le véhicule, et traités par ailleurs de manière identique aux groupes de traitement, sont inclus à chaque moment de prélèvement. En l’absence de données observées ou publiées montrant que le solvant/véhicule choisi n’induit pas d’aberrations chromosomiques ou d’autres effets délétères, des animaux témoins non traités sont également inclus à chaque moment de prélèvement afin d’établir l’acceptabilité du témoin contenant le véhicule.
PROCÉDURE
Nombre d’animaux
19. La taille des groupes au début de l’étude doit permettre de disposer d’au moins cinq animaux mâles dans chaque groupe. Ce nombre d’animaux par groupe est considéré comme suffisant pour fournir une efficacité statistique idoine (c’est-à-dire généralement capable de détecter au moins un doublement de la fréquence des aberrations chromosomiques lorsque le niveau du témoin négatif est de 1,0 % ou plus assorti d’une probabilité de 80 % à un niveau de signification de 0,05) (3) (11). À titre d’information, concernant les exigences relatives au nombre maximum d’animaux généralement utilisés, une étude comptant deux moments de prélèvement et impliquant trois groupes de traitement, un groupe de témoins négatifs concomitants et un groupe de témoins positifs (chaque groupe étant composé de cinq animaux) nécessitera 45 animaux.
Déroulement du traitement
20. Les produits chimiques d’essai sont habituellement administrés une seule fois (c’est-à-dire en un seul traitement). D’autres régimes de dosage sont acceptables pour autant qu’ils soient scientifiquement justifiés.
21. Dans le groupe qui reçoit la dose la plus forte, les prélèvements sont effectués à deux intervalles après le traitement. Étant donné que le temps requis par l’absorption et la métabolisation du ou des produits chimiques d’essai, ainsi que leur effet sur la cinétique du cycle cellulaire peuvent influer sur le moment optimal pour la détection des aberrations chromosomiques, deux prélèvements sont donc effectués, le premier, précoce aux environs de 24 heures et le deuxième, tardif, autour de 48 heures après le traitement. S’agissant des niveaux de dose inférieurs à la dose la plus élevée, il convient de choisir un intervalle de prélèvement précoce de 24 heures (soit une durée inférieure ou égale à la durée du cycle cellulaire d’une spermatogonie B, ce qui optimise ainsi la probabilité de pouvoir analyser les premières métaphases post-traitement), à moins que l’on sache qu’il existe un autre délai de prélèvement justifié et plus propice à la détection des effets.
22. D’autres moments de prélèvement peuvent être retenus. Par exemple, dans le cas des produits chimiques susceptibles de provoquer des effets indépendants de la phase S, il peut être judicieux d’effectuer des prélèvements plus précoces (soit à un intervalle de moins de 24 heures).
23. Un régime de traitement à doses répétées peut être employé notamment dans les cas où cet essai est associé à un test sur un autre effet mesuré dont la période d’administration est de 28 jours (par exemple, la méthode d’essai B.58). Le cas échéant, cependant, des groupes d’animaux supplémentaires seront requis afin de tenir compte des différents délais de prélèvement. Par conséquent, le caractère approprié d’un tel programme doit être justifié sur le plan scientifique au cas par cas.
24. Avant l’euthanasie, les animaux reçoivent une dose appropriée d’un inhibiteur du fuseau (par exemple le Colcemid® ou la colchicine) par injection intrapéritonéale. Les échantillons sont prélevés après des délais appropriés. Pour les souris et les rats, ce délai est compris approximativement entre 3 et 5 heures.
Niveaux de dose
25. Si l’on procède à une étude préliminaire de détermination des doses à administrer parce qu’on ne dispose pas de données fiables pour orienter le choix des doses, cette étude préliminaire doit être effectuée dans le même laboratoire, en utilisant une espèce, une souche, un sexe et un régime de traitement identiques à ceux de l’étude principale, conformément aux recommandations relatives aux études de détermination des doses (12). L’étude devra avoir pour objectif de déterminer la dose maximale tolérée (DMT), définie comme la dose entraînant de légers effets toxiques dans le cadre de la durée de l’étude (par exemple, en induisant un comportement ou des réactions anormales, une baisse mineure du poids corporel ou une cytotoxicité du système hématopoïétique) mais ne provoquant pas la mort ou des signes de douleur, de souffrance ou de détresse imposant une euthanasie de l’animal (13).
26. La dose la plus élevée peut aussi être définie comme étant celle qui produit certains indices de toxicité dans les cellules de spermatogonies (par exemple une diminution du rapport entre le nombre de mitoses des spermatogonies et le nombre des métaphases I et II de la méiose. Cette diminution ne doit cependant pas dépasser 50 %.
27. Les produits chimiques d’essai ayant une activité biologique spécifique à des niveaux de doses faibles et non toxiques (telles que les hormones et les mitogènes) et les produits chimiques qui présentent une saturation des propriétés toxicocinétiques peuvent être considérés comme des exceptions aux critères de détermination des doses et sont évalués au cas par cas.
28. Pour permettre d’obtenir des informations sur la relation dose-réponse, une étude complète doit comporter un groupe témoin négatif (paragraphe 18) et au moins trois niveaux de doses, espacés en général d’un facteur de 2, mais pas de plus de 4. Si le produit chimique d’essai ne provoque aucune toxicité dans le cadre d’une étude de détermination des doses, ou d’après les données disponibles, la dose la plus élevée pour une administration unique doit être de 2 000 mg/kg de poids corporel. Néanmoins, si le produit chimique d’essai provoque une toxicité, la dose administrée la plus élevée devra correspondre à la DMT et les niveaux de dose employés devront de préférence s’étendre de la dose maximale à une dose induisant peu ou pas de toxicité. Lorsqu’une toxicité sur le tissu cible (testicule) est observée à tous les niveaux de doses administrés, il est conseillé de procéder à des études complémentaires à des doses non toxiques. Les études visant à caractériser davantage les informations sur la relation quantitative dose-réponse peuvent nécessiter un ou plusieurs groupes de traitement supplémentaires. Enfin, ces limites peuvent varier pour certains types de produits chimiques d’essai (par exemple les produits pharmaceutiques à usage humain) faisant l’objet d’exigences spécifiques. Si le produit chimique d’essai provoque une toxicité, il conviendra de choisir la dose limite ainsi que deux niveaux de doses inférieurs à cette dernière (tel que décrit ci-dessus). Pour une période d’administration égale ou supérieure à 14 jours, la dose limite est de 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, et pour des périodes d’administration de moins de 14 jours, la dose limite est de 2 000 mg/kg de poids corporel/jour.
Administration des doses
29. Lors de la conception d’un essai, il convient de tenir compte de la voie d’exposition humaine anticipée. Par conséquent, les voies d’administration telles que l’alimentation, l’eau de boisson, l’inhalation, l’implantation ainsi que les voies topique, sous-cutanée, intraveineuse et orale (par gavage) sont autant de choix qui peuvent être considérés comme justifiés. Dans tous les cas, la voie retenue doit permettre une exposition adéquate du tissu cible. L’injection intrapéritonéale n’est normalement pas recommandée sauf si elle est scientifiquement justifiée car la cavité péritonéale n’est généralement pas une voie d’exposition humaine physiologiquement pertinente. Si le produit chimique d’essai est mélangé à l’alimentation ou à l’eau de boisson, surtout dans le cas d’un dosage unique, il convient de s’assurer que le délai entre l’absorption de nourriture et d’eau et le prélèvement est suffisant pour permettre une détection des effets (voir paragraphe 33). Le volume maximal de liquide administrable en une fois par gavage ou par injection dépend de la taille de l’animal. Le volume ne doit normalement pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel, sauf dans le cas des solutions aqueuses où un maximum de 2 ml/100 g est acceptable. L’administration de volumes plus importants (si la législation relative au bien-être animal le permet) doit être justifiée. Il convient de minimiser la variabilité du volume testé en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant par rapport au poids corporel à tous les niveaux de doses.
Observations
30. Les animaux d’essai font l’objet d’un examen clinique général. Les signes cliniques doivent être consignés au moins une fois par jour, de préférence aux mêmes heures, en prenant en considération la période où les effets anticipés devraient être les plus marqués après l’administration. Au moins deux fois par jour, l’ensemble des animaux fait l’objet d’un constat de morbidité et de mortalité. Tous les animaux doivent être pesés au début de l’étude, au moins une fois par semaine au cours des études à doses répétées, puis lors de l’euthanasie. Pour les études dont la durée est égale ou supérieure à une semaine, la consommation de nourriture doit également être mesurée au moins une fois par semaine. Si le produit chimique d’essai est administré dans l’eau de boisson, la consommation d’eau est mesurée à chaque changement d’eau et au moins une fois par semaine. Les animaux montrant des signes non létaux de toxicité excessive sont euthanasiés avant la fin de l’essai (13).
Préparation des chromosomes
31. Des cellules germinales en suspension obtenues à partir de l’une ou des deux testicules immédiatement après l’euthanasie sont exposées à une solution hypotonique et fixées selon les protocoles établis (2) (14) (15) par exemple). Les cellules sont alors étalées sur des lames et colorées (16) (17). Toutes les lames doivent être codées afin que leur identité ne soit pas révélée à l’examinateur.
Analyse
32. Il y a lieu d’examiner au moins 200 cellules en métaphase bien étalées pour chaque animal (3) (11). Si la fréquence des témoins négatifs historiques est < 1 %, il convient alors d’examiner plus de 200 cellules/animal afin d’augmenter l’efficacité statistique (3). Le recours à des méthodes de coloration permettant l’identification du centromère est conseillé.
33. Il convient de consigner séparément les aberrations chromatidiques et chromosomiques et de les classer par sous-catégories (cassures, échanges). Les lacunes sont enregistrées mais non prises en compte pour déterminer si un produit chimique induit une hausse notable de l’incidence des cellules porteuses d’aberrations chromosomiques. Les procédures en cours dans le laboratoire doivent assurer que l’analyse des aberrations chromosomiques est réalisée par des examinateurs qualifiés. Étant donné que les procédures de préparation des lames provoquent souvent la rupture d’une certaine fraction des cellules en métaphase, entraînant une perte de chromosomes, toutes les cellules examinées doivent contenir un nombre de centromères égal ou supérieur à 2n±2, n étant le nombre haploïde de chromosomes pour cette espèce.
34. Bien que l’essai soit destiné à détecter les aberrations chromosomiques structurales, il est important de rapporter la fréquence des cellules polyploïdes et de celles présentant des chromosomes endoredupliqués le cas échéant (voir paragraphe 44).
RÉSULTATS ET RAPPORT
Traitement des résultats
35. Les résultats individuels pour chaque animal sont présentés sous forme de tableaux. Le nombre de cellules présentant une (des) aberration(s) chromosomique(s) structurale(s) et le nombre d’aberrations chromosomique(s) par cellule doivent être évalués pour chaque animal. Les aberrations chromatidiques et chromosomiques classées par sous-catégorie (cassure, échange) doivent être consignées séparément, avec leur nombre et leur fréquence pour les groupes traités et les groupes témoins. Les lacunes sont enregistrées séparément. La fréquence des lacunes est rapportée mais n’est généralement pas incluse dans l’analyse de la fréquence totale des aberrations chromosomiques structurales. Le pourcentage de cellules polyploïdes et de cellules présentant des chromosomes endoredupliqués est rapporté le cas échéant.
36. Les données de toxicité et les signes cliniques tels que décrits dans le paragraphe 30 sont consignés dans le rapport.
Critères d’acceptabilité
37. Les critères suivants déterminent l’acceptabilité de l’essai:
— Les témoins négatifs utilisés simultanément induisent des réponses cohérentes avec les normes publiées pour les données relatives aux témoins négatifs historiques, qui se situent généralement entre > 0 % et ≤ 1,5 % cellules comportant des aberrations chromosomiques, ainsi qu’avec les données des témoins historiques du laboratoire, le cas échéant (voir paragraphes 10 et 18).
— Les témoins positifs utilisés simultanément induisent des réponses cohérentes avec les normes publiées pour les données relatives aux témoins positifs historiques ou avec la base de données des témoins positifs historiques du laboratoire, le cas échéant et produisent une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant (voir paragraphes 17, 18).
— Le nombre idoine de cellules et de doses est analysé (voir paragraphes 28 et 32).
— Les critères de sélection de la dose maximale sont cohérents avec ceux décrits aux paragraphes 25 et 26.
38. Lorsqu’on observe des mitoses ainsi que des méioses, il faut déterminer le rapport entre le nombre de mitoses des spermatogonies et le nombre de premières et secondes métaphases méiotiques pour tous les animaux traités et témoins négatifs, dans un échantillon total de 100 cellules en division par animal. Dans le cas où il s’agit uniquement de mitose, l’indice mitotique doit être déterminé dans au moins 1 000 cellules de chaque animal.
Évaluation et interprétation des résultats
39. Au moins trois groupes de traitement sont analysés pour obtenir des données suffisantes pour l’analyse de la relation dose-réponse.
40. À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement positif si:
— au moins une des doses d’essai présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;
— l’augmentation est liée à la dose pour au moins l’un des moments de prélèvement; et
— des résultats se situent à l’extérieur de la plage acceptable de données relatives aux témoins négatifs, ou des données relatives aux témoins négatifs historiques du laboratoire le cas échéant (par exemple, limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson.
Lorsque tous ces critères sont remplis, le produit chimique d’essai est considéré comme capable d’induire des aberrations chromosomiques dans les cellules de spermatogonies des animaux testés. Des recommandations concernant les méthodes statistiques les plus appropriées sont également disponibles dans la littérature (11) (18). Les méthodes statistiques employées considèrent l’animal comme unité expérimentale.
41. À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement négatif si:
— aucune dose d’essai ne présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;
— aucune condition expérimentale n’a révélé une augmentation liée à la dose; et,
— l’intégralité des résultats se situe à l’intérieur de la plage acceptable de données relatives aux témoins négatifs ou des données du laboratoire relatives aux témoins négatifs historiques, le cas échéant (par exemple, limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson.
Le produit chimique d’essai est alors considéré comme incapable d’induire des aberrations chromosomiques dans les cellules de spermatogonies de l’animal testé. Des recommandations concernant les méthodes statistiques les plus appropriées sont également disponibles dans la littérature (11) (18). Un résultat négatif n’exclut pas la possibilité que le produit chimique puisse induire des aberrations chromosomiques à des stades de développement ultérieurs non étudiés, ou des mutations génétiques.
42. Il n’est pas nécessaire de vérifier une réponse clairement positive ou clairement négative.
43. Si la réponse n’est ni clairement négative ni clairement positive, et afin d’établir la signification biologique d’un résultat (par exemple, une augmentation faible ou marginale), les données doivent être soumises à un jugement d’experts et/ou faire l’objet de recherches supplémentaires à l’aide des données expérimentales existantes, en vérifiant par exemple si le résultat positif se situe en dehors de la plage acceptable des données relatives aux témoins négatifs ou des données des témoins négatifs historiques du laboratoire (19).
44. Dans de rares cas, même après de nouvelles investigations, l’ensemble de données ne permettra pas de conclure que les résultats sont positifs ou négatifs; les résultats seront alors déclarés équivoques.
45. Une augmentation du nombre de cellules polyploïdes peut signifier que le produit chimique d’essai est capable d’inhiber les processus mitotiques et d’induire des aberrations chromosomiques numériques (20). Une augmentation du nombre de cellules présentant des chromosomes endoredupliqués peut indiquer que le produit chimique d’essai est capable d’inhiber la progression du cycle cellulaire (21) (22), un mécanisme qui, bien que différent de l’inhibition des processus mitotiques, induit lui aussi des modifications du nombre de chromosomes (voir paragraphe 2). La fréquence des cellules polyploïdes et des cellules présentant des chromosomes endoredupliqués doit donc être consignée séparément.
Rapport d’essai
46. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Résumé.
Produit chimique d’essai:
— source, numéro de lot, date limite d’utilisation, si elle est disponible;
— stabilité du produit chimique d’essai, si elle est connue;
— solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant, si elles sont connues;
— mesure du pH, de l’osmolalité et de la précipitation dans le milieu de culture auquel le produit chimique d’essai a été ajouté, le cas échéant.
Substance mono-constituant:
— apparence physique, hydrosolubilité, autres propriétés physico-chimiques importantes pour la conduite de l’étude;
— identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés, s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.
Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:
— caractérisés autant que possible par l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence, la quantité et les propriétés physico-chimiques des constituants.
Préparation du produit chimique d’essai:
— justification du choix du véhicule;
— solubilité et stabilité du produit chimique dans le solvant/véhicule.
— préparation des formulations à administrer dans l’alimentation, l’eau de boisson ou par inhalation;
— déterminations analytiques sur les formulations (stabilité, homogénéité, concentrations nominales, par exemple) le cas échéant;
Animaux d’essai:
— espèces/souches utilisées et justification;
— nombre et âge des animaux;
— source, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.;
— méthode d’identification individuelle des animaux;
— pour les études de courte durée: poids individuel des animaux au début et à la fin de l’essai; pour les études d’une durée supérieure à une semaine: poids individuel des animaux et consommation de nourriture. La plage des poids corporels, ainsi que la moyenne et l’écart type pour chaque groupe doivent également être mentionnés.
Conditions de l’essai:
— données relatives aux témoins positifs et négatifs (solvant/véhicule);
— données issues de l’étude de détermination des doses, si elle a été réalisée;
— justification du choix des doses;
— justification du choix de la voie d’administration;
— détails sur la préparation du produit chimique d’essai;
— détails sur l’administration du produit chimique d’essai;
— justification du choix des délais de sacrifices;
— méthodes de mesure de la toxicité animale, y compris, si elles existent, analyses histopathologiques ou hématologiques et fréquence des observations animales et des mesures du poids corporel;
— méthodes permettant de vérifier que le produit chimique d’essai a atteint le tissu cible ou la circulation sanguine en cas de résultats négatifs;
— dose réelle (mg/kg de poids corporel/jour) calculée en fonction de la concentration (ppm) du produit chimique d’essai dans la nourriture ou l’eau de boisson, et de la consommation, s’il y a lieu;
— détails sur la qualité de la nourriture et de l’eau;
— description détaillée des programmes de traitement et de prélèvement et justification des choix;
— méthode d’euthanasie;
— méthode d’analgésie (le cas échéant);
— procédures d’isolement des tissus;
— nature et concentration de l’inhibiteur du fuseau, durée du traitement;
— méthodes de préparation des lames;
— critères d’analyse des aberrations;
— nombre de cellules analysées par animal;
— critères pour conclure que l’étude est positive, négative ou équivoque.
Résultats:
— état de santé des animaux avant et pendant la période d’essai, y compris signes de toxicité;
— poids corporels et poids des organes, après euthanasie (si plusieurs traitements sont utilisés, poids corporels pendant le régime de traitement);
— signes de toxicité;
— indice mitotique;
— rapport des cellules de spermatogonies en mitose à celles se trouvant en premières et secondes métaphases méiotiques, ou autre preuve d’exposition du tissu cible;
— type et nombre d’aberrations, donnés séparément pour chaque animal;
— nombre total d’aberrations par groupe, moyenne et écart-type;
— nombre de cellules présentant des aberrations par groupe, moyenne et écart-type;
— relation dose-réponse, si possible;
— analyses et méthodes statistiques employées;
— données des témoins négatifs concomitants;
— données des témoins négatifs historiques, y compris les plages, les moyennes, les écarts types, et limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson (le cas échéant), ou données publiées relatives aux témoins historiques utilisées pour déterminer l’acceptabilité des résultats de l’essai;
— données des témoins positifs concomitants;
— modifications de la ploïdie, le cas échéant, y compris les fréquences de polyploïdie et/ou de cellules endoredupliquées.
Discussion des résultats
Conclusions
BIBLIOGRAPHIE
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(21) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.
(22) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.
»
(5) Dans la partie B, le chapitre B.40 est remplacé par le texte suivant:
«B.40 CORROSION CUTANEE IN VITRO: ESSAI DE RESISTANCE ELECTRIQUE TRANSCUTANEE (RET)
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 430 (2015) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions irréversibles de la peau, qui se manifestent par une nécrose visible, à travers l’épiderme et jusque dans le derme, suite à l’application d’un produit chimique d’essai [selon la définition du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies (ONU) (1) et du règlement (CE) no 1272/2008 de l’Union européenne relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges (ci-après le «règlement CLP»]. La présente version mise à jour de la méthode d’essai B.40 propose une procédure in vitro permettant d’identifier les substances et mélanges corrosifs et non corrosifs selon la définition du SGH de l’ONU (1) et du règlement CLP.
2. Traditionnellement, l’évaluation de la corrosivité cutanée a impliqué le recours à des animaux de laboratoire (méthode d’essai B.4, équivalente à la ligne directrice 404 de l’OCDE, initialement adoptée en 1981 et révisée en 1992, 2002 et 2015) (2). Outre la présente méthode d’essai B.40, d’autres méthodes d’essai in vitro pour tester le potentiel de corrosion de la peau des produits chimiques ont été validées et adoptées, à savoir la méthode d’essai B.40 bis, équivalente à la ligne directrice 431 de l’OCDE (3) et la méthode d’essai B.65 (équivalente à la ligne directrice 435 de l’OCDE) (4), et sont capables d’identifier les sous-catégories de produits chimiques corrosifs quand cela est requis. Plusieurs méthodes d’essai in vitro validées ont été adoptées, notamment la ligne directrice B.46 (équivalente à la ligne directrice 439 de l’OCDE) (5), aux fins de tester l’irritation de la peau. Un document guide de l’OCDE sur les approches intégrées en matière d’essai et d’évaluation IATA en anglais pour l’irritation et la corrosion de la peau propose une approche modulaire pour les tests d’irritation et de corrosion de la peau. L’approche intégrée décrit plusieurs modules qui regroupent les sources d’information et les outils d’analyse, et fournit des guides sur la façon i)d’intégrer et d’utiliser les informations existantes sur les données d’essai et autres données pour l’évaluation du potentiel irritant et corrosif pour la peau des produits chimiques d’essai, et ii) propose une approche dans les cas où des tests supplémentaires sont recommandés (6).
3. La présente méthode d’essai porte sur le danger de corrosion cutanée pour la santé humaine. Elle s’appuie sur la méthode d’essai de résistance électrique transcutanée (RET) pratiquée sur un épiderme de rat, laquelle utilise des disques cutanés pour identifier les produits chimiques corrosifs sur la base de leur capacité à provoquer la perte de l’intégrité du stratum corneum normal et de la fonction de barrière. La présente méthode d’essai a été initialement adoptée en 2004 et mise à jour en 2015 pour faire référence au document guide IATA.
4. En vue d’évaluer les essais de corrosion cutanée in vitro à des fins réglementaires, des études de pré-validation (7) ont été réalisées, suivies d’une étude formelle de validation de la méthode d’essai de RET sur peau de rat axée sur la corrosion cutanée (8) (9) (10) (11). Sur la base des résultats de ces études, il est désormais recommandé que la méthode d’essai de RET (désignée comme la méthode de référence validée – MRV –) puisse servir, à des fins réglementaires, à évaluer la corrosivité cutanée in vivo (12) (13) (14).
5. Avant de pouvoir utiliser à des fins réglementaires une méthode d’essai in vitro de RET (corrosivité cutanée) similaire ou modifiée autre que la MRV, il convient d’en déterminer la fiabilité, la pertinence (précision) et les limitations pour l’usage préconisé, afin de s’assurer de sa similitude avec la MRV, conformément aux normes de performance (15). L’acceptation mutuelle des données ne sera garantie qu’après examen et intégration de toute méthode d’essai nouvelle ou actualisée proposée dans la ligne directrice d’essai correspondante de l’OCDE.
DÉFINITIONS
6. Les définitions utilisées figurent à l’appendice 1.
CONSIDÉRATIONS INITIALES
7. Selon une étude de validation (10) et d’autres études publiées (16) (17), la méthode d’essai de RET sur peau de rat permet de faire la distinction entre produits corrosifs et produits non corrosifs pour la peau avec une sensibilité globale de 94 % (51/54) et une spécificité de 71 % (48/68) pour une base de données de 122 substances.
8. La présente méthode d’essai se rapporte au volet «corrosion cutanée in vitro». Elle permet d’identifier les produits chimiques d’essai corrosifs et non corrosifs selon la définition du SGH de l’ONU/du règlement CLP. Une limite de cette méthode d’essai, comme l’ont montré les études de validation (8) (9) (10) (11), est qu’elle ne permet pas de classer en sous-catégories les substances et mélanges corrosifs conformément au SGH de l’ONU/règlement CLP. Son utilisation sera fonction de la réglementation en vigueur. Si la présente méthode d’essai ne fournit pas d’informations appropriées sur l’irritation cutanée, on notera en revanche que la méthode d’essai B.46 porte spécifiquement sur les essais d’irritation cutanée in vitro (5). Pour une évaluation complète des effets cutanés locaux après une exposition unique, le document guide IATA (6) devra être consulté.
9. Les essais réalisés dans le cadre de l’étude de validation sous-tendant cette méthode d’essai ont porté sur un large éventail de produits chimiques représentant principalement des substances; la base de données empiriques de cette étude totalisait 60 substances couvrant une grande variété de classes chimiques (8) (9). D’après l’ensemble des données disponibles, cette méthode d’essai peut être utilisée pour tester un large éventail de classes chimiques et d’états physiques, notamment des liquides, des semi-solides, des solides et des cires. Cependant, étant donné que pour certains états physiques, les éléments d’essai pour lesquels il existe des données de référence appropriées ne sont pas facilement disponibles, on notera qu’un nombre relativement restreint de cires et de matières solides corrosives ont été évaluées durant la validation. Les liquides peuvent être aqueux ou non; les solides peuvent être solubles ou insolubles dans l’eau. Dans les cas où l’on peut apporter la preuve que les méthodes d’essai figurant dans cette méthode d’essai ne peuvent s’appliquer à une catégorie donnée de substances, il convient de ne pas utiliser cette méthode d’essai pour tester la catégorie de substances en question. De plus, outre les substances, cette méthode d’essai est présumée pouvoir s’appliquer aux mélanges. Or, les mélanges couvrant un large éventail de catégories et de compositions, et compte tenu des informations limitées disponibles actuellement à propos des essais de mélanges, dans les cas où l’on peut apporter la preuve que cette méthode d’essai ne peut s’appliquer à une catégorie donnée de mélanges (par exemple selon la stratégie proposée par Eskes et al., 2012) (18), la méthode d’essai ne doit pas être utilisée pour tester la catégorie de mélanges en question. Avant d’utiliser la présente méthode d’essai pour tester un mélange afin de générer des données dans un but réglementaire, il convient de s’assurer et de justifier le cas échéant, que les données générées seront adéquates. De telles dispositions ne sont pas nécessaires quand il existe une exigence réglementaire de tester le mélange. Les gaz et les aérosols n’ont pas encore fait l’objet d’études de validation (8) (9). Bien qu’il soit envisageable de pouvoir tester des gaz et des aérosols en faisant appel à la méthode d’essai de RET, l’actuelle méthode d’essai ne permet pas de tester les produits de ce type.
PRINCIPE DE L’ESSAI
10. Le produit chimique d’essai est appliqué pour une durée n’excédant pas 24 heures sur la surface épidermique de disques de peau, placés dans un système d’essai à deux compartiments pour lequel les disques de peau font office de séparation entre les compartiments. Ces disques cutanés sont prélevés sur la peau de jeunes rats âgés de 28 à 30 jours et euthanasiés. Les produits chimiques corrosifs sont identifiés sur la base de leur capacité à provoquer la perte de l’intégrité du stratum corneum normal et de la fonction de barrière, cette perte étant mesurée comme une diminution de la RET en deçà d’une valeur seuil (16) (paragraphe 32). Dans le cas de l’épiderme de rat, une valeur de seuil de la RET de 5 kΩ a été retenue, sur la base de nombreuses données relatives à un large éventail de substances, desquelles il ressortait que l’immense majorité des valeurs étaient soit très supérieures (souvent > 10 kΩ), soit très inférieures (souvent < 3 kΩ) à cette valeur de seuil (16). De manière générale, les produits chimiques non corrosifs sur les animaux, mais irritants ou non irritants, ne font pas baisser la RET en dessous de ce seuil. Par ailleurs, l’utilisation d’autres préparations de peau ou d’autres équipements est susceptible de modifier la valeur de seuil, ce qui impose de procéder à une validation supplémentaire.
11. Une étape de fixation d’un colorant est incorporée dans la procédure d’essai pour confirmer les résultats positifs de la RET présentant des valeurs autour de 5 kΩ. Cette étape de fixation d’un colorant détermine en effet si l’accroissement de la perméabilité ionique est imputable à la destruction physique du stratum corneum. Dans la pratique, la méthode de l’essai de RET sur peau de rat prédit très bien la corrosivité in vivo sur le lapin évalué dans la méthode d’essai B.4 de l’OCDE (2).
DÉMONSTRATION DES COMPÉTENCES
12. Avant d’appliquer en routine la méthode de RET sur peau de rat à la présente méthode d’essai, les laboratoires font la preuve de leur compétence technique en classifiant correctement les douze sunstances recommandés dans le tableau 1. Dans le cas où une substance ne serait pas disponible ou dans les cas où cela se justifie, une autre substance pour laquelle il existe des données de référence in vivo et in vitro peut être utilisée (par exemple en choisissant dans la liste des produits chimiques de référence (16)), pourvu que les mêmes critères de sélection tels que décrits dans le tableau 1 soient appliqués.
Tableau 1
Liste des substances d’épreuve de compétence
Abréviations: aq = aqueux; CAS = numéro d’enregistrement au Chemical Abstracts Service; MRV = méthode de référence validée; C = corrosive; NC = non corrosive.
| Substance | Numéro CAS | Classe chimique | Cat. SGH de l’ONU/du CLP d’après les résultats in vivo | Cat. MRV d’après les résultats in vitro | État physique | pH
| Substances corrosives in vivo
| N,N’-diméthyl dipropylènetriamine | 10563-29-8 | base organique | 1A | 6 × C | L | 8,3
| Diamino-1,2 propane | 78-90-0 | base organique | 1A | 6 × C | L | 8,3
| Acide sulfurique (10 %) | 7664-93-9 | acide inorganique | (1A/)1B/1C | 5 × C 1 × NC | L | 1,2
| Hydroxyde de potassium (solution aqueuse à 10 %) | 1310-58-3 | acide inorganique | (1A/)1B/1C | 6 × C | L | 13,2
| Acide octanoïque (caprylique) | 124-07-2 | acide organique | 1B/1C | 4 × C 2 × NC | L | 3,6
| 2-tert-butylphénol | 88-18-6 | phénol | 1B/1C | 4 × C 2 × NC | L | 3,9
| Substances non corrosives in vivo
| Acide isostéarique | 2724-58-5 | acide organique | NC | 6 × NC | L | 3,6
| 4-amino-1,2,4-triazole | 584-13-4 | base organique | NC | 6 × NC | S | 5,5
| Bromure de phénétyle | 103-63-9 | électrophile | NC | 6 × NC | L | 3,6
| 4-(méthylthio)-benzaldéhyde | 3446-89-7 | électrophile | NC | 6 × NC | L | 6,8
| 1,9-décadiène | 1647-16-1 | organique neutre | NC | 6 × NC | L | 3,9
| tétrachloréthylène | 127-18-4 | organique neutre | NC | 6 × NC | L | 4,5
PROCÉDURE
13. Il existe des modes opératoires normalisés pour la méthode d’essai de RET sur peau de rat (corrosion cutanée) (19). Les méthodes d’essai de RET sur épiderme de rat couvertes par cette méthode d’essai doivent se conformer aux critères suivants:
Animaux
14. Il convient d’utiliser des rats parce que la sensibilité de leur épiderme aux substances de cette méthode d’essai a été prouvée (12) et qu’il s’agit de la seule source de peau ayant été validée formellement (8) (9). L’âge (au moment du prélèvement de la peau) et la souche utilisée sont des critères déterminants, puisqu’il est essentiel que les follicules pileux soient en phase dormante avant le début de la pousse de la fourrure adulte.
15. Les poils du dos et des flancs des jeunes rats (Wistar ou souche comparable) mâles ou femelles, âgés approximativement de 22 jours, sont soigneusement coupés à l’aide d’une petite tondeuse. Les animaux sont ensuite nettoyés soigneusement avec un linge humide, la zone tondue étant plongée dans une solution antibiotique (contenant, par exemple, de la streptomycine, de la pénicilline, du chloramphénicol et de l’amphotéricine à des concentrations efficaces pour inhiber la croissance bactérienne). Les animaux sont lavés une nouvelle fois avec des antibiotiques le troisième ou le quatrième jour après le premier lavage, et doivent ensuite être utilisés dans un délai de 3 jours, lorsque le stratum corneum a récupéré de la tonte.
Préparation des disques cutanés
16. Les animaux, âgés de 28 à 30 jours (cet âge est particulièrement important) sont euthanasiés. On prélève la peau dorso-latérale de chaque animal et on la débarrasse soigneusement du tissu adipeux en excès. Des disques cutanés, d’un diamètre approximatif de 20 mm chacun sont prélevés. La peau peut être stockée avant d’utiliser les disques lorsqu’il est établi que les données de contrôle positif et négatif sont équivalentes à celles obtenues avec de la peau fraîche.
17. Chaque disque cutané est placé sur l’extrémité d’un tube PTFE (polytétrafluoroéthylène) en veillant à ce que la surface épidermique soit en contact avec le tube. Après avoir ajusté de force un joint torique en caoutchouc sur l’extrémité du tube pour maintenir la peau en place, on coupe le tissu excédentaire. Le joint torique en caoutchouc est ensuite soigneusement fixé de manière étanche à l’extrémité du tube PTFE à l’aide de vaseline. Le tube est introduit dans une chambre réceptrice contenant une solution de sulfate de magnésium (154 mM) dans lequel il est maintenu par une pince à ressort (figure 1). Le disque cutané doit être complètement immergé dans la solution de sulfate de magnésium (MgSO4). Entre 10 et 15 disques cutanés peuvent être prélevés de la peau d’un rat. Les dimensions du tube et du joint torique sont indiquées à la figure 2.
18. Avant le début de l’essai proprement dit, on mesure, pour chaque peau de rat, la RET de deux disques cutanés, à titre de contrôle de la qualité. Pour que les autres disques d’une même peau soient valables pour la méthode d’essai, il faut que les deux disques donnent des valeurs de résistance électrique supérieures à 10 kΩ. Si la résistance est inférieure à 10 kΩ, les disques restants provenant de la même peau doivent être éliminés.
Application du produit chimique d’essai et substances de contrôle
19. Pour chaque essai, des substances de contrôle positif et négatif doivent être utilisées parallèlement au produit chimique d’essai, de façon à garantir la qualité des résultats du modèle expérimental. Chaque essai doit être réalisé en utilisant les disques de peau provenant d’un seul et même animal. Les substances de contrôle positif et négatif recommandées sont respectivement l’acide chlorhydrique 10 M et l’eau distillée.
20. Les produits chimiques liquides testés (150 μl) sont appliqués sur la surface épidermique à l’intérieur du tube. Pour l’essai de produits chimiques solides, une quantité suffisante du solide est appliquée uniformément sur le disque de peau, de façon à ce que la totalité de la surface de l’épiderme soit couverte. Après avoir ajouté de l’eau désionisée (150 μl) sur les solides, on agite le tube doucement. Afin d’optimiser le contact avec la peau, certains solides doivent être chauffés à 30 °C pour dissoudre le produit chimique d’essai ou être broyés pour obtenir des grains ou une poudre.
21. On utilise trois disques cutanés pour chaque produit chimique d’essai à chaque expérience. Ces produits chimiques d’essai sont appliqués pendant 24 heures à une température de 20 à 23 °C, puis éliminés par lavage sous l’eau du robinet à température ambiante.
Mesures de la RET
22. L’impédance de la peau, c’est-à-dire la RET, est mesurée à l’aide d’un pont de mesure de Wheatstone en courant alternatif basse tension (18), présentant les caractéristiques suivantes: tension de 1 à 3 Volts, courant alternatif de forme sinusoïdale ou rectangulaire compris entre 50 et 1 000 Hz, et une plage de mesure minimale entre 0,1 et 30 kΩ. Le pont de mesure utilisé dans l’étude de validation permettait de mesurer l’inductance, la capacitance et la résistance jusqu’à des valeurs respectivement de 2 000 H, 2 000 μF et 2 MΩ, à des fréquences de 100 Hz ou 1 kHz, en utilisant des valeurs en parallèle ou en série. Pour les besoins de l’essai RET de corrosivité, les mesures sont enregistrées en résistance, à une fréquence de 100 Hz et à l’aide de valeurs en série. Avant la mesure de la résistance électrique, on réduit la tension de surface de la peau en ajoutant un volume suffisant d’éthanol à 70 % pour couvrir l’épiderme. Après quelques secondes, on enlève l’éthanol du tube, puis on hydrate le tissu par l’addition de 3 ml d’une solution de sulfate de magnésium (154 mM). Les électrodes du pont de mesure sont placées de part et d’autre du disque cutané pour prendre la mesure de la résistance en kΩ/disque cutané (figure 1). Les dimensions des électrodes et la longueur d’électrode exposée sous les pinces crocodiles sont indiquées à la figure 2. La pince maintenant l’électrode intérieure repose sur la partie supérieure du tube PTFE pendant la mesure de la résistance, afin que la longueur d’électrode immergée dans la solution de sulfate de magnésium reste constante. L’électrode extérieure est introduite dans le compartiment receveur de manière à reposer sur le fond de celui-ci. La distance entre la pince à ressort et la partie inférieure du tube PTFE est maintenue constante (figure 2), cette distance influençant la valeur de résistance obtenue. Par conséquent, la distance entre l’électrode intérieure et le disque cutané doit être constante et minimale (1 à 2 mm).
23. Il convient de noter que si la valeur de résistance mesurée est supérieure à 20 kΩ, ceci peut être dû au fait que des restes du produit chimique d’essai couvrent la surface épidermique du disque de peau. On peut essayer de retirer davantage de produit chimique d’essai, par exemple en fermant de façon étanche le tube PTFE avec le pouce revêtu d’un gant et en l’agitant pendant 10 secondes environ. On élimine ensuite la solution de sulfate de magnésium et on répète la mesure de la résistance avec une nouvelle solution de sulfate de magnésium.
24. Les caractéristiques et dimensions de l’appareil d’essai et de la procédure expérimentale peuvent avoir une incidence sur les valeurs de RET obtenues. Le seuil de corrosivité de 5 kΩ a été défini sur la base des données obtenues à partir de l’appareil et de la procédure spécifiques décrits dans cette méthode d’essai. Avec un autre équipement ou dans des conditions d’essai différentes, les valeurs de seuil et de contrôle peuvent être différentes. Par conséquent, il est nécessaire d’étalonner la méthodologie et la valeur de seuil de résistance en testant différentes substances d’épreuve de compétence, choisis parmi ceux utilisés dans l’étude de validation (8)(9), ou dans des classes chimiques équivalentes à celles des substances étudiées. Un ensemble de substances d’épreuve de compétence est présenté au tableau 1.
Méthodes avec fixation d’un colorant
25. L’exposition à certains produits chimiques non corrosifs peut entraîner une réduction de la résistance sous la valeur de seuil de 5 kΩ, permettant ainsi le passage d’ions à travers le stratum corneum, ce qui réduit ainsi la résistance électrique (9). Par exemple, les substances organiques neutres et les substances tensio-actives (détergents, émulsifiants et autres agents de surface) peuvent évacuer les lipides de la peau et accroître la perméabilité aux ions de la barrière cutanée. En conséquence, si les valeurs de RET obtenues avec ces produits chimiques sont inférieures à, ou proches de, 5 kΩ, en l’absence de toute lésion visible sur les disques cutanés, une étude de pénétration d’un colorant doit être menée sur les tissus traités et de contrôle, afin de déterminer si ces valeurs de RET résultent d’une perméabilité accrue ou d’une corrosion de la peau (7) (9). S’il s’agit d’une corrosion, autrement dit si le stratum corneum est rompu, le colorant sulforhodamine B appliqué à la surface de la peau pénètre rapidement et teinte les tissus sous-jacents. Ce colorant reste stable au contact d’un large éventail de substances et n’est pas affecté par la procédure d’extraction décrite ci-après.
Application et élimination du colorant Sulforhodamine B
26. Après l’essai de RET, le sulfate de magnésium est évacué du tube et la peau est soigneusement examinée. Si aucune lésion majeure n’est visible (par exemple une perforation), 150 μl d’une dilution à 10 % (p/v) de sulforhodamine B (Acid Red 52; C.I. 45100; numéro CAS 3520-42-1) dans de l’eau distillée sont appliqués sur la surface épidermique de chaque disque pendant 2 heures. Les disques cutanés sont lavés ensuite sous un jet d’eau courante à température ambiante pendant environ 10 secondes pour éliminer le colorant excédentaireou non fixé. Chaque disque cutané est soigneusement enlevé du tube PTFE et placé dans un flacon (par exemple un flacon à scintillation en verre de 20 ml) contenant de l’eau désionisée (8 ml). Les flacons sont agités doucement pendant 5 minutes pour éliminer complètement tout colorant excédentaire ou non fixé. Après avoir répété l’opération de rinçage, on enlève les disques cutanés et on les place dans des flacons contenant 5 ml de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 30 % (p/v) dans de l’eau distillée, puis on les incube pendant une nuit à 60 °C.
27. Après incubation, chaque disque de peau est retiré et jeté, et la solution restante est centrifugée pendant 8 minutes à 210 °C (force centrifuge relative ~175 × g). Un échantillon de 1 ml de surnageant est ensuite dilué dans un rapport de 1 à 5 (v/v) [soit 1 ml + 4 ml] avec du SDS à 30 % (p/v) dans de l’eau distillée. La densité optique (DO) de la solution est mesurée à environ 565 nm.
Calcul de la teneur en colorant
28. La teneur de chaque disque en colorant sulforhodamine B est calculée sur la base des valeurs de DO (9) (coefficient d’extinction molaire de la sulforhodamine B à 12 nm = 8,7 × l04; poids moléculaire = 580). La teneur en sulforhodamine B est déterminée pour chaque disque de peau à l’aide d’une courbe-étalon appropriée et on calcule ensuite une teneur moyenne en colorant pour les essais répétés.
Critères d’acceptabilité
29. Les valeurs moyennes de la RET sont acceptées à condition que les valeurs des contrôles positifs et négatifs effectués parallèlement se situent dans les plages acceptables pour la méthode en laboratoire d’essai. Les plages acceptables de valeur de résistance pour la méthodologie et l’appareillage décrits ci-avant sont les suivantes:
| Contrôle | Substance | Plage de résistance (kΩ)
| Positif | Acide chlorhydrique 10 M | 0,5 - 1,0
| Négatif | Eau distillée | 10 - 25
30. Les valeurs moyennes de la fixation du colorant sont acceptées à condition que les valeurs des contrôles effectués parallèlement se situent dans la plage acceptable pour la méthode. Les plages acceptables de teneur en colorant pour les substances de contrôle proposées pour la méthodologie et l’appareillage décrits ci-avant sont indiquées dans le tableau suivant:
| Contrôle | Substance | Plage de teneur en colorant (μg/disque)
| Positif | Acide chlorhydrique 10 M | 40 - 100
| Négatif | Eau distillée | 15 - 35
Interprétation des résultats
31. La valeur seuil de RET qui permet de distinguer les produits chimiques corrosifs des produits non corrosifs a été déterminée lors de l’optimisation de la méthode d’essai, testée durant une phase de pré-validation, puis confirmée dans le cadre d’une étude formelle de validation.
32. Le modèle prédictif de la méthode d’essai de RET sur épiderme de rat (9) (19), associé au système de classification du SGH de l’ONU/du règlement CLP, est le suivant:
On considère que le produit chimique d’essai est non corrosif pour la peau:
i) si la valeur moyenne de la RET pour le produit chimique d’essai est supérieure à 5 kΩ, ou
ii) si la valeur moyenne de la RET pour le produit chimique d’essai est inférieure ou égale (≤) à 5 kΩ, et
— que les disques de peau ne montrent aucune lésion manifeste (par exemple une perforation), et
— que la teneur moyenne en colorant du disque est inférieure (<) à la teneur moyenne en colorant du disque de contrôle positif (acide hydrochlorique 10 M) obtenue parallèlement (pour connaître les plages acceptables, se reporter au paragraphe 30).
On considère que le produit chimique d’essai est corrosif pour la peau:
i) si la valeur moyenne de la RET pour le produit chimique d’essai est inférieure ou égale (≤) à 5 kΩ, et que les disques de peau montrent des lésions manifestes (par exemple une perforation), ou
ii) si la valeur moyenne de la RET pour le produit chimique d’essai est inférieure ou égale (≤) à 5 kΩ, et
— que les disques de peau ne montrent aucune lésion manifeste (par exemple une perforation), mais
— que la teneur moyenne en colorant du disque est supérieure ou égale (≥) à la teneur moyenne en colorant du disque de contrôle positif (acide hydrochlorique 10 M) obtenue parallèlement (pour connaître les plages acceptables, se reporter au paragraphe 30).
33. Une expérience réalisée à l’aide d’au moins trois réplicats de disques de peau devrait suffire pour tester un produit chimique dont la classification est sans équivoque. En revanche, dans le cas de résultats ambigus, tels que des mesures non concordantes pour les différents réplicats et/ou une RET égale à 5 ± 0,5 kΩ, une seconde expérience indépendante est envisagée, voire une troisième en cas de résultats discordants entre les deux premiers.
RÉSULTATS ET RAPPORT
Résultats
34. Les valeurs de résistance (kΩ) et les valeurs de teneur en colorant (μg/disque), s’il y a lieu, pour le produit chimique d’essai et pour les contrôles positifs et négatifs doivent être présentées sous forme de tableau, et inclure les données de chaque réplicat de disque pour chaque expérience et les valeurs moyennes ± écart-type. Toutes les expériences reproduites doivent être consignées. Les lésions observées sur les disques de peau doivent être enregistrées pour chaque produit chimique d’essai.
Rapport d’essai
35. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Produit chimique d’essai et substances de contrôle:
— Substance mono-constituant: identification chimique, notamment désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro(s) CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale et/ou autres identifiants, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent;
— Substance multi-constituants, UVCB ou mélange: caractérisation, dans la mesure du possible, par exemple par l’identité chimique (voir ci-dessus), la pureté, les caractéristiques quantitatives et les propriétés physico-chimiques pertinentes (voir ci-dessus) des constituants, selon les données disponibles;
— Apparence physique, hydrosolubilité, solubilité dans le DMSO et autres propriétés physico-chimiques pertinentes, selon les données disponibles;
— Source et numéro de lot si disponible;
— Traitement du produit chimique d’essai ou de la substance de contrôle avant la conduite de l’essai, s’il y a lieu (par exemple chauffage, broyage);
— Stabilité du produit chimique d’essai, date de péremption, ou date de vérification analytique si disponible;
— Conditions de stockage et stabilité, selon les données disponibles.
Animaux d’essai:
— Souche et sexe;
— âge au moment du prélèvement de peau;
— source, conditions d’hébergement, alimentation, etc.;
— détails de la préparation de la peau.
Conditions de l’essai:
— courbes d’étalonnage de l’appareil d’essai;
— courbes d’étalonnage des performances de l’essai de fixation d’un colorant, passe-bande utilisé pour mesurer les valeurs de DO, et plage de linéarité de l’appareil de mesure (par exemple spectrophotomètre), le cas échéant;
— détails de la procédure d’essai utilisée pour les mesures de la RET;
— détails de la procédure d’essai utilisée pour l’évaluation de la fixation du colorant, le cas échéant;
— doses d’essai utilisées, durée de la ou des périodes d’exposition et température(s) d’exposition;
— détails de la procédure de lavage utilisée après la période d’exposition;
— nombre de réplicats de disques de peau utilisés par produit chimique d’essai et par substance de contrôle (négatif et positif);
— description de toute modification de la procédure d’essai;
— référence aux données historiques du modèle, à savoir (liste non limitative):
i) acceptabilité des valeurs de RET des contrôles positif et négatif (en kΩ) par rapport aux plages de résistance des contrôles positif et négatif,
ii) acceptabilité des valeurs de la teneur en colorant des contrôles positif et négatif (en μg/disque) par rapport aux plages de teneur en colorant des contrôles positif et négatif,
iii) acceptabilité des résultats de l’essai par rapport à la variabilité historique entre réplicats de disques de peau;
— description des critères de décision/du modèle prédictif appliqués.
Résultats:
— présentation sous forme de tableau des valeurs de RET et de l’essai de fixation d’un colorant (le cas échéant), pour chaque produit chimique d’essai et substance de contrôle, pour chaque expérience et chaque réplicat de disque cutané (pour chaque animal et chaque échantillon de peau), moyennes, écarts-types et écarts-types relatifs;
— description de tous les effets observés;
— classification obtenue compte tenu du modèle prédictif/des critères de décision utilisés.
Discussion des résultats
Conclusions
BIBLIOGRAPHIE
(1) United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].
(2) Chapitre B.4 de la présente annexe, Effet irritant/corrosif aigu sur la peau.
(3) Chapitre B.40 bis de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: Essai sur modèle de peau humaine.
(4) Chapitre B.65 de la présente annexe, Méthode d’essai in vitro sur membrane d’étanchéité pour la corrosion cutanée.
(5) Chapter B.46 of this Annex, Irritation cutanée in vitro: essai sur épiderme humain reconstitué.
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(13) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.
(14) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.
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(18) Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.
(19) TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.
(20) OCDE (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
Figure 1
Appareil Pour L’essai de ret sur Peau de Rat
Figure 2
Dimensions du tube PTFE (Polytétrafluoroéthylène), des Tubes receveurs et des Électrodes Utilisés
Facteurs importants pour l’appareil ci-dessus:
— diamètre intérieur du tube PTFE;
— longueur des électrodes par rapport au tube PTFE et au tube receveur: le disque cutané ne doit pas être en contact avec les électrodes, et une longueur standard d’électrode doit être en contact avec la solution de sulfate de magnésium;
— quantité de solution de sulfate de magnésium dans le tube receveur: la profondeur de liquide, par rapport au niveau dans le tube PTFE, doit être telle qu’indiquée dans la figure 1;
— fixation du disque cutané sur le tube PTFE: la résistance électrique doit être véritablement une mesure des propriétés de la peau.
»
(6) Dans la partie B, le chapitre B.40 bis est remplacé par le texte suivant:
«B.40 bis CORROSION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI SUR MODÈLE DE PEAU HUMAINE (RhE)
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 431 (2016) de l’OCDE. La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions irréversibles de la peau, qui se manifestent par une nécrose visible, à travers l’épiderme et jusque dans le derme, suite à l’application d’un produit chimique d’essai [selon la définition du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies (ONU) et du règlement (CE) no 1272/2008 de l’Union européenne relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges (ci-après le «règlement CLP»)] (1). La présente version mise à jour de la méthode d’essai B.40 bis propose une procédure in vitro permettant d’identifier les substances et mélanges corrosifs et non corrosifs selon la définition du SGH de l’ONU et du règlement CLP. Elle permet aussi une sous-catégorisation partielle des produits chimiques corrosifs.
2. Traditionnellement, l’évaluation du potential de corrosion cutanée par les produits chimiques a impliqué le recours à des animaux de laboratoire (méthode d’essai B.4, équivalente à la ligne directrice 404 de l’OCDE, initialement adoptée en 1981 et révisée en 1992, 2002 et 2015) (2). Outre la présente méthode d’essai B.40 bis, deux autres méthodes d’essai in vitro ont été validées et adoptées pour évaluer le potentiel de corrosion cutanée des produits chimiques, à savoir la méthode d’essai B.40 (équivalente à la ligne directrice 430 de l’OCDE) (3) et la méthode d’essai B.65 (équivalente à la méthode d’essai 435 de l’OCDE) (4). Par ailleurs, la méthode d’essai in vitro B.46 (équivalente à la ligne directrice 439 de l’OCDE) (5) a été adoptée pour le volet «irritation cutanée». Un document guide de l’OCDE sur les Approches Intégrées en matière d’Essai et d’Évaluation (IATA en anglais) pour l’irritation et la corrosion de la peau propose une approche modulaire pour les tests d’irritation et de corrosion de la peau. L’approche intégrée décrit plusieurs modules qui regroupent les sources d’information et les outils d’analyse, et fournit des guides sur la façon 1) d’intégrer et d’utiliser les informations existantes sur les données d’essai et autres données pour l’évaluation du potentiel irritant et corrosif pour la peau des produits chimiques d’essai, et 2) propose une approche dans les cas où des tests supplémentaires sont recommandés (6).
3. La présente méthode d’essai porte sur le danger de corrosion cutanée pour la santé humaine. Elle fait appel à un épiderme humain reconstitué (obtenu à partir de kératinocytes non transformés prélevés sur épiderme humain) qui reproduit fidèlement les propriétés histologiques, morphologiques, biochimiques et physiologiques des couches supérieures de la peau humaine, c’est-à-dire de l’épiderme. La ligne directrice équivalente de l’OCDE, initialement adoptée en 2004, avait été mise à jour en 2013 pour y inclure deux méthodes d’essai supplémentaires utilisant les modèles d’épiderme humain reconstitué, et la possibilité d’utiliser les méthodes pour faciliter la sous-catégorisation des produits chimiques corrosifs. La ligne directrice a de nouveau été mise à jour en 2015 pour y introduire la référence au Document guide IATA et une procédure alternative pour mesurer la viabilité cellulaire.
4. La présente méthode d’essai utilise quatre modèles d’épiderme humain reconstitué disponibles dans le commerce. Des études de prévalidation (7), suivies d’une étude formelle de validation pour l’évaluation de la corrosion cutanée (8) (9) (10), ont été menées (11)(12) sur deux de ces modèles d’essai disponibles dans le commerce, le modèle standard (SM) EpiSkin™ et l’essai de corrosion cutanée (SCT) EpiDerm™ (EPI-200) (désignées comme les méthodes de référence validées – MRV- dans le texte qui suit). Sur la base des résultats de ces études, il est désormais recommandé que ces deux MRV puissent servir, à des fins réglementaires, à distinguer les produits chimiques corrosifs (C) des produits chimiques non corrosifs (NC), et que la méthode EpiSkin™ puisse également être utilisée pour sous-catégoriser les produits chimiques corrosifs (13) (14) (15). Deux autres modèles d’essai d’irritation cutanée in vitro sur épiderme humain reconstitué, également disponibles dans le commerce, ont donné des résultats analogues à la MRV EpiDerm™ selon une validation fondée sur les normes de performance (16) (17) (18). Il s’agit des méthodes SkinEthic™ RHE et epiCS® (précédemment connue sour le nom EST-1000), qui peuvent aussi servir à des fins réglementaires pour distinguer les produitss chimiques corrosifs des produits chimiques non corrosifs (19) (20). Des études post-validation réalisées entre 2012 et 2014 par les producteurs des modèles d’épiderme humain reconstitué, à l’aide d’un protocole affiné corrigeant les interférences causées par la réduction non spécifique du MTT par les produits chimiques d’essai, ont amélioré les performances, s’agissant aussi bien de la distinction entre produits chimiques corrosifs et non corrosifs que pour soutenir la sous-catégorisation des produits chimiques corrosifs (21)(22). Des analyses statistiques sur des données collectées après la validation et générées sur EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE et epiCS® ont permis d’identifier des modèles de prédiction alternatifs qui améliorent leur capacité de prédiction pour la sous-catégorisation (23).
5. Avant de pouvoir utiliser à des fins réglementaires une méthode d’essai in vitro de corrosivité cutanée sur épiderme humain reconstitué similaire ou modifiée autre que les MRV, il convient d’en déterminer la fiabilité, la pertinence (précision) et les limitations pour l’usage préconisé, afin de s’assurer de sa similitude avec les MRV, conformément aux normes de performance (24) établies suivant les principes du document guide de l’OCDE sur la validation No 34 (25). L’acceptation mutuelle des données n’est garantie que dans la mesure où les méthodes d’essai nouvelles ou mises à jour conformément aux normes de performances ont été examinées et intégrées dans la ligne directric d’essai correspondante. Les modèles d’essai inclus dans cette ligne directrice peuvent être utilisés pour répondre aux exigences des pays en matière d’essais in vitro de corrosion cutanée, tout en bénéficiant de l’acceptation mutuelle des données.
DÉFINITIONS
6. Les définitions utilisées figurent à l’appendice 1.
CONSIDÉRATIONS INITIALES
7. La présente méthode d’essai permet d’identifier les substances et mélanges corrosifs et non corrosifs selon la définition du SGH de l’ONU et du règlement CLP. Cette méthode d’essai autorise en outre à sous-catégoriser les substances et mélanges corrosifs, en les classant dans la sous-catégorie facultative 1A telle que définie par le SGH de l’ONU (1), ou dans les sous-catégories 1B et 1C combinées (21)(22)(23). Une limite de cette méthode d’essai est qu’elle ne permet pas d’établir de distinction entre les sous-catégories de corrosivité cutanée 1B et 1C du SGH de l’ONU et du CLP, en raison du nombre limité de produits chimiques corrosifs in vivo de sous-catégorie 1C bien connus. Les modèles d’essai EpiSkin™, EpiDerm™, SkinEthic™ et epiCS® sont à même de permettre une sous-catégorisation (1A vs 1B et 1C vs substances non corrosives (NC)).
8. Un large éventail de produits chimiques, constitué principalement de substances individuelles, a été testé durant l’étude de validation des modèles d’essai proposés dans cette méthode d’essai pour une utilisation à des fins d’identification des substances corrosives et non corrosives; la base de données empiriques de l’étude de validation totalisait 60 produits chimiques couvrant une grande variété de classes chimiques (8) (9) (10). Les tests visant à démontrer la sensibilité, la spécificité, la précision et la reproductibilité intra-laboratoire de l’essai de sous-catégorisation ont été réalisés par les développeurs de chaque méthode d’essai et leurs résultats ont été examinés par l’OCDE (21) (22) (23). D’après l’ensemble des données disponibles, la méthode d’essai peut être utilisée pour tester un large éventail de classes chimiques et d’états physiques, notamment des liquides, des semi-solides, des solides et des cires. Les liquides peuvent être aqueux ou non; les solides peuvent être solubles ou insolubles dans l’eau. Si possible, les solides sont moulus finement avant application; aucun autre traitement préalable de l’échantillon n’est nécessaire. Dans les cas où l’on peut apporter la preuve que les modèles d’essai de la présente méthode d’essai ne peuvent s’appliquer à une catégorie donnée de substances, il convient de ne pas les utiliser pour tester la catégorie de substances en question. De plus, outre les substances, cette méthode d’essai directrice est censée pouvoir s’appliquer aux mélanges. Or, les mélanges couvrant un large éventail de catégories et de compositions, et compte tenu des informations limitées disponibles actuellement à propos des essais de mélanges, dans les cas où l’on peut apporter la preuve que cette méthode d’essai ne peut s’appliquer à une catégorie donnée de mélanges (par exemple selon la stratégie proposée dans (26)), la méthode d’essai ne doit pas être utilisée pour tester la catégorie de mélanges en question. Les gaz et les aérosols n’ont pas encore fait l’objet d’études de validation (8) (9) (10). Avant d’utiliser la présente méthode d’essai pour tester un mélange afin de générer des données dans un but réglementaire, il convient de s’assurer et de justifier le cas échéant, que les données générées seront adéquates. De telles dispositions ne sont pas nécessaires quand il existe une exigence réglementaire de tester le mélange. Les gaz et les aérosols n’ont pas encore fait l’objet d’études de validation (9) (10). Bien qu’il soit envisageable de tester des gaz et des aérosols en faisant appel à de l’épiderme humain reconstitué, l’actuelle méthode d’essai ne permet pas de tester les produits de ce type.
9. Les produits chimiques d’essais absorbant la lumière dans la même gamme que le MTT formazan et les produits chimiques d’essais capables de réduire de façon directe le colorant vital MTT (en MTT formazan) peuvent interférer avec les mesures de viabilité cellulaire et nécessitent l’utilisation de témoins adaptés pour effectuer la correction de ces interférences. Le type de témoins adaptés qui peuvent être requis peut varier en fonction du type d’interférences produites par le produit chimique d’essai et de la procédure mise en œuvre pour mesurer le MTT formazan (voir paragraphes 25-31).
10. Si la présente méthode d’essai ne fournit pas d’informations appropriées sur l’irritation cutanée, on notera cependant que la méthode d’essai B.46 porte spécifiquement sur les essais d’irritation cutanée in vitro et, bien que faisant appel à un protocole différent, est basée sur le même système d’essai sur épiderme humain reconstitué (5). Pour une évaluation complète des effets cutanés locaux après une exposition unique, il est recommandé de consulter le document guide de l’OCDE sur les Approches Intégrées pour les Essais et l’Evaluation (IATA en anglais) (6). Cette approche IATA prévoit la conduite d’essais in vitro de corrosion cutanée (tels que décrits dans la présente méthode d’essai) et d’irritation cutanée avant d’envisager des essais sur des animaux vivants. Il est entendu que l’utilisation de peau humaine est soumise à des conditions et considérations d’éthique nationales et internationales.
PRINCIPE DE L’ESSAI
11. Le produit chimique d’essai est appliqué localement sur un modèle tridimensionnel d’épiderme humain reconstitué, composé de kératinocytes non transformés prélevés sur épiderme humain et mis en culture pour former un modèle multicouche hautement différencié d’épiderme humain. Ce modèle se compose de couches organisées (basale, épineuse et granuleuse), ainsi que d’un stratum corneum multicouche contenant des couches lipidiques lamellaires intercellulaires représentant les principales classes de lipides, semblables à celles que l’on observe in vivo.
12. La méthode d’essai sur épiderme humain reconstitué part du principe que les substances corrosives sont capables de pénétrer dans le stratum corneum (couche cornée) par diffusion ou érosion, et sont cytotoxiques pour les cellules des couches sous-jacentes. La viabilité cellulaire est mesurée via la conversion enzymatique du colorant vital MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, bromure de tétrazolium; numéro CAS 298-93-1] en un sel de formazan bleu mesuré quantitativement après son extraction des tissus (27). Les substances corrosives sont mises en évidence par leur capacité à faire chuter la viabilité cellulaire sous un seuil prédéterminé (voir paragraphes 31 et 32). Dans la pratique, la méthode d’essai de corrosion cutanée sur épiderme humain reconstitué s’est révélée fiable pour prédire la corrosion cutanée in vivo sur le lapin selon la méthode d’essai B.4 (2).
DÉMONSTRATION DES COMPÉTENCES
13. Avant d’appliquer en routine l’un des quatre modèles validés d’essai sur épiderme humain reconstitué conformément à la présente méthode d’essai, les laboratoires doivent faire la preuve de leur compétence technique en classifiant correctement les douze produits énumérés au tableau 1. S’ils utilisent une méthode de sous-classification, l’exactitude de la sous-catégorisation doit également être démontrée. Dans le cas où une substance figurant dans le tableau 1 serait indisponible, où dans d’autres cas où il est justifié de la remplacer par une autre substance (par exemple à partir de la liste de substances de référence (24)), cette autre substance peut être utilisée si des données de référence appropriées in vivo et in vitro sont disponibles, et dans la mesure où les mêmes critères de sélection que ceux décrits sous le tableau 1 sont utilisés.
Tableau 1
Liste des Substances d’épreuve de compétence
Abréviations: CAS = numéro d’enregistrement au Chemical Abstracts Service; MRV = méthode de référence validée; NC= non corrosif, O = oui; S = solide; L = liquide
| Substance | Numéro CAS | Classe chimique | Cat. SGH de l’ONU/CLP d’après les résultats in vivo | Cat MVR d’après les résultats in vitro | Agent réducteur du MTT | État physique
| Substances corrosives in vivo de sous-catégorie 1A
| Acide bromoacétique | 79-08-3 | acide organique | 1A | (3) 1A | — | S.
| Trifluorure de bore dihydraté | 13319-75-0 | acide inorganique | 1A | (3) 1A | — | L.
| Phénol | 108-95-2 | phénol | 1A | (3) 1A | — | S.
| Chlorure de dichloroacétyle | 79-36-7 | électrophile | 1A | (3) 1A | — | L.
| Combinaison de substances corrosives in vivo de sous-catégorie 1B-et-1C
| Acide glyoxylique monohydraté | 563-96-2 | acide organique | 1B-et-1C | (3) 1B-et-1C | — | S.
| Acide lactique | 598-82-3 | acide organique | 1B-et-1C | (3) 1B-et-1C | — | L
| Ethanolamine | 141-43-5 | base organique | 1B | (3) 1B-et-1C | O | V.
| Acide chlorhydrique | 7647-01-0 | acide inorganique | 1B-et-1C | (3) 1B-et-1C | — | L.
| Substances non corrosives in vivo
| Bromure de phénétyle | 103-63-9 | électrophile | NC | (3) NC | O | L
| 4-amino-1,2,4-triazole | 584-13-4 | base organique | NC | (3) NC | _ | S.
| 4-(méthylthio)-benzaldéhyde | 3446-89-7 | électrophile | NC | (3) NC | O | L
| Acide laurique | 143-07-7 | acide organique | NC | (3) NC | _ | S.
14. Dans le cadre de la démonstration des compétences, il est recommandé à l’utilisateur de contrôler les propriétés de barrière des tissus dès réception, comme précisé par le producteur du modèle d’épiderme humain reconstitué. Cette étape est particulièrement importante lorsque les tissus sont transportés sur de longues distances/durées. Lorsqu’une méthode d’essai a été établie avec succès, et que le laboratoire a démontré sa maîtrise de cette méthode, il ne sera plus nécessaire de procéder systématiquement à cette vérification. Toutefois, pour les méthodes d’essai utilisées en routine, il est recommandé de continuer à évaluer les propriétés de barrière des tissus à intervalles réguliers.
PROCÉDURE
15. Les paragraphes qui suivent offrent une description générique des éléments et des procédures des modèles d’essai de corrosion cutanée sur épiderme humain reconstitué utilisés dans la présente méthode d’essai. Les modèles d’épiderme humain reconstitué considérés comme scientifiquement valides à utiliser dans cette méthode d’essai, à savoir les modèles EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE et epiCS® (16) (17) (19) (28) (29) (30) (31) (32) (33), sont disponibles dans le commerce. Il existe des modes opératoires normalisés pour ces quatre modèles d’épiderme humain reconstitué (34) (35) (36), et les principaux éléments de leur méthode d’essai sont résumés à l’appendice 2. Il est recommandé de consulter le mode opératoire normalisé pertinent lors de la mise en œuvre et de l’utilisation d’un de ces modèles en laboratoire. Les essais réalisés avec les quatre modèles d’essai sur épiderme humain reconstitué prévus par la méthode d’essai doivent respecter les éléments suivants:
ÉLÉMENTS DE LA MÉTHODE D’ESSAI SUR ÉPIDERME HUMAIN RECONSTITUÉ
Conditions générales
16. L’épithélium est reconstruit à partir de kératinocytes humains non transformés. Plusieurs couches de cellules épithéliales viables (couche basale, stratum spinosum, stratum granulosum) doivent être présentes sous un stratum corneum fonctionnel. Le stratum corneum doit comporter plusieurs couches présentant le profil lipidique nécessaire pour constituer une barrière fonctionnelle suffisamment robuste pour résister à la pénétration rapide des substances marqueurs cytotoxiques telles que le dodécylsulfate de sodium (SDS) ou le Triton X-100. La fonction de barrière doit être démontrée et peut être évaluée soit en déterminant la concentration à laquelle une substance marqueur réduit la viabilité des tissus de 50 % (CI50) après un temps d’exposition donné, soit en définissant le temps d’exposition requis pour réduire la viabilité des cellules de 50 % (TE50) après application de la substance marqueur à une concentration fixe déterminée (voir paragraphe 18). Le modèle d’épiderme humain reconstitué doit présenter des propriétés de confinement suffisantes pour éviter que de la matière puisse contourner le stratum corneum pour atteindre les tissus viables, ce qui nuirait à la qualité de la modélisation de l’exposition cutanée. Enfin, le modèle doit être exempt de toute contamination bactérienne, virale, mycoplasmique ou mycosique.
Conditions fonctionnelles
Viabilité
17. La quantification de la viabilité cellulaire est mesurée au moyen du colorant MTT (27). Les cellules viables du modèle d’épiderme humain reconstitué réduisent le colorant vital MTT en un précipité bleu de sel de formazan., qui est ensuite extrait des tissus au moyen de l’isopropanol (ou d’un solvant similaire). La densité optique du solvant d’extraction seul doit être suffisamment faible, c’est-à-dire inférieure à 0,1. Le MTT formazan extrait peut être quantifié soit en mesurant l’absorbance standard (DO), ou une procédure de spectrophotométrie HPLC-UPLC (38). Les utilisateurs du modèle d’épiderme humain reconstitué doivent faire en sorte que chaque lot utilisé réponde aux critères définis pour le témoin négatif. Une plage d’acceptabilité (valeurs limites inférieure et supérieure) pour le témoin négatif doit être établie par le développeur/fournisseur du modèle d’épiderme humain reconstitué. Les plages d’acceptabilité des valeurs de densité optique pour les témoins négatifs des quatre modèles d’essai sur épiderme humain reconstitué validés figurant dans cette méthode d’essai sont indiquées dans le tableau 2. L’utilisateur de spectrophotométrie HPLC-UPLC devra utiliser la plage de densité optique des témoins négatifs fournie au tableau 2 comme critère d’acceptabilité du témoin négatif. Il est démontré que les tissus traités par le témoin négatif sont stables en culture (c’est-à-dire qu’ils présentent des mesures de DO similaires) tout au long de la période d’exposition.
Tableau 2
Plages d’acceptabilité des valeurs de DO du témoin négatif pour contrôler la qualité du lot
| | Valeur limite inférieure | Valeur limite supérieure
| EpiSkin™ (SM) | > 0,6 | < 1,5
| EpiDerm™ SCT (EPI-200) | > 0,8 | < 2,8
| SkinEthic™ RHE | > 0,8 | < 3,0
| epiCS® | > 0,8 | < 2,8
Fonction de barrière
18. Le stratum corneum et sa composition lipidique doivent être suffisants pour résister à la pénétration rapide de certains produits chimiques marqueurs cytotoxiques tels que le SDS ou le Triton X-100, cette capacité étant évaluée par la CI50 et le TE50 (voir tableau 3). La fonction de barrière de chaque lot de modèle de peau reconstituée doit être démontrée par le développeur/fournisseur au moment de la fourniture des tissus à l’utilisateur final (voir paragraphe 21).
Morphologie
19. L’examen histologique du modèle d’épiderme humain reconstitué doit mettre en évidence une structure multicouche semblable à celle de l’épiderme humain (comprenant un stratum basale, un stratum spinosum, un stratum granulosum et un stratum corneum) ainsi qu’un profil lipidique semblable à celui de l’épiderme humain. L’examen histologique de chaque lot de modèle de peau reconstituée utilisé, démontrant une morphologie adéquate des tissus, doit être fourni par le développeur/fournisseur au moment de la livraison des tissus à l’utilisateur final (voir paragraphe 21).
Reproductibilité
20. Les utilisateurs des méthodes d’essai doivent démontrer la reproductibilité dans le temps des résultats obtenus à l’aide des témoins positifs et négatifs. De plus, il ne faut utiliser la méthode d’essai que si le développeur/fournisseur du modèle d’épiderme humain reconstitué fournit des données démontrant sa reproductibilité dans le temps à l’aide de produits chimiques corrosifs et non corrosifs figurant par exemple sur la liste des produits chimiques d’épreuve (tableau 1). Si l’on utilise une méthode d’essai à des fins de sous-catégorisation, il convient de démontrer aussi la reproductibilité de cette sous-classification.
Contrôle de qualité
21. Le modèle d’épiderme humain reconstitué ne doit être utilisé que si le développeur/fournisseur démontre que chaque lot utilisé répond à des critères de fabrication définis, dont les plus pertinents sont ceux relatifs à la viabilité (paragraphe 17), à la fonction de barrière (paragraphe 18) et à la morphologie (paragraphe 19). Ces informations sont communiquées aux utilisateurs afin qu’ils puissent les inclure dans le rapport d’essai. Seuls les résultats obtenus à l’aide de lots de tissus ayant subi avec succès le contrôle de qualité pourront être retenus pour prédire de façon fiable la classification de la corrosivité. Une plage d’acceptabilité (valeurs limites inférieure et supérieure) pour les valeurs CI50 ou TE50 est établie par le développeur/fournisseur d’épiderme humain reconstitué. Les plages d’acceptabilité pour les quatre modèles d’essai validés sont indiquées dans le tableau 3.
Table 3
Critères de contrôle de qualité des lots
| | Valeur limite inférieure | Valeur limite supérieure
| EpiSkin™ (SM) (18 heures de traitement par SDS) (33) | CI50 = 1,0 mg/ml | CI50 = 3,0 mg/ml
| EpiDerm™ SCT (EPI-200) (Triton X-100 à 1 %) (34) | TE50 = 4,0 heures | TE50 = 8,7 heures
| SkinEthic™ RHE (Triton X-100 à 1 %)(35) | TE50 = 4,0 heures | TE50 = 10,0 heures
| epiCS® (Triton X-100 à 1 %)(36) | TE50 = 2,0 heures | TE50 = 7,0 heures
Application des produits chimiques d’essai et des produits chimiques témoins
22. Il convient d’utiliser au minimum deux réplicats de tissus par période d’exposition pour chaque produit chimique d’essai et substance témoin. Pour les produits chimiques liquides comme pour les produits chimiques solides, il convient d’appliquer une quantité suffisante de prodtuit chimiques pour recouvrir uniformément la surface de la peau, sans pour autant utiliser une dose infinie, c’est-à-dire au minimum 70 μl/cm2 ou 30 mg/cm2. Selon les modèles, il convient d’humidifier la surface de l’épiderme avec de l’eau déionisée ou distillée avant application de produits chimiques solides, afin d’assurer un bon contact entre le prodtuit chimique et la surface de l’épiderme (34) (35) (36) (37). Chaque fois que possible, il convient de tester les solides sous la forme d’une poudre fine. La méthode d’application doit convenir au produit chimique d’essai (voir par exemple les références 34 à 37). À la fin de la période d’exposition, l’épiderme doit être nettoyé avec soin à l’aide d’un tamponaqueux ou de NaCl à 0,9 %. En fonction du modèle validé utilisé, deux ou trois périodes d’exposition sont nécessaires par produit chimique d’essai (pour les quatre modèles validés d’épiderme humain reconstitué: 3 min et 1 heure; pour EpiSkin™, une période d’exposition supplémentaire de 4 heures). Selon le modèle d’essai utilisé et la période d’exposition évaluée, la température d’incubation peut varier entre la température ambiante et 37 °C.
23. Des témoins négatifs et positifs sont utilisés simultanément pour chaque épreuve afin de démontrer que la viabilité (dans le cas des témoins négatifs), la fonction de barrière et la sensibilité cellulaire qui en résulte (dans le cas du témoin positif) se situent dans une fourchette de valeurs admissibles, définie d’après les résultats historiques. Les substances de témoin positif recommandées sont l’acide acétique glacial ou l’hydroxyde de potassium 8N en fonction du modèle d’épiderme humain reconstitué mis en œuvre. Il convient de noter que l’hydroxyde de potassium 8N est un agent réducteur direct du MTT, qui peut nécessiter l’utilisation de témoins adaptés décrits aux paragraphes 25 et 26. Les témoins négatifs recommandés sont une solution NaCl à 0,9 % (p/v) ou de l’eau.
Mesures de la viabilité cellulaire
24. Il convient de recourir au test MTT, qui est un essai quantitatif, pour mesurer la viabilité cellulaire dans le cadre de cette méthode d’essai (27). L’échantillon de tissu est placé dans une solution MTT à la concentration appropriée (0,3 ou 1 mg/ml) pendant 3 heures. Le précipité bleu de formazan est ensuite extrait à l’aide d’un solvant (par exemple isopropanol, isopropanol acide), et l’on mesure la concentration du formazan en déterminant sa DO à 570 nm à l’aide d’un filtre passe-bande de ±30 nm au maximum, ou par une procédure de spectrophotométrie HPLC-UPLC (voir paragraphes 30 et 31) (38).
25. Les produits chimiques d’essai sont susceptibles d’interférer avec le test MTT, par réduction directe du MTT en formazan bleu, et/ou par interférence de couleurs si le produit chimique d’essai absorbe, naturellement ou sous l’effet des procédures du traitement, dans la même plage de densité optique que le formazan (570 ± 30 nm, produits chimiques principalement bleus et violets). Des contrôles ou témoins supplémentaires doivent être utilisés pour détecter et corriger les interférences potentielles avec ces produits chimiques d’essai , tel qu’un témoin de réduction non-spécifique du MTT (MTT NS) et un témoin coloré non-speçifique (T NS) (voir paragraphes 26 à 30). Cela est particulièrement important lorsque le produit chimique d’essai n’a pas été totalement éliminé du tissu par rinçage ou lorsqu’il a pénétré dans l’épiderme, et est donc présent dans les tissus lors de l’essai de viabilité au MTT. On trouvera une description détaillée de la manière de corriger la réduction directe du MTT ou les interférences dues aux agents colorants dans le mode opératoire normalisé des méthodes d’essai (34) (35) (36) (37).
26. Afin d’identifier les agents réducteurs directs du MTT, il convient d’ajouter chaque produit chimique d’essai à un milieu MTT fraîchement préparé (34) (35) (36) (37). Si le mélange de MTT et de produit chimique d’essai (ou la suspension testée pour les produits chimiques d’essais insolubles) devient bleu/violet, on considère que le produit chimique d’essai est un réducteur direct du MTT et il convient alors de procéder à des vérifications fonctionnelles supplémentaires sur les modèles d’épithélium humain reconstruit non viables, indépendamment du choix de mesurer l’absorbance (OD) ou de procéder par analyse par HPLC/UPLC-spectrophotométrie. Cette vérification s’effectue sur des tissus tués qui ne présentent qu’une activité métabolique résiduelle, mais absorbent et retiennent le produit chimique d’essai dans des proportions similaires aux tissus viables. Chaque produit chimique réducteur du MTT est appliqué sur au moins deux réplicats de tissus tués qui sont soumis à la méthode d’essai complète de corrosion de la peau. La viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: le pourcentage de viabilité tissulaire obtenu pour les tissus vivants exposés au réducteur du MTT (%viabilitétest) moins le pourcentage de réduction non spécifique du MTT obtenu pour les tissus tués exposés au même réducteur du MTT et calculé en proportion du témoin négatif testé en parallèle de l’essai à corriger (%MTT NS), soit Viabilité tissulaire réelle = [%viabilitétest] - [%MTT NS].
27. Pour repérer les interférences potentielles par des produits chimiques d’essai colorés ou qui deviennent colorés en contact avec l’eau ou l’isopropanol, et pour déterminer si des témoins supplémentaires sont nécessaires, une analyse de spectre est menée sur les produits chimiques dans l’eau (environnement au moment de l’exposition) et/ou dans l’isopropanol (solvant d’extraction). Si le produit chimique d’essai dans l’eau et/ou dans l’isopropanol absorbe assez la lumière à une longueur d’onde de 570 ± 30 nm, alors on considère que le produit chimique d’essai interfère avec la mesure de l’absorbance (DO) du formazan et des témoins colorés doivent être préparés, ou bien une procédure d’analyse par HPLC/UPLC-spectrophotométrie est employée et aucun témoin supplémentaire n’est nécessaire (voir paragraphes 30 et 31). Lorsque les mesures d’absorbance (DO) sonteffectuées, chaque produit chimique d’essai causant une interférence est appliqué sur au moins deux réplicats de tissus viables, et les deux réplicats sont soumis à la procédure d’essai complète de corrosion de la peau, à la seule différence qu’ils sont incubés dans le milieu plutôt que dans la solution MTT lors de l’étape de l’incubation avec MTT, afin de générer un témoin de couleur non spécifique dans les tissus vivants (Tvivants NS). Le témoin Tvivants NS est testé en parallèle de l’essai avec le produit chimique d’essai coloré et, dans le cas d’un essai multiple, un témoin Tvivants NS indépendant est effectué pour chaque essai (dans chaque épreuve) pour tenir compte de la variabilité biologique inhérente aux tissus vivants. La viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: le pourcentage de viabilité tissulaire obtenu pour les tissus vivants exposés au produit chimique causant une interférence et incubés avec la solution MTT (%viabilitétest) moins le pourcentage de couleur non spécifique obtenu pour les tissus vivants exposés au produit chimique causant une interférence et incubés dans du milieu sans MTT en parallèle de l’essai à corriger (%Tvivants NS), soit Viabilité tissulaire réelle = [%viabilitétest] – [%Tvivants NS].
28. Dans le cas des produits chimiques identifiés comme causant à la fois une réduction directe du MTT (voir paragraphe 26) et une interférence de couleurs (voir paragraphe 27), une troisième série de témoins est nécessaire lors de la mesure de l’absorbance (DO), en plus des témoins MTT NS et Tvivants NS décrits aux paragraphes précédents. En général, ce cas se présente pour les produits chimiques d’essai foncés (bleus, violets, noirs, par exemple), car leur couleur intrinsèque empêche l’évaluation de leur potentiel de réduction directe du MTT décrite au paragraphe 26. Les produits chimiques d’essai sont susceptibles d’être absorbés et retenus à la fois par les tissus vivants et par les tissus tués. Par conséquent et dans ce cas, l’utilisation du témoin MTT NS peut permettre de corriger l’essai non seulement en fonction du potentiel de réduction directe du MTT du produit chimique d’essai, mais aussi de l’interférence de couleurs due à l’absorption et la rétention du produit chimique d’essai par les tissus tués. Cela signifie qu’une double correction pour tenir compte de l’interférence de couleurs peut devoir être effectuée, étant donné que le témoin Tvivants NS permet déjà de tenir compte de l’interférence de couleurs due à l’absorption et à la rétention du produit chimique d’essai par les tissus vivants. Afin d’éviter cette double correction pour tenir compte de l’interférence de couleurs, un troisième témoin pour la couleur non spécifique dans les tissus tués (Tmorts NS) doit être préparé. Dans ce témoin supplémentaire, le produit chimique d’essai est appliqué sur au moins deux réplicats de tissus tués qui sont soumis à la procédure d’essai complète mais qui sont incubés dans le milieu plutôt que dans la solution MTT lors de l’étape d’incubation avec MTT. Un seul témoin Tmorts NS par produit chimique d’essai suffit, indépendamment du nombre d’épreuves, mais il doit être mené en parallèle du témoin NSMTT et sur le même lot de tissus. La viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: le pourcentage de viabilité tissulaire obtenu pour les tissus vivants exposés au produit chimique d’essai (%viabilitétest) moins %NSMTT moins % Tvivants NS plus le pourcentage de couleur non spécifique obtenu pour les tissus tués exposés au produit chimique d’essai causant une interférence et incubés dans du milieu sans MTT, calculé en proportion du témoin négatif mené en parallèle de l’essai à corriger (%Tmorts NS), soit Viabilité tissulaire réelle = [%viabilitétest] - [%MTT NS] - [%Tvivants NS] + [%Tmorts NS].
29. Il importe de noter qu’une réduction non spécifique du MTT et des interférences de couleurs non spécifiques peuvent porter l’absorbance (DO) de l’extrait tissulaire au-dessus de la plage de linéarité du spectrophotomètre. Il est donc important que chaque laboratoire détermine la plage de linéarité de son spectrophotomètre (pour la DO/surface de pic), par exemple à l’aide de formazan (CAS # 57360-69-7), disponible dans le commerce, avant de tester les produits chimiques à des fins réglementaires. Les mesures d’absorbance standard (DO) au moyen d’un spectrophotomètre sont pertinentes pour évaluer les réducteurs directs du MTT et les produits chimiques d’essai colorés quand la DO des extraits de tissus traités par le produit chimique d’essai sans correction pour la réduction directe du MTT et/ou pour les interférences de couleur sont dans la plage de linéarité du spectrophotomètre ou quand le pourcentage de viabilité non-corrigée obtenu avec le produit chimique d’essai le classe déjà comme corrosif (voir paragraphes 35 et 36). Néanmoins, les résultats pour les produits chimiques d’essai indiquant % MTT NS et/ou Tvivants NS ≥ 50 % du témoin négatif doivent être interprétés avec précaution.
30. Pour les produits chimiques d’essai colorés qui ne sont pas compatibles avec la mesure de l’absorbance standard (DO) à cause de leur forte interférence avec l’essai de MTT, peuvent être évalués par une procédure de HPLC/UPLC-spectrophotométrie (voir paragraphe 31) (38). Le système HPLC/UPLC permet de séparer le formazan du produit chimique avant la quantification (38). Pour cette raison, les témoins Tvivants NS et Tmorts NS ne sont pas nécessaires pour la procédure HPLC/UPLC-spectrophotométrie, quel que soit le produit chimique d’essai. Les témoins MTT NS sont néanmoins nécessaires si l’on s’attend à ce que le produit chimique d’essai soit un réducteur direct du MTT, ou que la couleur empêche l’évaluation de leur potentiel de réduction directe duMTT (en suivant la procédure décrite au paragraphe 26). Lorsqu’une procédure par HPLC/UPLC-spectrophotométrie est employée pour quantifier le formazan, la viabilité tissulaire est calculée en pourcentage par comparaison de la surface de pic de formazan obtenue avec des tissus vivants exposés au produit chimique d’essai avec la surface de pic de formazan obtenue avec le témoin négatif parallèle. Pour les produits chimiques d’essai réducteurs directs du MTT, la viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: %viabilitétest moins %MTT NS. Pour finir, il convient de noter que les réducteurs directs du MTT ou les réducteurs directs du MTT causant aussi une interférence de couleurs, qui sont retenus dans les tissus après le traitement et dont la capacité de réduction du MTT est telle qu’elle conduit à des DO (pour la mesure de DO) ou à des surfaces de pic (pour la procédure CLHP/CLUP-spectrophotométrie) des extraits tissulaires testés situées en-dehors de la plage de linéarité du spectrophotomètre, ne peuvent pas être évalués; ce cas ne se présente a priori que très rarement.
31. La procédure par HPLC/UPLC-spectrophotométrie est utilisable pour mesurer le formazan pour tous les types de produits chimiques (colorés ou non, réducteurs ou non réducteurs du MTT) (38). Étant donné la diversité des équipements de HPLC/UPLC -spectrophotométrie, tous les utilisateurs ne pourront pas reproduire des conditions d’équipement identiques. Pour cette raison, preuve doit être faite de l’efficacité de l’équipement de HPLC/UPLC -spectrophotométrie avant que celui-ci ne soit utilisé pour quantifier le formazan des extraits tissulaires, en remplissant les critères d’acceptabilité pour un ensemble de paramètres normalisés de qualification inspirés des paramètres décrits dans les recommandations à l’industrie de la Food and Drug Administration des États-Unis sur la validation des méthodes de bio-analyse (38) (39). Ces paramètres fondamentaux et leurs critères d’acceptation sont fournis à l’appendice 4. Une fois que les critères d’acceptabilité définis à l’appendice 4 ont été remplis, l’équipement de HPLC/UPLC-spectrophotométrie est considéré comme ayant fait la preuve de son efficacité et prêt pour les mesures du formazan dans les conditions expérimentales décrites dans la présente méthode d’essai.
Critères d’acceptabilité
32. Pour chaque méthode d’essai recourant à des modèles d’épiderme humain reconstitué valides, les tissus traités par le témoin négatif présentent une DO rendant compte de la qualité des tissus qui respecte les plages d’acceptabilité du tableau 2 et qui ne doit pas être inférieure aux limites historiques. Les résultats obtenus pour les tissus traités par le témoin positif, c’est-à-dire l’acide acétique glacial ou l’hydroxyde de potassium 8N, doivent montrer leur capacité à réagir à un produit chimique corrosif dans les conditions du modèle d’essai (voir appendice 2). La variabilité entre les réplicats de tissus pour les produits chimiques d’essai et/ou les produits chimiques témoins doit se situer dans la plage acceptable pour chaque modèle validé d’épiderme humain reconstitué (voir appendice 2) (par exemple la différence de viabilité entre les deux réplicats de tissus ne doit pas dépasser 30 %). Si le témoin négatif ou positif inclus dans une épreuve sort de la plage d’acceptabilité, l’épreuve est considérée comme non qualifiée et doit être répétée. Si la variabilité des produits chimiques d’essai sort de la plage des valeurs admissibles, l’essai doit être répété.
Interprétation des résultats et modèle prédictif
33. Les valeurs de DO obtenues pour chaque produit chimique d’essai doivent servir à calculer un pourcentage de viabilité par rapport au témoin négatif, dont la DO est fixée à 100 %. Dans le cas où la spectrophotométrie HPLC-UPLC est utilisée, le pourcentage de viabilité cellulaire est obtenu en calculant le pourcentage de MTT formazan au pic obtenu avec les tissus vivants traités par le produit chimique d’essai par rapport au pic de MTT formazan obtenu avec le témoin négatif testé en parallèle. Les valeurs seuils du pourcentage de viabilité cellulaire qui établissent la distinction entre les matières corrosives et les matières non corrosives (ou entre les différentes sous-catégories de substances corrosives) sont définies ci-dessous aux paragraphes 35 et 36 pour chacun des modèles d’essai inclus dans la présente méthode d’essai et doivent être utilisées pour interpréter les résultats.
34. Une seule expérience réalisée à l’aide d’au moins deux réplicats de tissus devrait suffire pour tester un produit chimique dont la classification obtenue est sans équivoque. En revanche, dans le cas de résultats ambigus, tels que des mesures non concordantes pour les différents réplicats, une deuxième épreuve peut être envisagée, voire une troisième en cas de résultats discordants entre les deux premières.
35. Le tableau 4 présente le modèle prédictif de la méthode d’essai de corrosion cutanée EpiSkin™ (9) (22) (34), en correspondance avec le système de classification du SGH de l’ONU/du règlement CLP:
Table 4
Modèle prédictif d’EpiSkin™
| Viabilité mesurée après différents temps d’exposition (t = 3, 60 et 240 minutes) | Prévision à considérer
| < 35 % après 3 minutes d’exposition |
Produit chimique corrosif:
• Sous-catégorie facultative 1A
|
≥ 35 % après 3 minutes d’exposition ET
< 35 % après 60 minutes d’exposition
OU
≥ 35 % après 60 minutes d’exposition ET
< 35 % après 240 minutes d’exposition
|
Produit chimique corrosif:
• Combinaison des sous-catégories facultatives 1B et 1C
| ≥ 35 % après 240 minutes d’exposition | Produit chimique non-corrosif
36. Le tableau 5 présente les modèles prédictifs des modèles d’essai de corrosion cutanée EpiDerm™ SCT (10) (23) (35), SkinEthic™ RHE (17) (18) (23) (36) et epiCS® (16) (23) (37), en correspondance avec le système de classification du SGH de l’ONU/du règlement CLP:
Tableau 5
EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE et epiCS®
| Viabilité mesurée après différents temps d’exposition (t = 3 et 60 minutes) | Prévision à considérer
| ÉTAPE 1 pour EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE et epiCS®
| < 50 % après 3 minutes d’exposition | Produit chimique corrosif
| ≥ 50 % après 3 minutes d’exposition ET < 15 %après 60 minutes d’exposition | Produit chimique corrosif
| ≥ 50 % après 3 minutes d’exposition ET ≥ 15 % après 60 minutes d’exposition | Produit chimique non corrosif
| ÉTAPE 2 pour EpiDerm™ SCT- pour les substances et mélanges identifiés comme corrosifs à l’étape 1
| < 25 % après 3 minutes d’exposition | Sous-catégorie optionnelle 1A*
| ≥ 25 % après 3 minutes d’exposition | Une combinaison des sous-catégories 1B-et-1C
| ÉTAPE 2 pour SkinEthic™ RHE pour les substances et mélanges identifiés comme corrosifs à l’étape 1corrosifs à l’étape 1
| < 18 % après 3 minutes d’exposition | Sous-catégorie optionnelle 1A*
| ≥ 18 % après 3 minutes d’exposition | Une combinaison des sous-catégories 1B-et-1C
| ÉTAPE 2 pour epiCS® pour les substances et mélanges identifiés comme corrosifs à l’étape 1
| < 15 % après 3 minutes d’exposition | Sous-catégorie optionnelle 1A*
| ≥ 15 % après 3 minutes d’exposition | Une combinaison des sous-catégories 1B-et-1C
RÉSULTATS ET RAPPORT
Résultats
37. Pour chaque essai, il convient de présenter, sous forme de tableau, les résultats obtenus pour chaque réplicat de tissu (par exemple les valeurs de DO et le pourcentage de viabilité cellulaire calculé pour chaque produit chimique d’essai, ainsi que la classification correspondante), y compris les données obtenues, le cas échéant, en répétant les expériences. En outre, les moyennes et les fourchettes de viabilité ainsi que les coefficients de variation entre les réplicats de tissus pour chaque essai doivent être consignés. Les interactions observées avec le réactif MTT pour les réducteurs directs du MTT et les produits chimiques d’essai colorés seront signalées pour chaque produit chimique d’essai.
Rapport d’essai
38. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Produits chimiques d’essai et produits chimiques témoins:
— Substance mono-constituant: Identification chimique: désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro(s) CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale et/ou autres identifiants, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent;
— Substance multi-constituants, UVCB ou mélange: Caractérisation, dans la mesure du possible, par exemple par l’identité chimique (voir ci-dessus), la pureté, les caractéristiques quantitatives et les propriétés physico-chimiques pertinentes (voir ci-dessus) des constituants, selon les données disponibles;
— Apparence physique, hydrosolubilité, solubilité dans le DMSO et autres propriétés physico-chimiques pertinentes, selon les données disponibles;
— Source et numéro de lot si disponible;
— Traitement du produit chimique d’essai ou du témoin avant la conduite de l’essai, s’il y a lieu (par exemple chauffage, broyage);
— Stabilité du produit chimique d’essai, date de péremption, ou date de vérification analytique si disponible;
— Conditions de stockage et stabilité, selon les données disponibles.
Modèle d’épiderme humain reconstitué et protocole utilisés; justification de ce choix (le cas échéant)
Conditions de l’essai:
— modèle d’épiderme humain reconstitué utilisé (y compris numéro de lot);
— informations d’étalonnage de l’appareil de mesure (par exemple spectrophotomètre), longueur d’onde et passe-bande (s’il y a lieu) utilisés pour quantifier le MTT formazan, et la plage de linéarité de cet appareil de mesure;
— description de la méthode utilisée pour quantifier le MTT formazan;
— description des spécifications du système de spectrophotométrie HPLC/UPLC, s’il y a lieu;
— informations complètes sur le modèle spécifique d’épiderme humain reconstitué utilisé, et notamment sur ses performances, à savoir (liste non limitative):
i) viabilité;
ii) fonction de barrière;
iii) morphologie;
iv) reproductibilité et capacité prédictive;
v) contrôles de qualité (CQ) du modèle;
— références des données historiques du modèle utilisé, à savoir (liste non limitative) l’acceptabilité des données de contrôle de qualité au regard des données historiques du lot;
— démonstration de la compétence à exécuter la méthode d’essai, avant une utilisation régulière, au moyen des substances d’épreuve de compétence.
Protocole de l’essai:
— description détaillée des procédures appliquées, y compris les procédures de lavage utilisées après la période d’exposition;
— doses de produit chimique d’essai et de produit chimique témoin;
— durée de la ou des périodes d’exposition et température(s) d’exposition;
— indication des témoins utilisés pour les agents réducteurs directs du MTT et/ou les produits chimiques colorés, s’il y a lieu;
— nombre de réplicats de tissus utilisés par produit chimique d’essai et témoin (contrôle positif, témoin négatif et, le cas échéant, réduction non spécifique du MTT et coloration non spécifique, témoin vivant non spécifique (Tvivant NS), témoin mort non spécifique (Tmort NS)), par temps d’exposition;
— description des critères de décision/du modèle prédictif appliqués en fonction du modèle d’épiderme humain reconstitué utilisé;
— description de toute modificatin apportée au protocole d’essai (y compris aux procédures de lavage).
Critères d’acceptabilité de l’épreuve et de l’essai:
— valeur moyenne des témoins positifs et négatifs et plage d’acceptabilité par rapports aux données historiques;
— variabilité acceptable entre les réplicats de tissus pour les témoins positifs et négatifs;
— variabilité acceptable entre les réplicats de tissus pour le produit chimique d’essai.
Résultats:
— présentation des résultats sous forme de tableau, pour chaque produit chimique d’essai et substance de témoin, chaque période d’exposition, chaque épreuve et chaque mesure de réplicat, y compris la densité optique ou le pic de MTT formazan, le pourcentage de viabilité cellulaire, le pourcentage moyen de viabilité cellulaire, les diff’rences entre les réplicats , l’erreur standard et/ou le coefficient de variation s’il y a lieu;
— S’il y a lieu, les résultats des témoins utilisés pour les agents réducteurs directs du MTT et/ou les produits chimiques d’essai colorants, y compris la densité optique ou le pic de MTT formazan, % MTT NS, % Tvivant NS, %Tmort NS, les différences entre les réplicats de tissus, l’erreur standard et/ou le coefficient de variation s’il y a lieu, et le pourcentage final corrigé de viabilité cellulaire;
— Résultats obtenus pour le ou les produits chimiques d’essai et le ou les produits chimiques témoins au regard des critères d’acceptabilité de l’épreuve et de l’essai définis;
— description de tous autres effets observés;
— classification obtenue compte tenu du modèle prédictif/des critères de décision utilisés.
Discussion des résultats
Conclusions
BIBLIOGRAPHIE
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(2) Chapitre B.4 de la présente annexe, Effet irritant/corrosif aigu sur la peau.
(3) Chapitre B.40 de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: essai de résistance électrique transcutanée (RET).
(4) Chapitre B.65 de la présente annexe, Méthode d’essai in vitro sur membrane d’étanchéité pour la corrosion cutanée.
(5) Chapitre B.46 de la présente annexe, Irritation cutanée in vitro: essai sur épiderme humain reconstitué.
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(7) Dans la partie B, le chapitre B.46 est remplacé par le texte suivant:
«B.46 IRRITATION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI SUR ÉPIDERME HUMAIN RECONSTITUÉ
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 439 (2015) de l’OCDE. L’irritation cutanée désigne l’apparition sur la peau de lésions réversibles à la suite de l’application d’un produit chimique pendant une période allant jusqu’à quatre heures [selon la définition du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies (ONU)] (1) et le règlement (CE) no 1272/2008 de l’Union européenne relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges (ci-après le «règlement CLP»). La présente méthode d’essai propose une procédure in vitro pouvant servir à identifier les dangers liés aux produits chimiques (substances et mélanges) irritants, classés en catégorie 2, telle que définie par le SGH de l’ONU/le règlement CLP (2). Pour les régions n’ayant pas adopté la catégorie 3 facultative (produits chimiques faiblement irritants) selon le SGH de l’ONU, la présente méthode d’essai peut aussi servir à identifier des produits chimiques non classés. Par conséquent, suivant le cadre réglementaire et le système de classification en vigueur, cette méthode d’essai peut être utilisée pour déterminer le pouvoir irritant pour la peau d’un produit chimique, en tant que méthode de substitution à part entière remplaçant l’essai d’irritation cutanée in vivo, ou en tant que méthode substitutive partielle, dans le cadre d’une stratégie d’essai (3).
2. Jusqu’à présent, l’évaluation de l’irritation cutanée impliquait généralement le recours à des animaux de laboratoire [méthode d’essai B.4, équivalente à la ligne directrice 404 de l’OCDE, adoptée en 1981 et révisée en 1992, 2002 et 2015] (4). Pour tester le potentiel de corrosivité, trois méthodes d’essai in vitro validées ont été adoptées par l’Union européenne: elles constituent respectivement les méthodes d’essai B.40 (équivalente à la ligne directrices 430 de l’OCDE), B.40bis (équivalente à la ligne directrice 431 de l’OCDE) et B.65 (équivalente à la ligne directrice 435 de l’OCDE) (5) (6) (7). Un Document Guide de l’OCDE sur les Approches Intégrées sur les Essais et l’Évaluation (IATA) pour l’irritation et la corrosion de la peau décrit plusieurs modules qui rassemblent les sources d’information et les outils d’analyse et (i) fournit des orientations sur la façon d’intégrer et d’utiliser les données d’essais et autres données pour l’évaluation du potentiel d’irritation ou de corrosion de la peau des produits chimiques d’essaiet (ii) propose une approche quand des essais supplémentaires sont requis (3).
3. La présente méthode d’essai porte sur le danger d’irritation cutanée pour la santé humaine. Elle fait appel à un système d’essai in vitro utilisant un épiderme humain reconstitué qui reproduit fidèlement les propriétés biochimiques et physiologiques des couches supérieures de la peau humaine, c’est-à-dire l’épiderme. Le système d’épiderme humain reconstitué utilise des dérivés de kératinocytes humains non transformés comme source cellulaire afin de reconstruire un modèle d’épiderme comprenant une cyto-architecture et une histologie représentatives. Un ensemble de normes de performance ont été développées afin de faciliter la validation et l’évaluation de méthodes d’essai sur épiderme humain reconstitué similaires ou modifiées, conformément aux principes du document d’orientation no34 de l’OCDE (8) (9). La présente méthode d’essai a été initialement adoptée en 2010, puis mise à jour une première fois en 2013 afin d’y inclure de nouvelles méthodes d’essai faisant usage du modèle de peau humaine reconstituée, puis une seconde fois en 2015 afin d’y inclure la référence au document guide IATA et d’y introduire une procédure alternative de mesure de la viabilité cellulaire.
4. Des études de pré-validation, d’optimisation et de validation ont été réalisées pour quatre modèles d’essai in vitro disponibles dans le commerce (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) utilisant un modèle d’épiderme humain reconstitué (sensibilité de 80 %, spécificité de 70 % et précision de 75 %). Ces quatre modèles d’essai sont inclus dans la présente méthode d’essai et sont énumérés dans l’appendice 2 qui fournit également des informations sur le type d’étude de validation menée pour valider chaque méthode respectivement. Comme noté dans l’appendice 2, la méthode de référence validée (MRV) a été utilisée pour développer la présente méthode d’essai, y compris les normes de performance (8).
5. L’acceptation mutuelle des données ne sera garantie pour les modèles d’essai validés selon les normes de performance (8) que si ces modèles d’essai ont été examinés et adoptés par l’OCDE. Les modèles d’essai inclus dans la présente méthode d’essai et dans la ligne directrice correspondante de l’OCDE peuvent être utilisés sans discrimination dans le but de répondre aux exigences réglementaires des pays et de générer des résultats d’essai issus de l’une des méthodes d’essai in vitro sur l’irritation de la peau, tout en bénéficiant de l’acceptation mutuelle des données.
6. Les définitions des termes utilisés dans ce document figurent à l’appendice 1.
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES
7. L’une des limites de la présente méthode d’essai, comme l’a démontré l’étude de validation prospective complète évaluant et caractérisant les méthodes d’essai sur l’épiderme humain reconstitué (16), est qu’elle ne permet pas la classification des produits chimiques dans la catégorie facultative 3 (produits chimiques faiblement irritants) du SGH de l’ONU (1). Par conséquent, son utilisation sera fonction de la réglementation en vigueur dans les pays membres. Pour une évaluation complète des effets cutanés locaux faisant suite à une exposition unique, le document guide no 203 de l’OCDE sur les Approches Intégrées pour les Essais et l’Évaluation doit être consulté (3). Il est entendu que l’utilisation de peau humaine est soumise à des conditions et considérations d’éthique nationales et internationales.
8. La présente méthode d’essai se rapporte aux effets d’irritation de la peau humaine. Si elle ne fournit pas d’informations appropriées sur la corrosion cutanée, on notera cependant que la méthode d’essai B.40 bis (équivalente à la méthode d’essai 431 de l’OCDE) relative à la corrosion cutanée, bien que faisant appel à un protocole différent, est basée sur le même système d’essai sur épiderme humain reconstitué (6). La présente méthode d’essai a recours à des modèles d’épiderme humain reconstitué utilisant des kératinocytes humains, et reproduisant donc in vitro l’organe cible de l’espèce étudiée. De plus, elle couvre directement l’étape initiale de la cascade inflammatoire/du mécanisme d’action (lésions cellulaires et tissulaires causant un traumatisme localisé) survenant au cours de l’irritation in vivo. Les essais réalisés dans le cadre de l’étude de validation sous-tendant cette méthode d’essai ont porté sur un large éventail de produits chimiques; la base de données de cette étude totalisait 58 produits chimiques (16) (18) (23). La présente méthode d’essai peut être utilisée pour tester des solides, des liquides, des semi-solides et des cires. Les liquides peuvent être aqueux ou non; les solides peuvent être solubles ou insolubles dans l’eau. Si possible, les solides sont moulus finement avant application; aucun autre prétraitement de l’échantillon n’est nécessaire. Les gaz et les aérosols n’ont pas encore fait l’objet d’une étude de validation (29). Bien qu’il soit envisageable de pouvoir tester des gaz et des aérosols en faisant appel à de l’épiderme humain reconstitué, l’actuelle méthode d’essai ne permet pas de tester les produits de ce type.
9. Avant d’utiliser la présente méthode d’essai pour tester un mélange afin de générer des données dans un but réglementaire, il convient de s’assurer et de justifier le cas échéant, que les données générées seront adéquates. De telles dispositions ne sont pas nécessaires quand il existe une exigence réglementaire de tester le mélange. Cependant, du fait que les mélanges couvrent une large gamme de catégories et de composition, et que l’information sur les essais de mélanges est encore parcellaire, il convient de ne pas utiliser la présente méthode d’essai pour une catégorie spécifique de mélanges quand il a été démontré que cette méthode ne s’applique pas à cette catégorie spécifique (par exemple en suivant la stratégie proposée par Eskes et al en 2012 (30)). Des précautions similaires doivent être prises dans les cas où des classes ou des propriétés physico-chimiques spécifiques limitent l’utilisation de la méthode d’essai.
10. Les produits chimiques d’essai absorbant la lumière dans la même gamme que le MTT formazan et les produits chimiques d’essai capable de réduire de façon directe le colorant vital MTT (en MTT formazan) peuvent interférer avec les mesures de viabilité cellulaire et requirent l’utilisation de témoins adaptés pour la correction 9voir paragraphes 28 à 34).
11. Une seule expérience réalisée à l’aide de trois réplicats de tissus identiques devrait suffire pour tester les produits chimiques dont la classification est sans équivoque. En revanche, dans le cas de résultats ambigus, tels que des mesures non concordantes pour les différents réplicats et/ou une viabilité moyenne égale à 50 ± 5 %, une seconde expérience est envisagée, voire une troisième en cas de résultats discordants entre les deux premières.
PRINCIPE DE L’ESSAI
12. Le produit chimique est appliqué localement sur un modèle tridimensionnel d’épiderme humain reconstitué, composé de kératinocytes non transformés prélevés sur épiderme humain et mis en culture pour former un modèle multicouche hautement différencié d’épiderme humain. Ce modèle se compose de couches organisées (basale, épineuse et granuleuse), ainsi que d’un stratum corneum multicouche contenant des couches lipidiques lamellaires intercellulaires représentant les principales classes de lipides, similaires à celles que l’on observe in vivo.
13. L’irritation cutanée consécutive à l’application d’un produit chimique, qui se manifeste principalement par des érythèmes ou des œdèmes, résulte d’une cascade d’évènements débutant par la pénétration du produit chimique à travers le stratum corneum où il peut causer la lésion des couches sous-jacentes de kératinocytes et les autres cellules de la peau. En mourant, les cellules lésées peuvent soit rejeter des médiateurs de l’inflammation ou induire la cascade inflammatoire qui agit aussi sur les cellules du derme, en particulier les cellules stromales et endothéliales des vaisseaux sanguins. C’est la dilatation et la perméabilité accrue des cellules endothéliales qui sont responsables des érythèmes et des œdèmes observés (29). Il faut noter que les méthodes d’essai fondées sur l’utilisation d’épiderme humain reconstitué permettent de mesurer les événements déclencheurs de la cascade, p.ex. les lésions cellulaires et tissulaires (16) (17), en l’absence de toute vascularisation du système d’essai in vitro, grâce à la lecture de la viabilité cellulaire.
14. La viabilité cellulaire des modèles d’épiderme humain reconstitué est mesurée via la conversion enzymatique du colorant vital MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, numéro CAS 298-93-1] en un sel de formazan bleu mesuré quantitativement après son extraction des tissus (31). Les produits chimiques irritants sont mis en évidence par leur capacité à faire chuter la viabilité cellulaire sous un seuil prédéterminé (≤ 50 %, pour la catégorie 2 du SGH de l’ONU/du règlement CLP). En fonction du cadre législatif et de l’applicabilité de la présente méthode d’essai, les produits chimiques d’essai produisant une viabilité cellulaire supérieure au seuil défini peuvent être considérés comme non irritants (> 50 %, sans catégorie).
DEMONSTRATION DES COMPÉTENCES
15. Avant d’appliquer en routine l’un des quatre modèles d’essai validés conformément à la présente méthode d’essai (appendice 2), les laboratoires font la preuve de leur compétence technique en utilisant les 10 substances énumérées au tableau 1. Dans le cas où une substance figurant dans le tableau 1 serait indisponible, où dans d’autres cas où il est justifié de la remplacer par une autre substance (par exemple à partir de la liste de substances de référence (8)), cette autre substance peut être utilisée si des données de référence appropriées in vivo et in vitro sont disponibles, et dans la mesure où les mêmes critères de sélection que ceux décrits sous le tableau 1 sont utilisés. L’utilisation d’une substance d’épreuve de compétence autre que celles énumérées au tableau 1 doit être justifiée.
16. Dans le cadre de la démonstration des compétences, il est recommandé aux utilisateurs de contrôler les propriétés de barrière des tissus dès réception, comme précisé par le producteur du modèle d’épiderme humain reconstitué. Cette étape est particulièrement importante lorsque les tissus sont transportés sur de longues distances/durées. Lorsqu’une méthode d’essai a été établie avec succès, et que le laboratoire a acquis et démontré sa maîtrise de cette méthode, il ne sera plus nécessaire de procéder systématiquement à cette vérification. Toutefois, pour les méthodes d’essai utilisées en routine, il est recommandé de continuer à évaluer les propriétés de barrière des tissus à intervalles réguliers.
Tableau 1
Substances utilisées pour les épreuves de compétence
| Substance | Numéro CAS | Score in vivo | État physique | Catégorie du SGH de l’ONU
SUBSTANCES NON CLASSÉES (Sans catégorie dans le SGH de l’ONU)
| Acide naphtylacétique | 86-87-3 | 0 | Solide | sans catégorie
| isopropanol | 67-63-0 | 0,3 | liquide | sans catégorie
| stéarate de méthyle | 112-61-8 | 1 | solide | sans catégorie
| butyrate d’heptyle | 5870-93-9 | 1,7 | liquide | sans catégorie (cat. 3 facultative)
| salicylate d’hexyle | 6259-76-3 | 2 | liquide | sans catégorie (cat. 3 facultative)
SUBSTANCES CLASSÉES (Catégorie 2 du SGH de l’ONU)
| 3-p-cuményl-2-méthylpropionaldéhyde | 103-95-7 | 2,3 | liquide | catégorie 2
| 1-bromohexane | 111-25-1 | 2,7 | liquide | catégorie 2
| hydroxyde de potassium (solution aqueuse à 5 %) | 1310-58-3 | 3 | liquide | catégorie 2
| 1-méthyl-3-phényl-1-pipérazine | 5271-27-2 | 3,3 | solide | catégorie 2
| heptanal | 111-71-7 | 3,4 | liquide | catégorie 2
PROTOCOLE
17. Les éléments et le protocole d’une méthode d’essai d’irritation cutanée sur épiderme humain reconstitué sont décrits ci-après (voir aussi l’annexe 3 concernant les paramètres liés à chaque modèle d’essai). Il existe des modes opératoires normalisés pour les quatre modèles d’essai contenus dans la méthode d’essai (32) (33) (34) (35).
ÉLÉMENTS DE LA MÉTHODE D’ESSAI SUR ÉPIDERME HUMAIN RECONSTITUÉ
Conditions générales
18. L’épiderme est reconstruit à partir de kératinocytes humains non transformés. Plusieurs couches de cellules épithéliales viables (couche basale, stratum spinosum, stratum granulosum) doivent être présentes sous un stratum corneum fonctionnel. Le stratum corneum doit comporter plusieurs couches présentant le profil lipidique nécessaire pour constituer une barrière fonctionnelle suffisamment robuste pour résister à la pénétration rapide de substances cytotoxiques de référence telles que le dodécylsulfate de sodium (SDS) ou le Triton X-100. La fonction de barrière est démontrée et peut être évaluée soit en déterminant la concentration à laquelle une substance de référence réduit la viabilité des tissus de 50 % (CI50) après un temps d’exposition donné, soit en définissant le temps d’exposition requis pour réduire la viabilité des cellules de 50 % (TE50) après application de la substance de référence à une concentration fixe déterminée. Le modèle d’épiderme humain reconstitué présente des propriétés de confinement suffisantes pour éviter que de la matière puisse contourner le stratum corneum pour atteindre les tissus viables, ce qui nuirait à la qualité de la modélisation de l’exposition cutanée. Enfin, le modèle est exempt de toute contamination bactérienne, virale, mycoplasmique ou mycosique.
Conditions fonctionnelles
Viabilité
19. L’essai utilisé pour quantifier la viabilité est l’essai MTT (31). Les cellules viables de l’épiderme humain reconstruit peuvent réduire le colorant vital MTT en un précipité bleu de MTT formazan qui est alors extrait des tissus au moyen de l’isopropanol (ou un solvant similaire). La densité optique du solvant d’extraction seul doit être suffisamment faible, c’est-à-dire inférieur à 0,1. Le MTT formazan extrait peut être quantifié soit par la mesure de l’absorbance standard (DO) ou par une procédure de spectrophotométrie HPLC-UPLC (36). Les utilisateurs du modèle d’épiderme humain reconstitué font en sorte que chaque lot utilisé réponde aux critères définis pour le témoin négatif (TN). Une plage d’acceptabilité (valeurs limites inférieure et supérieure) pour le témoin négatif (dans les conditions de la méthode d’essai d’irritation cutanée) est établie par le développeur/fournisseur du modèle d’épiderme humain reconstitué. Les plages d’acceptabilité pour les quatre modèles validés comprises dans cette méthode d’essai sont indiquées dans le tableau 2. L’utilisateur de spectrophotométrie HPLC-UPLC utilisera la gamme de DO du témoin négatif fournie au tableau 2 comme critère pour le contrôle négatif. Il doit être prouvé que les tissus traités par le témoin négatif sont stables en culture (c’est-à-dire qu’ils présentent des mesures de viabilité comparables) tout au long de la période d’exposition.
Tableau 2
Plages d’acceptabilité des valeurs de DO du témoin négatif des modèles d’essai de cette MRV
| | Valeur limite inférieure d’acceptation | Valeur limite supérieure d’acceptation
| EpiSkin™ (SM) | ≥ 0,6 | ≤ 1,5
| EpiDerm™ SIT (EPI-200) | ≥ 0,8 | ≤ 2,8
| SkinEthic™ RHE | ≥ 0,8 | ≤ 3,0
| LabCyte EPI-MODEL24 SIT | ≥ 0,7 | ≤ 2,5
Fonction de barrière
20. Le stratum corneum et sa composition lipidique doivent être suffisants pour résister à la pénétration rapide de substances cytotoxiques de référence telles que le SDS ou le Triton X-100. Cette capacité est évaluée par la CI50 et le TE50 (tableau 3).
Morphologie
21. L’examen histologique du modèle d’épiderme humain reconstitué doit mettre en évidence une structure semblable à celle de l’épiderme humain (comprenant notamment un stratum corneum multicouche).
Reproducibilité
22. La reproductibilité dans le temps des résultats obtenus à l’aide des témoins positifs et négatifs doit être démontrée.
Contrôle de qualité
23. Il est impératif que le développeur/fournisseur du modèle d’épiderme humain reconstitué garantisse et démontre que chaque lot utilisé répond à des critères de fabrication définis, dont les plus pertinents sont ceux relatifs à la viabilité (paragraphe 19), à la fonction de barrière (paragraphe 20) et à la morphologie (paragraphe 21). Ces informations sont communiquées aux utilisateurs, afin qu’ils puissent les inclure dans le rapport d’essai. Une plage d’acceptabilité (valeurs limites inférieure et supérieure) pour les valeurs CI50 ou TE50 est établie par le développeur/fournisseur d’épiderme humain. Seuls les résultats obtenus à l’aide de tissus répondant à ces critères pourront être retenus pour prédire de façon fiable les effets irritants des produits chimiques d’essai. Les plages d’acceptabilité pour les quatre modèles d’essai inclus dans la présente méthode d’essai sont indiquées dans le tableau 3.
Tableau 3
Critères de contrôle de qualité des lots pour les modèles d’essai inclus dans la présente méthode d’essai
| | Valeur limite inférieure d’acceptation | Valeur limite supérieure d’acceptation
|
EpiSkin™ (SM)
(18 hours treatment with SDS) (32)
| IC50 = 1,0 mg/ml | IC50 = 3,0 mg/ml
|
EpiDerm™ SIT (EPI-200)
(1 % Triton X-100) (33)
| ET50 = 4,0 hr | ET50 = 8,7 hr
|
SkinEthic™ RHE
(1 % Triton X-100) (34)
| ET50 = 4,0 hr | ET50 = 10,0 hr
|
LabCyte EPI-MODEL24 SIT
(18 hours treatment with SDS) (35)
| IC50 = 1,4 mg/ml | IC50 = 4,0 mg/ml
Application des produits chimiques d’essai et des produits chimiques témoins
24. Il convient d’utiliser au minimum trois réplicats par essai pour chaque produit chimique d’essai et pour les témoins. Pour les produits chimiques liquides comme pour les produits chimiques solides, il convient d’appliquer une quantité suffisante de produit chimique pour recouvrir uniformément la surface de la peau, sans pour autant utiliser une dose infinie, c’est à dire dans une gamme de 26 à 83 μL/cm2 ou mg/cm2(voir l’appendice 3). Dans le cas de produits chimiques solides, il convient d’humidifier la surface de l’épiderme avec de l’eau déionisée ou distillée avant application, afin d’assurer un bon contact entre la substance d’essai et la surface de l’épiderme. Chaque fois que possible, il convient de tester les solides sous la forme d’une poudre fine. Un filet en nylon peut être utilisé pour aider l’étalement de la poudre en couche fine si nécessaire (voir appendice 3). À la fin de la période d’exposition, la surface de l’épiderme est nettoyée avec soin à l’aide d’un tampon aqueux ou de NaCl à 0,9 %, afin d’éliminer le produit chimique d’essai. En fonction de la méthode sur épiderme humain reconstitué utilisée, la période d’exposition peut s’étendre de entre 15 à 60 minutes et la température d’incubation entre 20 et 37 °C. Les durées et températures d’exposition sont optimisées pour chacun des modèles d’essai sur épiderme humain reconstitué, et tiennent compte des propriétés intrinsèques de chaque modèle (p. ex. la fonction de barrière) (voir appendice 3).
25. Des témoins négatifs (TN) et positifs (TP) sont utilisés simultanément pour chaque étude afin de démontrer que la viabilité (dans le cas du TN), la fonction de barrière et la sensibilité tissulaire qui en résulte (dans le cas du TP) se situent dans une fourchette historique définie de valeurs acceptables. La substance recommandée en tant que TP est une solution aqueuse de SDS à 5 %. Pour les TN, il est recommandé d’utiliser de l’eau ou une solution saline tamponnée au phosphate [phosphate buffered saline (PBS)].
Mesures de la viabilité cellulaire
26. Selon le protocole, il est essentiel que mesures de la viabilité ne soient pas réalisées immédiatement après l’exposition au produit chimique d’essai, mais après une période d’incubation post-traitement suffisamment longue du tissu rincé dans un milieu frais. Cette période permet aussi bien la disparition des effets faiblement cytotoxiques que l’apparition d’effets cytotoxiques manifestes. Une période d’incubation post-traitement de 42 heures s’est révélée optimale au cours de l’optimisation de deux des modèles d’essai basés sur l’épiderme humain reconstitué sous-tendant cette méthode d’essai (11)(12)(13)(14)(15).
27. Le test du MTT est une méthode quantitative standardisée, recommandée pour mesurer la viabilité cellulaire dans le cadre de cette méthode d’essai. Elle est compatible avec une utilisation sur un modèle tissulaire tridimensionnel. L’échantillon de tissu est placé dans une solution MTT à la concentration appropriée (par exemple, 0,3-1 mg/ml) pendant 3 heures. Le MTT est converti en bleu de formazan par les cellules viables. Le précipité bleu de formazan est ensuite extrait à l’aide d’un solvant (ex.: isopropanol, isopropanol acide), et l’on mesure la concentration du formazan en déterminant sa DO à 570 nm à l’aide d’un filtre passe-bande de ±30 nm au maximum, ou en utilisant une procédure de spectrophotométrie HPLC-UPLC (voir paragraph 34) (36).
28. Les propriétés optiques du produit chimique d’essai ou son action chimique sur le MTT (p. ex. les produits chimiques peuvent aussi bien inhiber ou faire disparaître la coloration que la provoquer) sont susceptibles d’interférer avec l’expérience et de conduire à une estimation erronée de la viabilité. Cela peut se produire lorsque le produit chimique d’essai n’a pas été totalement éliminé du tissu par rinçage ou lorsqu’il a pénétré dans l’épiderme. Si un produit chimique agit directement sur le MTT (p. ex. un agent réducteur du MTT), est naturellement coloré, ou s’il se colore durant le traitement du tissu, des contrôles supplémentaires sont pratiqués pour détecter et corriger les interférences du produit chimique avec la mesure de la viabilité (voir paragraphes 29 et 33). On trouvera une description détaillée de la manière de corriger la réduction directe du MTT ou les interférences dues aux agents colorants dans le mode opératoire normalisé des quatre modèles d’essai validés contenus dans cette méthode d’essai (32) (33) (34) (35).
29. Afin d’identifier les agents réducteurs directs du MTT, il convient d’ajouter chaque produit chimique d’essai à un milieu MTT fraîchement préparé. Si le mélange de MTT et de produit chimique d’essai (ou la suspension testée pour les produits chimiques d’essai insolubles) devient bleu/violet, on considère que le produit chimique d’essai est un réducteur direct du MTT et il convient alors de procéder à des vérifications fonctionnelles supplémentaires sur les modèles d’épiderme humain reconstruit non viables, indépendamment du choix de mesurer l’absorbance (OD) ou de procéder par analyse par HPLC/UPLC-spectrophotométrie. Cette vérification s’effectue sur des tissus tués qui ne présentent qu’une activité métabolique résiduelle, mais absorbent et retiennent le produit chimique d’essai dans des proportions similaires aux tissus viables. Chaque produit chimique réducteur du MTT est appliqué sur au moins deux réplicats de tissus tués qui sont soumis à la procédure d’essai complète pour générer un témoin de réduction non spécifique du MTT (NSMTT) (32) (33) (34) (35). Un seul témoin MTT NS par produit chimique d’essai suffit, indépendamment du nombre d’épreuves indépendantes menées. La viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: le pourcentage de viabilité tissulaire obtenu pour les tissus vivants exposés au réducteur du MTT (%viabilitétest) moins le pourcentage de réduction non spécifique du MTT obtenu pour les tissus tués exposés au même réducteur du MTT et calculé en proportion du témoin négatif testé en parallèle de l’essai à corriger (%MTT NS), soit Viabilité tissulaire réelle = [%viabilitétest] - [%MTT NS].
30. Pour repérer les interférences potentielles par des produits chimiques d’essai colorés ou qui deviennent colorés en contact avec l’eau ou l’isopropanol, et pour déterminer si des témoins supplémentaires sont nécessaires, une analyse de spectre est menée sur les produits chimiques dans l’eau (environnement au moment de l’exposition) et/ou dans l’isopropanol (solvant d’extraction). Si le produit chimique d’essai dans l’eau et/ou dans l’isopropanol absorbe assez la lumière à une longueur d’onde de 570±30 nm, alors on considère que le produit chimique d’essai interfère avec la mesure de l’absorbance (DO) du formazan et des témoins colorés doivent être préparés, ou bien une procédure d’analyse par HPLC/UPLC-spectrophotométrie est employée et aucun témoin supplémentaire n’est nécessaire (voir paragraphes 33 et 34). Lorsque les mesures d’absorbance (DO) sont effectuées, chaque produit chimique d’essai causant une interférence est appliqué sur au moins deux réplicats de tissus viables, et les deux réplicats sont soumis à la procédure d’essai complète, à la seule différence qu’ils sont incubés dans le milieu plutôt que dans la solution MTT lors de l’étape de l’incubation avec MTT, afin de générer un témoin de couleur non spécifique dans les tissus vivants (Tvivants NS). Le témoin Tvivants NS est testé en parallèle de l’essai avec le produit chimique d’essai coloré et, dans le cas d’un essai multiple, un témoin Tvivants NS indépendant est effectué pour chaque essai (dans chaque épreuve) pour tenir compte de la variabilité biologique inhérente aux tissus vivants. La viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: le pourcentage de viabilité tissulaire obtenu pour les tissus vivants exposés au produit chimique causant une interférence et incubés avec la solution MTT (%viabilitétest) moins le pourcentage de couleur non spécifique obtenu pour les tissus vivants exposés au produit chimique causant une interférence et incubés dans du milieu sans MTT en parallèle de l’essai à corriger (%Tvivants NS), soit Viabilité tissulaire réelle = [%viabilitétest] – [%Tvivants NS].
31. Dans le cas des produits chimiques identifiés comme causant à la fois une réduction directe du MTT (voir paragraphe 29) et une interférence de couleurs (voir paragraphe 30), une troisième série de témoins est nécessaire lors de la mesure de l’absorbance (DO), en plus des témoins MTT NS et Tvivants NS décrits aux paragraphes précédents. En général, ce cas se présente pour les produits chimiques d’essai foncés (bleus, violets, noirs, par exemple), car leur couleur intrinsèque empêche l’évaluation de leur potentiel de réduction directe du MTT décrite au paragraphe 29. Cela rend la réalisation des témoins MTT NS et Tvivants NS obligatoires par principe. Les produits chimiques d’essai nécessitant la réalisation des deux témoins NSMTT et CNSvivants sont susceptibles d’être absorbés et retenus à la fois par les tissus vivants et par les tissus tués. Par conséquent et dans ce cas, l’utilisation du témoin NSMTT peut permettre de corriger l’essai non seulement en fonction du potentiel de réduction directe du MTT du produit chimique d’essai, mais aussi de l’interférence de couleurs dueà l’absorption et la rétention du produit chimique d’essai par les tissus tués. Cela signifie qu’une double correction pour tenir compte de l’interférence de couleurs peut devoir être effectuée, étant donné que le témoin Tvivants NS permet déjà de tenir compte de l’interférence de couleurs due à l’absorption et à la rétention du produit chimique d’essai par les tissus vivants. Afin d’éviter cette double correction pour tenir compte de l’interférence de couleurs, un troisième témoin pour la couleur non spécifique dans les tissus tués (Tmorts NS) doit être préparé. Dans ce témoin supplémentaire, le produit chimique d’essai est appliqué sur au moins deux réplicats de tissus tués qui sont soumis à la procédure d’essai complète mais qui sont incubés dans le milieu plutôt que dans la solution MTT lors de l’étape d’incubation avec MTT. Un seul témoin Tmorts NS par produit chimique d’essai suffit, indépendamment du nombre d’épreuves, mais il doit être mené en parallèle du témoin NSMTT et sur le même lot de tissus. La viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: le pourcentage de viabilité tissulaire obtenu pour les tissus vivants exposés au produit chimique d’essai (%viabilitétest) moins %NSMTT moins % Tvivants NS plus le pourcentage de couleur non spécifique obtenu pour les tissus tués exposés au produit chimique d’essai causant une interférence et incubés dans du milieu sans MTT, calculé en proportion du témoin négatif mené en parallèle de l’essai à corriger (%Tmorts NS), soit Viabilité tissulaire réelle = [%viabilitétest] - [%MTT NS] - [%Tvivants NS] + [%Tmorts NS].
32. Il importe de noter qu’une réduction non spécifique du MTT et des interférences de couleurs non spécifiques peuvent porter l’absorbance (DO) de l’extrait tissulaire au-dessus de la plage de linéarité du spectrophotomètre (lors des mesures de densité optique), et qu’une réduction non spécifique du MTT peut aussi élargir la surface de pic de formazan de l’extrait tissulaire au-delà de la plage de linéarité du spectrophotomètre (lors des mesures par HLCP/UPLC-spectrophotométrie). Il est donc important que chaque laboratoire détermine la plage de linéarité de son spectrophotomètre (pour la DO/surface de pic), par exemple à l’aide de formazan (CAS # 57360-69-7), disponible dans le commerce auprès de l’entreprise Sigma-Aldrich (Cat# M2003), avant de tester les produits chimiques à des fins réglementaires. Les mesures d’absorbance standard (DO) au moyen d’un spectrophotomètre sont pertinentes pour évaluer les réducteurs directs du MTT et les produits chimiques d’essai colorés quand la DO des extraits de tissus traités par le produit chimique d’essai sans correction pour la réduction directe du MTT et/ou pour les interférences de couleur sont dans la plage de linéarité du spectrophotomètre ou quand le pourcentage de viabilité non-corrigée obtenu avec le produit chimique d’essai est ≤ 50 %. Néanmoins, les résultats pour les produits chimiques d’essai indiquant % MTT NS et/ou Tvivants NS ≥ 50 % du témoin négatif doivent être interprétés avec précaution car ce seuil représente la limite utilisée pour différencier les produits chimiques classés des non-classés (voir paragraphe 36).
33. Pour les produits chimiques d’essai colorés qui ne sont pas compatibles avec la mesure de l’absorbance standard (DO) à cause de leur forte interférence avec l’essai de MTT, peuvent être évalués par une procédure de HPLC/UPLC-spectrophotométrie (voir paragraphe 34) (36). Le système HPLC/UPLC permet de séparer le formazan du produit chimique avant la quantification (36). Pour cette raison, les témoins Tvivants NS et Tmorts NS ne sont pas nécessaires pour la procédure HPLC/UPLC-spectrophotométrie, quel que soit le produit chimique d’essai. Les témoins MTT NS sont néanmoins nécessaires si l’on s’attend à ce que le produit chimique d’essai soit un réducteur direct du MTT, ou que la couleur empêche l’évaluation de leur potentiel de réduction directe du MTT (en suivant la procédure décrite au paragraphe 29). Lorsqu’une procédure par CLHP/CLUP-spectrophotométrie est employée pour quantifier le formazan, la viabilité tissulaire est calculée en pourcentage par comparaison de la surface de pic de formazan obtenue avec des tissus vivants exposés au produit chimique d’essai avec la surface de pic de formazan obtenue avec le témoin négatif parallèle. Pour les produits chimiques d’essai réducteurs directs du MTT, la viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: %viabilitétest moins %MTT NS. Pour finir, il convient de noter que les réducteurs directs du MTT ou les réducteurs directs du MTT causant aussi une interférence de couleurs, qui sont retenus dans les tissus après le traitement et dont la capacité de réduction du MTT est telle qu’elle conduit à des DO (pour la mesure de DO) ou à des surfaces de pic (pour la procédure CLHP/CLUP-spectrophotométrie) des extraits tissulaires testés situées en-dehors de la plage de linéarité du spectrophotomètre, ne peuvent pas être évalués; ce cas ne se présente a priori que très rarement.
34. La procédure par HPLC/UPLC-spectrophotométrie est utilisable pour mesurer le formazan pour tous les types de produits chimiques (colorés ou non, réducteurs ou non réducteurs du MTT) (36). Étant donné la diversité des équipements de HPLC/UPLC -spectrophotométrie, tous les utilisateurs ne pourront pas reproduire des conditions d’équipement identiques. Pour cette raison, preuve doit être faite de l’efficacité de l’équipement de HPLC/UPLC -spectrophotométrie avant que celui-ci ne soit utilisé pour quantifier le formazan des extraits tissulaires, en remplissant les critères d’acceptabilité pour un ensemble de paramètres normalisés de qualification inspirés des paramètres décrits dans les recommandations à l’industrie de la Food and Drug Administration des États-Unis sur la validation des méthodes de bio-analyse (36)(37). Ces paramètres fondamentaux et leurs critères d’acceptation sont fournis à l’appendice 4. Une fois que les critères d’acceptabilité définis à l’appendice 4 ont été remplis, l’équipement de HPLC/UPLC -spectrophotométrie est considéré comme ayant fait la preuve de son efficacité et prêt pour les mesures du formazan dans les conditions expérimentales décrites dans la présente méthode d’essai.
Critères d’acceptabilité
35. Pour chaque méthode d’essai faisant appel à des lots valables d’épiderme humain reconstitué (voir paragraphe 23), les tissus traités par le témoin négatif (TN) présentent une DO rendant compte de la qualité des tissus ayant été soumis à toutes les étapes d’expédition et de réception ainsi qu’à l’intégralité du protocole. Les valeurs de DO des témoins ne sont pas inférieures aux limites historiques. De la même façon, les résultats obtenus pour les tissus traités par le témoin positif (TP), c’est-à-dire la solution aqueuse de SDS à 5 %, rendent compte de leur capacité à réagir à un produit chimique irritant dans les conditions de la méthode d’essai (voir appendice 3 et pour plus d’information les modes opératoires standardisés des quatre modèles d’essai contenus dans cette méthode d’essai (32) (33) (34) (35). Les mesures associées et appropriées de la variabilité entre les réplicats de tissu (c’est-à-dire les écarts-types doivent normalement se situer dans les limites d’acceptation établies pour le modèle d’essai considére (voir appendice 3).
Interprétation des résultats et modèle prédictif
36. La valeur de DO obtenue pour chaque produit chimique d’essai peut être utilisée pour calculer le pourcentage de viabilité cellulaire normalisé par rapport au témoin négatif, lequel correspond à une viabilité cellulaire arbitrairement fixée à 100 %. En cas d’utilisation de la procédure de spectrophotométrie HPLC-UPLC, la viabilité cellulaire calculée est le pourcentage de pic de MTT formazan obtenu avec les tissus vivants traités par le produit chimique d’essai par rapport au pic de MTT formazan obtenu avec le témoin négatif testé simultanément. La valeur seuil du pourcentage de viabilité cellulaire, qui établit la distinction entre les produits chimiques irritants et les produits chimiques non classés, de même que les procédures statistiques utilisées pour évaluer les résultats et identifier les produits chimiques irritants, sont clairement définies et étayées par des données. Il conviendra par ailleurs de démontrer leur pertinence (voir les modes opératoires standardisés des modèles d’essai pour information). Les valeurs seuils permettant de prédire les effets irritants sont indiquées ci-dessous:
— Le produit chimique d’essai est identifié comme nécessitant classification et étiquetage selon le SGH de l’ONU/CLP (catégorie 1 ou catégorie 2) si le pourcentage moyen de viabilité du tissu après exposition et incubation post-traitement est inférieur ou égal (≤) à 50 %. Puisque les modèles d’essai sur épiderme humain reconstitué compris dans cette méthode d’essai ne sont pas en mesure de différencier les catégories 1 et 2 du SGH de l’ONU/CLP, de plus amples informations sur le potentiel de corrosion de la peau seront requises pour décider sur la classification finale [voir aussi le Document guide IATA (3)]. Dans le cas où le produit chimique d’essai est identifié comme non-corrosif (par exemple sur la méthode d’essai B.40, B.40 bis ou B.65), et montre une viabilité cellulaire après traitement, et que l’incubation post-traitement est inférieure ou égale à 50 %, le produit chimique d’essai est considéré comme irritant pour la peau, conformément avec la catégorie 2 du SGH de l’ONU/CLP.
— Selon la réglementation des pays membres, le produit chimique peut-être considéré comme non irritant pour la peau conformément à l’absence de catégorie du SGH de l’ONU/CLP si la viabilité du tissu après exposition et incubation post-traitement est supérieure (>) à 50 %.
RÉSULTATS ET RAPPORT
Résultats
37. Pour chaque essai, il convient de présenter, sous forme de tableau, les résultats obtenus pour chaque réplicat de tissu (par exemple, les valeurs de DO et le pourcentage de viabilité cellulaire calculé pour chaque produit chimique d’essai, ainsi que la classification correspondante), y compris les données obtenues, le cas échéant, en reproduisant les expériences. Il conviendra en outre de préciser les valeurs moyennes ± écart-type correspondant à chaque essai. Les interactions observées avec le réactif MTT et les produits chimiques d’essai colorés seront signalées pour chaque produit chimique d’essai.
Rapport dessai
38. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Produits chimiques d’essai et produits chimiques témoins:
— substance mono-constituant: Identification chimique: désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro(s) CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale et/ou autres identifiants, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent;
— substance multi-constituants, UVCB ou mélange: Caractérisation, dans la mesure du possible, par exemple par l’identité chimique (voir ci-dessus), la pureté, les caractéristiques quantitatives et les propriétés physico-chimiques pertinentes (voir ci-dessus) des constituants, selon les données disponibles;
— apparence physique, hydrosolubilité, solubilité dans le DMSO et autres propriétés physico-chimiques pertinentes, selon les données disponibles;
— source et numéro de lot si disponible;
— traitement du produit chimique d’essai ou du produit chimique témoin avant la conduite de l’essai, s’il y a lieu (par exemple chauffage, broyage);
— stabilité du produit chimique d’essai, date de péremption, ou date de vérification analytique si disponible;
— conditions de stockage et stabilité, selon les données disponibles.
Modèle d’épiderme humain reconstitué et protocole utilisés; justification de ce choix (le cas échéant)
Conditions de l’essai:
— modèle d’épiderme humain reconstitué utilisé (y compris numéro de lot);
— informations d’étalonnage de l’appareil de mesure (par exemple spectrophotomètre), longueur d’onde et passe-bande (s’il y a lieu) utilisés pour quantifier le MTT formazan, et la plage de linéarité de cet appareil de mesure;
— description de la méthode utilisée pour quantifier le MTT formazan;
— description des spécifications du système de spectrophotométrie HPLC/UPLC, s’il y a lieu;
— informations complètes sur le modèle spécifique d’épiderme humain reconstitué utilisé, et notamment sur ses performances, à savoir (liste non limitative);
i) viabilité;
ii) function de barrière;
iii) morphologie;
iv) reproducibilité et capacité prédictive;
v) contrôles de qualité (CQ) du modèle;
— références des données historiques du modèle utilisé, à savoir (liste non limitative) l’acceptabilité des données de contrôle de qualité faisant référence aux données historiques du lot.
— démonstration de la compétence à exécuter la méthode d’essai, avant une utilisation régulière, au moyen des substances d’épreuve de compétence.
Protocole de l’essai:
— description détaillée des procédures appliquées, y compris les procédures de lavage utilisées après la période d’exposition
— doses de produit chimique d’essai et des produits chimiques témoins;
— durée de la ou des périodes d’exposition et température(s) d’exposition;
— indication des témoins utilisés pour les agents réducteurs directs du MTT et/ou les produits chimiques colorés, s’il y a lieu;
— nombre de réplicats de tissus utilisés par produit chimique d’essai et produit chimique témoin [témoin positif, témoin négatif et, le cas échéant, réduction non spécifique du MTT et coloration non spécifique, témoin vivant non spécifique (Tvivant NS), témoin mort non spécifique (Tmort NS)], par temps d’exposition;
— description des critères de décision/du modèle prédictif appliqués en fonction du modèle d’épiderme humain reconstitué utilisé;
— description de toute modificatin apportée au protocole d’essai (y compris aux procédures de lavage).
Critères d’acceptabilité de l’épreuve et de l’essai:
— valeur moyenne des témoins positifs et négatifs et plage d’acceptabilité par rapports aux données historiques;
— variabilité acceptable entre les réplicats de tissus pour les témoins positifs et négatifs;
variabilité acceptable entre les réplicats de tissus pour le produit chimique d’essai.
— Résultats:
— présentation des résultats sous forme de tableau, pour chaque produit chimique d’essai et produit chimique témoin, chaque période d’exposition, chaque épreuve et chaque mesure de réplicat, y compris la densité optique ou le pic de MTT formazan, le pourcentage de viabilité cellulaire, le pourcentage moyen de viabilité cellulaire, les différences entre les réplicats, l’erreur standard et/ou le coefficient de variation s’il y a lieu;
— S’il y a lieu, les résultats des témoins utilisés pour les agents réducteurs directs du MTT et/ou les produits chimiques d’essai colorants, y compris la densité optique ou le pic de MTT formazan, % MTT NS, % Tvivant NS, %Tmort NS, les différences entre les réplicats de tissus, l’erreur standard et/ou le coefficient de variation s’il y a lieu, et le pourcentage final corrigé de viabilité cellulaire;
— description de tous autres effets observés;
— classification obtenue compte tenu du modèle prédictif/des critères de décision utilisés.
Discussion des résultats
Conclusions
BIBLIOGRAPHIE
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(4) Chapitre B.4 de la présente annexe, Effet irritant/corrosif aigu sur la peau
(5) Chapitre B.40 de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: Essai de résistance électrique transcutanée (RET).
(6) Chapitre B.40 bis de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: Essai sur modèle de peau humaine.
(7) Chapitre B.65 de la présente annexe, Méthode d’essai in vitro sur membrane d’étanchéité pour la corrosion cutanée.
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»
(8) Dans la partie B, les chapitres suivants sont ajoutés:
«B.63 ESSAI DE DÉPISTAGE DE LA TOXICITÉ POUR LA REPRODUCTION ET LE DÉVELOPPEMENT
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 421 (2016) de l’OCDE. Les Lignes directrices de l’OCDE pour les essais de produits chimiques sont régulièrement mises à jour pour tenir compte des progrès scientifiques. La ligne directrice 421 originale a été adoptée en 1995, sur la base d’un protocole pour un «essai préliminaire de dépistage de la toxicité pour la reproduction», examiné lors de deux réunions d’experts, à Londres en 1990 (1) et à Tokyo en 1992 (2).
2. La présente méthode d’essai a été mise à jour en y introduisant des paramètres pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens, suite à une activité prioritaire lancée par l’OCDE en 1998, destinée à réviser les lignes directrices existantes et à en élaborer de nouvelles pour les essais et le dépistage des perturbateurs endocriniens (3). La ligne directrice 407 de l’OCDE (Étude de toxicité orale à dose répétée pendant 28 jours sur les rongeurs, Chapitre B.7 de la présente annexe), par exemple, a été mise à jour en 2008 en y introduisant des paramètres capables de détecter l’activité endocrinienne des produits chimiques d’essai. L’objectif de la mise à jour de la ligne directrice 421 était d’inclure des paramètres pertinents pour l’étude des perturbateurs endocriniens dans des lignes directrices de dépistage au cours desquelles les périodes d’exposition couvrent certaines périodes sensibles du développement (périodes prénatale ou suivant la naissance).
3. Les paramètres pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens qui ont été sélectionnés et ajoutés, font aussi partie de la ligne directrice 443 (Étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération, Chapitre B.56 de la présente annexe); ils ont été introduits dans la ligne directrice 421 sur la base d’une étude de faisabilité étudiant les questions scientifiques et techniques liées à l’inclusion de ces paramètres, ainsi que les ajustements possibles à mettre en œuvre dans la conception de l’essai pour permettre leur inclusion (4).
4. La présente méthode d’essai vise l’obtention d’informations sommaires concernant les effets d’un produit chimique d’essai sur le fonctionnement de la reproduction chez le mâle et la femelle, notamment la fonction gonadique, le comportement lors de l’accouplement, la conception, le développement de l’embryon et la parturition. Elle ne vient pas en remplacement des méthodes d’essai existantes B.31, B.34, B.35 ou B.36.
CONSIDERATIONS PRELIMINAIRES
5. La présente méthode d’essai peut être appliquée en vue d’obtenir une première série d’informations concernant les effets possibles d’une substance sur la reproduction et/ou sur le développement, soit au stade initial d’une évaluation toxicologique soit dans l’évaluation d’une substance particulièrement préoccupante. Elle peut avoir son utilité dans un ensemble d’essais de tri initial de produits chimiques existants pour lesquels les informations toxicologiques sont peu nombreuses ou absentes et peut donner des indications sur l’éventail de doses à utiliser dans des études plus complètes des effets sur la reproduction ou le développement. L’utilisation de cette ligne directrice peut être justifiée dans d’autres cas. Lors de la réalisation de l’étude, il est recommandé de suivre les principes et considérations énoncés dans le document d’orientation no 19 de l’OCDE sur la reconnaissance, l’évaluation et l’utilisation des signes cliniques en tant qu’effets mesurés éthiquement acceptables dans les expérimentations animales menées à des fins d’évaluation de la sécurité (5).
6. Cette méthode d’essai ne permet pas d’obtenir des informations complètes sur tous les aspects de la reproduction et du développement. En particulier, il n’offre qu’un moyen partiel de détecter des manifestations post-natales liées à des expositions prénatales ou des effets éventuellement liés à une exposition post-natale. Étant donné (entre autres raisons) le nombre relativement faible d’animaux dans les groupes, la sélection des effets observés retenue et la brièveté de l’étude, cette méthode ne fournit pas toute l’évidence nécessaire à l’étayage d’une conclusion définitive quant à une absence d’effets. De plus, en l’absence de données tirées d’autres essais de toxicité pour la reproduction et le développement, des résultats positifs sont utiles à une évaluation initiale du danger et permettent de juger de la nécessité de procéder à d’autres essais et de définir le calendrier de ceux-ci.
7. Les résultats obtenus concernant les paramètres endocriniens devraient être interprétés à la lumière du «Cadre conceptuel de l’OCDE pour les essais et l’évaluation des produits chimiques perturbant le système endocrinien» (6). La ligne directrice 421 mise à jour fait partie du niveau 4 de ce cadre conceptuel en tant qu’essai in vivo apportant des données sur les effets adverses affectant les paramètres endocriniens pertinents. Un signal endocrinien ne sera néanmoins pas toujours considéré comme une preuve suffisante en tant que telle que le produit chimique d’essai est un perturbateur endocrinien.
8. Dans la présente méthode d’essai, le produit chimique d’essai est censé être administré par voie orale. Des modifications peuvent s’avérer indispensables si d’autres voies d’administration sont retenues.
9. Avant d’utiliser la méthode d’essai sur un mélange pour générer des données avec pour objectif recherché l’application réglementaire, on considérera si, et si oui pourquoi, elle peut fournir des résultats adéquats dans cet objectif. De telles considérations ne sont pas nécessaires quand les exigences réglementaires stipulent que le mélange doit être testé.
10. Les définitions employées figurent dans l’appendice 1.
PRINCIPE DE L’ESSAI
11. Le produit chimique d’essai est administré à des doses graduées à plusieurs groupes de mâles et de femelles. Les mâles doivent recevoir le produit chimique pendant un minimum de quatre semaines y compris le jour précédant le sacrifice, soit un minimum de deux semaines avant l’accouplement, pendant la période d’accouplement et environ deux semaines après l’accouplement. Compte tenu de la période limitée d’administration chez les mâles avant l’accouplement, la fertilité n’est pas nécessairement un indicateur précis de la toxicité testiculaire. Il faut donc procéder à un examen histologique détaillé des testicules. Compte tenu de la période d’administration de deux semaines préalable à l’accouplement, suivie d’observations concernant l’accouplement et la fertilité, et du fait que la substance est administrée au total pendant au moins quatre semaines suivies par un examen histopathologique détaillé des gonades mâles, on juge que les conditions sont suffisantes pour permettre de détecter la plupart des effets sur la fertilité mâle et la spermatogénèse.
12. Le produit chimique d’essai doit être administré aux femelles tout au long de l’étude. Celle-ci couvre deux semaines préalables à l’accouplement (de manière à englober au moins deux cycles œstraux complets), la durée variable qui précède la conception, la période de gestation et au moins treize jours après la parturition, y compris le jour précédant celui prévu pour le sacrifice.
13. La durée de l’étude, après acclimatation et évaluation du cycle œstral préalable au traitement, dépend du comportement de la femelle et s’étend sur environ 63 jours (14 jours avant l’accouplement, un maximum de 14 jours pour l’accouplement, 22 jours de gestation, 13 jours de lactation).
14. Pendant la période d’administration, les animaux font l’objet d’une observation quotidienne rigoureuse visant à détecter les signes de toxicité. Les animaux qui périssent ou sont sacrifiés au cours de l’essai sont soumis à une autopsie; à la fin de l’essai, les animaux survivants sont sacrifiés et autopsiés.
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Choix des espèces
15. La présente méthode d’essai vise les essais sur le rat. Si les paramètres spécifiés dans la présente méthode d’essai sont examinés chez une autre espèce de rongeur, une justification détaillée sera donnée. Dans le programme international de validation pour la détection des perturbateurs endocriniens de la ligne directrice 407 de l’OCDE (correspondant au chapitre B.7 de la présente annexe), le rat était la seule espèce utilisée. Les souches présentant un faible taux de fécondité ou une fréquence élevée d’anomalies du développement sont à éviter. Il convient d’employer des animaux vierges et sains, sur lesquels aucune expérience n’a été précédemment réalisée. Les animaux soumis à l’essai doivent être caractérisés comme suit: espèce, souche, sexe, poids et âge. Au début de l’étude, les différences de poids entre les animaux utilisés doivent être minimales et ne pas excéder ± 20 % de la moyenne du poids pour chaque sexe. Lorsque l’essai est conduit à titre d’étude préliminaire à une étude de toxicité à long terme ou une étude portant sur une génération complète, il est préférable d’utiliser des animaux issus de la même souche et de la même source dans les deux études.
Conditions d’encagement et d’alimentation
16. Toutes les procédures se conformeront aux normes locales en vigueur en matière de protection des animaux de laboratoire. La température de l’animalerie doit être de 22 °C (+ 3 °C). Idéalement l’humidité relative devrait être comprise entre 50 et 60 %. Elle devrait être au moins égale à 30 % et ne pas dépasser 70 %, sauf lors des opérations de nettoyage du local. Un éclairage artificiel doit être dispensé pour obtenir une photopériode de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. L’alimentation pourra comporter une nourriture classique de laboratoire et de l’eau à satiété. Le choix du régime alimentaire peut être dicté par la nécessité d’assurer un mélange satisfaisant du produit chimique d’essai lorsque celui-ci est administré par le biais de la nourriture.
17. Les animaux sont encagés par petits groupes d’individus de même sexe; on peut encager les animaux individuellement si une nécessité scientifique le justifie. Dans le cas d’un encagement en groupe, le nombre d’animaux par cage ne doit pas dépasser cinq. L’accouplement doit avoir lieu dans des cages prévues à cet effet. Les femelles gravides doivent être placées dans des cages individuelles et disposer de matériaux nécessaires à la confection des nids. Les femelles allaitantes doivent être hébergées séparément avec leur portée.
18. La nourriture sera analysée régulièrement à la recherche de contaminants. Un échantillon de nourriture sera prélevé jusqu’à la finalisation du rapport.
Préparation des animaux
19. De jeunes adultes sains sont répartis au hasard entre les groupes de contrôle et de traitement. Les cages sont disposées de façon à minimiser les effets possibles dus à leur agencement. Les animaux sont marqués individuellement à des fins d’identification et maintenus dans leurs cages pendant cinq jours au moins avant le démarrage de l’étude afin qu’ils s’acclimatent aux conditions du laboratoire.
Préparation des doses
20. Il est recommandé d’administrer le produit chimique d’essai par voie orale sauf si d’autres voies sont jugées plus indiquées. Lorsque l’administration par voie orale est retenue, le produit chimique d’essai est généralement administré par gavage; toutefois, il peut aussi être administré par le biais des aliments ou de l’eau de boisson.
21. Le cas échéant, le produit chimique d’essai est dissout ou mis en suspension dans un véhicule approprié. Il est recommandé, dans la mesure du possible, de recourir en priorité à une solution ou à une suspension aqueuse, en second lieu à une solution dans l’huile (huile de maïs, par exemple), ou à défaut dans d’autres véhicules. Les caractéristiques de toxicité des véhicules, s’ils sont non aqueux, doivent être connues. La stabilité et le caractère homogène du produit chimique d’essai dans le véhicule doivent être déterminés.
MODE OPERATOIRE
Nombre et sexe des animaux
22. Il est recommandé de constituer des groupes d’au moins 10 males et 12-13 femelles. Avant le début de l’exposition, on évaluera les cycles œstraux chez les femelles, et les animaux qui ne présentent pas un cycle classique de 4-5 jours ne seront pas inclus dans l’étude; c’est pourquoi on recommande l’utilisation de femelles supplémentaires, pour parvenir à 10 femelles par groupe. Sauf dans le cas d’effets toxiques marqués, on devrait obtenir au moins 8 femelles gravides par groupe, soit le nombre minimum généralement acceptable. Il s’agit d’aboutir à un nombre suffisant de gestations et à une progéniture suffisamment abondante pour permettre une évaluation fiable de l’action du produit chimique d’essai sur la fertilité, la gravidité, le comportement maternel et l’allaitement, ainsi que sur la croissance et le développement de la descendance F1 à partir de la conception jusqu’au 13ème jour après la parturition.
Détermination des doses
23. En règle générale, on doit disposer d’au moins trois groupes de traitement et d’un groupe témoin. Les niveaux des doses peuvent être déterminés en fonction d’informations tirées d’essais de toxicité aiguë ou de résultats d’études portant sur l’administration de doses répétées. Exception faite de l’administration du produit chimique d’essai, les animaux du groupe témoin doivent être traités de la même manière que ceux des groupes soumis à l’essai. Si un véhicule est utilisé pour administrer le produit chimique d’essai, le groupe témoin doit en recevoir le volume administré le plus élevé.
24. La détermination des niveaux des doses doit prendre en compte toutes les données sur la toxicité et les caractéristiques (toxico-)cinétiques disponibles. Il faut aussi prendre en compte le fait que les femelles gestantes et non-gestantes peuvent présenter des sensibilités différentes. La dose la plus élevée doit être choisie de façon à provoquer des effets toxiques mais sans provoquer la mort ou d’importantes souffrances. Ensuite, il convient de déterminer les doses par ordre décroissant pour mettre en évidence toute relation entre traitement et réponse et, au niveau de la dose la plus faible, l’absence d’effets nocifs observés (CSENO). On considère généralement optimal de définir des intervalles d’un facteur deux à quatre, l’intégration d’un quatrième groupe étant souvent jugé préférable à l’utilisation d’intervalles trop importants (supérieurs à un facteur de 10) entre les niveaux des doses.
25. En cas d’observation d’une toxicité générale (par exemple réduction du poids corporel, effets sur le foie, le cœur, les poumons ou les reins, etc.) ou d’autres modifications susceptibles de ne pas constituer une réponse toxique (par exemple diminution de la prise de nourriture, grossissement du foie), les effets observés sur les paramètres endocriniens devront être interprétés avec précaution.
Épreuve limite
26. Si l’administration orale d’une dose au moins égale à 1 000 mg/kg de poids corporel/jour ou, en cas d’administration par le biais de l’alimentation ou de l’eau, à un pourcentage équivalent dans la nourriture ou dans l’eau (en fonction du poids corporel), selon les modalités précisées pour cette étude, ne provoque aucun effet toxique observable et si aucune toxicité n’est à prévoir compte tenu des données relatives à des substances présentant une structure voisine, on peut juger qu’il n’est pas nécessaire d’entreprendre une étude complète faisant intervenir plusieurs niveaux de doses. Toutefois, l’exposition humaine prévisible peut conduire à retenir un niveau de dose orale plus élevé pour l’essai limite. Pour d’autres types d’administration, tels que l’inhalation et l’absorption par voie cutanée, les propriétés physico-chimiques des produits chimiques d’essai peuvent souvent dicter la concentration maximale qui peut être mise en œuvre.
Administration des doses
27. Le produit chimique d’essai est administré aux animaux chaque jour de la semaine. En cas de gavage, les animaux doivent recevoir une dose unique au moyen d’une sonde stomacale ou d’une canule d’intubation adaptée. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l’animal soumis à l’essai. Il ne doit pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel, sauf s’il s’agit d’une solution aqueuse pour laquelle le volume peut atteindre 2 ml/100 g de poids corporel. Exception faite de produits chimiques d’essai irritants ou corrosifs qui feront normalement apparaître des effets d’autant plus marqués que les concentrations seront élevées, la variabilité du volume d’essai devrait être réduite au minimum grâce à un ajustement de la concentration de sorte que le volume soit constant quel que soit le niveau de la dose.
28. En cas d’administration par le biais de l’alimentation ou de l’eau, il importe de veiller à ce que les quantités de produit chimique d’essai utilisées ne perturbent pas l’équilibre normal de la nutrition ou de l’hydratation. Lorsque le produit chimique d’essai est administré par la nourriture, on peut retenir soit une concentration constante dans les aliments (ppm), soit un niveau de dose constant par rapport au poids du corps de l’animal; l’option retenue doit être précisée. En cas d’administration par gavage, la dose doit être apportée quotidiennement à heures fixes et ajustée au moins une fois par semaine pour être maintenue à un niveau constant par rapport au poids du corps de l’animal.
Calendrier de l’essai
29. L’administration de la substance aux animaux des deux sexes doit commencer au moins deux semaines avant l’accouplement, après une période d’acclimatation d’au moins cinq jours et après avoir observé que les femelles présentaient un cycle œstral normal (au cours d’une période prétraitement de 2 semaines). L’étude doit être programmée de telle sorte que l’accouplement débute peu après que les animaux ont atteint leur pleine maturité sexuelle. Celle-ci intervient à des âges qui varient légèrement selon les espèces et selon les laboratoires, à savoir 10 semaines pour les rats Sprague Dawley et 12 semaines environ pour les rats Wistar. Les femelles ayant mis bas doivent être sacrifiées le 13ème jour qui suit la parturition ou peu après. Le jour de la naissance (où la parturition est achevée) marque le jour 0 de la période post partum. Les femelles qui ne montrent aucun signe de copulation sont sacrifiées 24 à 26 jours après le dernier jour de la période d’accouplement. L’administration de la substance d’essai aux mâles et aux femelles se poursuit durant la période d’accouplement. Au-delà, elle doit continuer pour les mâles, au moins jusqu’à la fin de la période totale d’administration, soit un minimum de 28 jours. Les mâles sont ensuite sacrifiés ou bien maintenus en vie et continuent alors à recevoir la substance d’essai en vue, le cas échéant, d’un second accouplement.
30. L’administration quotidienne du produit chimique d’essai aux femelles de la génération parentale doit continuer pendant toute la gestation et au moins jusqu’au 3ème jour post partum inclus ou jusqu’au jour précédant le sacrifice. En ce qui concerne les études dans lesquelles le produit chimique d’essai est administré par inhalation ou par voie cutanée, l’administration doit se poursuivre au moins jusqu’au 19ème jour inclus de la gestation, et l’administration doit être initiée à nouveau dès que possible et pas après le 4ème jour suivant la naissance.
31. On trouvera une représentation schématique du calendrier d’essai à l’appendice 2.
Modalités d’accouplement
32. On utilise normalement des couples 1:1 (un mâle pour une femelle). Il peut y avoir exception à cette règle si des mâles viennent à mourir. La femelle doit être placée avec le même mâle jusqu’à ce que la copulation soit avérée ou pendant deux semaines. Chaque matin, il convient d’examiner les femelles pour vérifier la présence de sperme ou d’un bouchon vaginal. Le jour 0 de la gestation est celui où l’accouplement est avéré (présence de sperme ou d’un bouchon vaginal). Lorsque le couple s’avère improductif, on peut envisager de ré-accoupler les femelles avec des mâles éprouvés du même groupe.
Taille des portées
33. Au quatrième jour après la naissance, on peut ajuster la taille de chaque portée en éliminant des petits surnuméraires choisis au hasard, afin de s’approcher autant que possible du nombre de quatre ou cinq petits par sexe par portée, en fonction de la taille normale d’une portée dans la souche de rats utilisée. Des échantillons de sang seront prélevés sur deux des animaux surnuméraires, mis en commun, et utilisés pour la détermination des niveaux sériques de T4. Il ne convient pas de procéder à une élimination sélective des petits, par exemple basée sur le poids corporel ou la distance ano-génitale (DAG). Lorsque le nombre de petits mâles et femelles est tel qu’il empêche de disposer de quatre ou cinq animaux de chaque sexe par portée, il est acceptable de procéder à des ajustements partiels (par exemple, six mâles et quatre femelles). Aucun petit ne sera éliminé quand la taille de la portée devient inférieure à la limite d’ajustement de 8 à 10 petits/portée. S’il n’existe qu’un petit surnuméraire au-dessus de la limite d’ajustement, alors ce seul petit surnuméraire sera éliminé et un échantillon de sang prélevé afin de déterminer le niveau sérique de T4.
34. Si la taille des portées n’est pas ajustée, deux petits par portée seront sacrifiés au 4è jour après la naissance et des échantillons de sang seront prélevés pour la mesure des concentrations sériques d’hormones thyroïdiennes. Si possible, les deux petits par portée seront des femelles afin de réserver les males pour l’examen de la persistance du mamelon, exception faite du cas où l’élimination de ces petits ne laisse aucune femelle pour les évaluations terminales. Aucun petit ne sera éliminé quand la taille de la portée devient inférieure à la limite d’ajustement de 8 à 10 petits/portée (en fonction de la taille normale d’une portée chez la souche de rats employée). S’il n’existe qu’un petit surnuméraire au-dessus de la limite d’ajustement, alors ce seul petit surnuméraire sera éliminé et un échantillon de sang prélevé afin de déterminer la concentration sérique de T4.
Observations In vivo
Observations cliniques
35. Tout au long de la période d’essai, chaque animal doit être soumis à des observations cliniques au moins une fois par jour, et plus fréquemment lorsque des signes de toxicité sont observés. Il est préférable de faire ces observations au(x) même(s) moment(s) de la journée en tenant compte des périodes culminantes au cours desquelles les effets attendus se manifestent après administration de la substance. Les changements de comportement dignes d’intérêt, ainsi que les signes de parturition difficile ou prolongée, de même que tous les signes de toxicité, mortalité comprise, doivent être consignés. Il convient de préciser le moment de déclenchement, le degré et la durée des signes de toxicité.
Poids corporel et consommation d’aliments et d’eau
36. Les mâles et les femelles doivent être pesés le premier jour d’administration de la substance d’essai, puis au moins une fois par semaine, ainsi que le dernier jour. Au cours de la gestation, les femelles doivent être pesées les jours 0, 7, 14 et 20, et dans les 24 heures qui suivent la parturition (jour 0 ou 1 post partum), ainsi que les 4ème jour et 13ème jour post partum. Ces observations sont à enregistrer de manière individuelle pour chaque animal adulte.
37. Durant les périodes de pré-accouplement, de gestation et de lactation, la consommation alimentaire doit être mesurée au moins une fois par semaine. Cette mesure est facultative pendant la période d’accouplement. La consommation d’eau doit également être mesurée durant les périodes en question lorsque le produit chimique d’essai est administré par l’eau de boisson.
Cycle œstral
38. Les cycles œstraux sont contrôlés avant le début du traitement pour sélectionner pour l’étude des femelles présentant un cycle régulier (voir paragraphe 22). Les frottis vaginaux sont examinés chaque jour depuis le début du traitement jusqu’à la confirmation de l’accouplement. Si l’on suspecte que des effets liés à un stress aigu lors de l’initiation du traitement pourraient perturber le cycle œstral, les laboratoires peuvent exposer les animaux de l’essai pendant deux semaines, puis effectuer des frottis vaginaux chaque jour pour contrôler le cycle œstral pendant un minimum de deux semaines débutant au début de la période de pré-accouplement et se poursuivant durant la période d’accouplement, jusqu’à ce que l’accouplement soit avéré. Pour obtenir des cellules vaginales ou cervicales, on prendra soin d’éviter d’agresser la muqueuse ce qui risquerait d’induire une pseudo-gestation (7) (8).
Caractéristiques de la descendance
39. La durée de la gestation doit être notée et calculée à partir du jour 0. Il importe d’examiner chaque portée dès que possible après la parturition de manière à déterminer le nombre et le sexe des petits, le nombre de morts-nés, de petits vivants et d’avortons (petits de taille sensiblement inférieure à celle des petits témoins), ainsi que les anomalies évidentes.
40. Dans les 24 heures qui suivent la parturition (jours 0 ou 1 post partum) et au moins aux jours 4 et 13 post partum, il faut compter les petits vivants et déterminer leur sexe et également peser les portées. En plus des observations (décrites au paragraphe 35), il faut consigner tout comportement anormal de la descendance.
41. On mesure la DAG de chaque petit au même jour suivant la naissance, entre les JPN 0 et 4. Le poids corporel des petits est relevé le jour de la mesure de la DAG; la DAG est rapportée à une mesure de la taille du petit, de préférence la racine cubique du poids corporel (9). On devra compter le nombre de mamelons/aréoles chez les petits mâles aux JPN 12 ou 13, comme le document d’orientation 151 de l’OCDE le recommande (10).
Biochimie clinique
42. Des échantillons sanguins sont prélevés sur un site défini selon le schéma suivant:
— chez au moins deux petits par portée au jour 4 après la naissance, si le nombre de petits le permet (voir paragraphes 40-41);
— chez toutes les mères et chez au moins deux petits par portée à la fin de l’expérience au jour 13, et
— chez les adultes mâles à la fin de l’expérience.
Tous ces échantillons sont conservés dans des conditions appropriées. Les échantillons de sang des petits à JPN13 et des adultes mâles font l’objet d’un dosage sérique d’hormones thyroïdiennes (T4). D’autres évaluations de T4 dans les échantillons de sang des mères et des petits à JPN 4 peuvent être réalisées, le cas échéant. De manière optionnelle on pourra mesurer d’autres hormones, le cas échéant. Le sang des petits peut être mis en commun par portée pour l’analyse des hormones thyroïdiennes. Les hormones thyroïdiennes (T4 et TSH) seront de préférence mesurées sous forme «totale».
43. Les facteurs suivants peuvent influencer la variabilité et les concentrations absolues des déterminations hormonales:
— le moment du sacrifice, à cause des variations diurnes des concentrations hormonales,
— la méthode de sacrifice, qui devra éviter un stress inutile chez les animaux pouvant affecter les concentrations en hormones thyroïdiennes,
— les kits d’essai pour les déterminations hormonales, dont les courbes standards peuvent différer d’un kit à l’autre.
44. Les échantillons de plasma spécifiquement destinés à la détermination des hormones doivent être obtenus à des moments de la journée comparables. Les valeurs numériques obtenues lors de l’analyse des concentrations hormonales diffèrent en fonction du kit commercial utilisé.
Pathologie
Autopsie générale
45. Lors du sacrifice ou en cas de mort survenue au cours de l’étude, les animaux adultes doivent faire l’objet d’un examen macroscopique visant à mettre en évidence d’éventuelles anomalies ou modifications pathologiques. On s’intéressera plus particulièrement aux organes de l’appareil reproducteur. Le nombre de sites d’implantation d’embryons doit être consigné. Les frottis vaginaux sont examinés le matin du jour de la nécropsie pour déterminer quelle est la phase du cycle œstral et permettre une corrélation avec l’histopathologie des ovaires.
46. Les testicules et épididymes de même que la prostate et les vésicules séminales avec les glandes de coagulation entières de tous les animaux mâles adultes devront être débarrassés de tout tissu adhérent si nécessaire, et leur poids mesuré aussitôt après la dissection pour éviter toute déshydratation. En outre, il est possible de relever le poids d’autres organes, tels que le complexe des muscles élévateur de l’anus et bulbo-caverneux, les glandes de Cowper et le gland du pénis chez les mâles, et les ovaires et l’utérus (y compris le col) chez les femelles. Le cas échéant, les mesures doivent être effectuées aussitôt que possible après la dissection
47. Les petits morts ainsi que ceux qui sont sacrifiés au 13ème jour post partum, ou peu après, doivent être au moins soumis à un examen externe rigoureux visant à déterminer d’éventuelles anomalies flagrantes. Une attention particulière devra être apportée aux organes génitaux reproducteurs externes, pour lesquels on recherchera des signes de modification de leur développement. Le 13ème jour, il faudra conserver la thyroïde d’un petit mâle et d’un petit femelle par portée.
48. Les ovaires, testicules, organes sexuels secondaires (utérus et glaire cervicale, épididymes, prostate, vésicule séminale plus glande coagulantes), thyroïde, ainsi que l’ensemble des organes présentant des lésions macroscopiques de tous les animaux adultes doivent être conservés. La fixation à la formaline n’est pas recommandée pour l’examen de routine des testicules et épididymes. L’emploi du fixateur de Bouin ou du liquide de Davidson modifié est acceptable pour ces tissus (11). La tunique albuginée peut être perforée en douceur et de façon superficielle aux deux pôles de l’organe avec une aiguille permettant une pénétration rapide du liquide de fixation.
Histopathologie
49. Il convient de procéder à un examen histologique précis des ovaires, testicules et épididymes (en accordant une attention particulière aux étapes de la spermatogénèse et à l’histopathologie de la structure des cellules interstitielles des testicules) chez les animaux du groupe ayant reçu les doses les plus élevées et ceux du groupe témoin. Les autres organes conservés, incluant la thyroïde des petits et des animaux adultes, peuvent être examinés s’il y a lieu. Le poids de la thyroïde peut être déterminé après la fixation. L’élimination des tissus adhérents doit également s’opérer avec beaucoup de soin et seulement après la fixation pour éviter d’abîmer les tissus, et par là de compromettre l’analyse d’histopathologie. L’examen doit s’étendre aux animaux des groupes ayant reçu des doses différentes lorsque des modifications sont observées dans le groupe auquel ont été administrées les doses les plus élevées. Le document d’orientation sur l’histopathologie (11) donne plus de détails sur la dissection, la fixation, la section et l’histopathologie des tissues endocriniens.
RESULTATS ET RAPPORT
Résultats
50. Des données individuelles sont à fournir pour chaque animal. Elles doivent en outre être présentées sous la forme d’un tableau indiquant pour chaque groupe étudié le nombre d’animaux au début de l’essai, le nombre d’animaux morts au cours de l’essai ou euthanasiés, ainsi que le moment de la mort ou de l’euthanasie, le nombre d’animaux fertiles, le nombre de femelles gravides, le nombre d’animaux présentant des signes de toxicité, une description des signes de toxicité observés, comprenant le moment du déclenchement, la durée et la gravité des effets toxiques éventuels, les types de modifications histopathologiques, ainsi que toutes les informations dignes d’intérêt concernant les portées. On trouvera à l’appendice 3 un modèle de rapport succinct sous forme de tableau qui s’avère très utile pour l’évaluation des effets sur la reproduction et le développement.
51. Compte tenu de la portée restreinte de l’étude, l’analyse statistique visant à vérifier le caractère significatif des résultats n’a qu’une valeur limitée pour de nombreux effets observés, notamment les effets sur la reproduction. Si une analyse statistique est réalisée, la méthode retenue doit convenir à la distribution de la variable examinée et doit être arrêtée préalablement à la mise en route de l’étude. S’il y a lieu, l’unité d’analyse sera la portée. L’analyse statistique de la DAG et de persistance du mamelon doit être basée sur les données individuelles des petits, en prenant en compte les effets sur la portée. L’analyse statistique du poids corporel des petits doit être basée sur les données individuelles des petits, en prenant en compte la taille de la portée. Étant donné la petite taille des groupes, il peut être utile de se référer à d’éventuelles données obtenues dans des études antérieures (taille des portées, par exemple) pour faciliter l’interprétation de l’étude.
Évaluation des résultats
52. Les résultats de cette étude sur la toxicité doivent être évalués en fonction des effets observés, de l’autopsie et des données microscopiques. L’évaluation portera notamment sur le lien entre, d’une part, la dose du produit chimique d’essai et, d’autre part, la présence ou l’absence, l’incidence et la gravité des anomalies, y compris les lésions grossières, les organes cibles désignés, l’infertilité, les anomalies cliniques, l’action sur la reproduction et les portées, les modifications du poids corporel, les effets sur la mortalité et tout autre effet toxique.
53. La période de traitement du mâle étant de courte durée, l’histopathologie des testicules et des épididymes doit aller de pair avec les données sur la fertilité dans le cadre de l’évaluation des effets sur la reproduction chez le mâle. L’utilisation des données des témoins historiques pour la reproduction/développement (par exemple pour la taille des portées, DAG, persistance du mamelon, taux sériques de T4), pourrait, le cas échéant, s’avérer être une aide utile pour l’interprétation des données.
54. Pour le contrôle de la qualité, il est proposé que les données des témoins historiques soient collectées et que les coefficients de variation soient calculés dans le cas de données numériques, tout particulièrement pour les paramètres en lien avec la détection de perturbateurs endocriniens. Ces données peuvent être utilisées à des fins de comparaison quand les études sont évaluées.
Rapport
55. Le rapport d’essai doit contenir les informations suivantes:
Produit chimique d’essai:
— source, numéro de lot, date limite d’utilisation si c’est disponible;
— stabilité du produit chimique d’essai, si elle est connue.
Substance mono-constituant:
— apparence physique, hydro-solubilité, autres propriétés physico-chimiques importantes pour la conduite de l’étude;
— identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.
Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:
— caractérisés autant que possible par l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence, la quantité et les propriétés physico-chimiques des constituants.
Véhicule (s’il y a lieu):
— raisons justifiant le choix du véhicule lorsqu’il ne s’agit pas d’eau.
Animaux soumis à l’essai:
— espèce et souche;
— nombre, sexe et âge des animaux;
— origine, conditions d’encagement, type d’alimentation, etc.;
— poids de chaque animal au début de l’essai;
— justification de l’espèce si l’espèce choisie n’est pas le rat.
Conditions de l’essai:
— critères de choix des niveaux de doses;
— précisions concernant la formulation du produit chimique d’essai et de la préparation de l’alimentation, les concentrations obtenues, la stabilité et l’homogénéité de la préparation;
— description détaillée de l’administration du produit chimique d’essai;
— conversion de la concentration du produit chimique d’essai dans la nourriture ou l’eau (ppm) en dose effective (mg/kg de poids corporel/jour), le cas échéant;
— précisions concernant la qualité des aliments et de l’eau;
— description détaillée des protocoles de randomisation utilisés pour sélectionner les petits éliminés de la portée, s’il y a eu élimination.
Results:
— modifications du poids corporel;
— données relatives à la consommation d’aliments et d’eau (si elles sont disponibles);
— données sur les effets toxiques provoqués en fonction du sexe et de la dose, concernant notamment la fertilité, la gestation et tout autre signe de toxicité;
— durée de la gestation;
— effets toxiques ou autres sur la reproduction, la progéniture, la croissance post-natale, etc.;
— nature, gravité et durée des manifestations cliniques observées (réversibles ou non);
— nombre de femelles adultes présentant un cycle œstral normal ou anormal et durée du cycle;
— nombre de petits vivants à la naissance et pertes après implantation;
— données relatives au poids corporel des petits;
— DAG de tous les petits (et poids corporel le jour de la mesure de la DAG);
— persistance du mamelon chez les petits mâles;
— taux d’hormones thyroïdiennes chez les petits âgés de 13 jours et les mâles adultes (ainsi que chez les mères et chez les petits âgés de 4 jours si cela a été mesuré);
— nombre de petits présentant des anomalies évidentes, évaluation macroscopique des organes génitaux externes, nombre d’avortons;
— indication du moment de la mort survenue pendant l’étude, ou si l’animal a survécu jusqu’à la fin;
— nombre d’embryons implantés, taille et poids des portées au moment de la consignation de ces données;
— poids corporel lors du sacrifice et poids des organes des animaux de la génération parentale;
— résultats de l’autopsie;
— description détaillée de l’examen histopathologique;
— données sur l’absorption (si elles sont disponibles);
— traitement statistique des résultats, le cas échéant.
Examen des résultats.
Conclusions.
Interprétation des résultats
56. L’étude permettra d’évaluer la toxicité pour la reproduction et le développement liée à l’administration de doses répétées (voir paragraphes 5 et 6). Elle pourrait aider à déterminer s’il y a lieu d’approfondir les recherches et fournir des orientations pour la conception d’études ultérieures. Le document d’orientation no 43 de l’OCDE devra être consulté pour aider à l’interprétation des résultats liés à la reproduction et au développement (12). Le document d’orientation no 106 de l’OCDE sur l’évaluation histologique des essais endocriniens et de reproduction chez les rongeurs (11) fournit des informations sur la préparation et l’évaluation des organes (endocriniens) et des frottis vaginaux; ces informations peuvent être utiles dans le cadre de la présente ligne directrice.
BIBLIOGRAPHIE
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(3) OCDE (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Disponible sur demande auprès de l’Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
(4) OCDE (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
(5) OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation de coopération et de développement économiques,.Paris.
(6) OCDE (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150), Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
(7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.
(8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.
(9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.
(10) OCDE (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
(11) OCDE (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 106), Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
(12) OCDE (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
B.64 ÉTUDE COMBINÉE DE TOXICITÉ À DOSES RÉPÉTÉES ET DE DÉPISTAGE DE LA TOXICITÉ POUR LA REPRODUCTION ET LE DÉVELOPPEMENT
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 422 de l’OCDE. Les lignes directrices de l’OCDE pour les essais de produits chimiques sont régulièrement mises à jour pour tenir compte des progrès scientifiques. La ligne directrice 422 originale a été adoptée en 1996, sur la base d’un protocole pour une «étude combinée de toxicité à doses répétées et de dépistage de la toxicité pour la reproduction et le développement», examiné lors de deux réunions d’experts, à Londres en 1990 (1) et à Tokyo en 1992 (2).
2. La présente méthode d’essai comporte une partie relative au dépistage de la toxicité pour la reproduction et/ou le développement fondée sur l’expérience acquise dans les pays Membres par l’application de la méthode initiale à des produits chimiques existants produits en grande quantité et par la réalisation d’essais d’orientation avec des témoins positifs (3) (4). Elle comprend également une partie relative à la toxicité à doses répétées, conforme à la ligne directrice 407 (Étude de toxicité orale à dose répétée pendant 28 jours sur les rongeurs, correspondant au chapitre B.7 de la présente annexe).
3. La présente méthode d’essai a été mise à jour en y introduisant des paramètres pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens, suite à une activité prioritaire lancée par l’OCDE en 1998, destinée à réviser les lignes directrices existantes et à en élaborer de nouvelles pour les essais et le dépistage des perturbateurs endocriniens (5). Dans ce contexte, la ligne directrice 407 (Étude de toxicité orale à dose répétée pendant 28 jours sur les rongeurs, correspondant au chapitre B.7 de la présente annexe), a été mise à jour en 2008 en y introduisant des paramètres capables de détecter l’activité endocrinienne des produits chimiques d’essai. L’objectif de la mise à jour de la ligne directrice 422 était d’inclure des paramètres pertinents pour l’étude des perturbateurs endocriniens dans des lignes directrices de dépistage au cours desquelles les périodes d’exposition couvrent certaines périodes sensibles du développement (périodes prénatale ou suivant la naissance).
4. Les paramètres pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens qui ont été sélectionnés et ajoutés, font aussi partie de la ligne directrice 443 (Étude étendue de toxicité pour la reproduction sur une génération, correspondant au chapitre B.56 de la présente annexe); ils ont été introduits dans la ligne directrice 422 sur la base d’une étude de faisabilité étudiant les questions scientifiques et techniques liées à l’inclusion de ces paramètres, ainsi que les ajustements possibles à mettre en œuvre dans la conception de l’essai pour permettre leur inclusion (6).
5. La présente méthode d’essai vise l’obtention d’informations sommaires concernant les effets d’un produit chimique d’essai sur le fonctionnement de la reproduction chez le mâle et la femelle, notamment la fonction gonadique, le comportement lors de l’accouplement, la conception, le développement de l’embryon et la parturition. Elle ne vient pas en remplacement des méthodes d’essai existantes B.31, B.34, B.35 ou B.36.
CONSIDÉRATIONS PRÉLIMINAIRES
6. Lors de l’évaluation et de l’estimation des propriétés toxiques d’un produit chimique d’essai, on peut déterminer la toxicité orale à doses répétées après avoir obtenu une indication sur la toxicité au moyen d’essais de toxicité aiguë. On trouvera dans la présente étude des informations relatives aux dangers possibles pour la santé, découlant d’expositions répétées pendant une période relativement limitée. La méthode comprend l’étude de base de toxicité à doses répétées applicable aux produits chimiques pour lesquels une étude à 90 jours ne se justifie pas (par exemple lorsque le volume de la production ne dépasse pas une certaine limite) ou lorsqu’elle constitue une étude préliminaire à une étude à long terme. Lors de la réalisation de l’étude, il est recommandé de suivre les principes et considérations énoncés dans le document d’orientation no 19 de l’OCDE sur la reconnaissance, l’évaluation et l’utilisation des signes cliniques en tant qu’effets mesurés éthiquement acceptables dans les expérimentations animales menées à des fins d’évaluation de la sécurité (7).
7. L’étude comprend en outre un test de dépistage de la toxicité pour la reproduction et le développement et elle peut donc être utilisée pour obtenir des informations initiales sur les effets possibles affectant les capacités reproductrices du mâle et de la femelle telles que la fonction gonadique, le comportement lors de l’accouplement, la conception, le développement de l’embryon et la parturition, soit à un stade précoce de l’évaluation des propriétés toxicologiques des substances chimiques, soit sur des substances chimiques préoccupantes. Cette méthode d’essai ne fournit pas une information exhaustive sur tous les aspects de la reproduction et du développement. En particulier, elle n’offre que des moyens limités pour déceler des manifestations postnatales d’une exposition prénatale ou des effets imputables à une exposition postnatale. En raison (entre autres) du choix des effets observés retenu et de la brièveté de l’étude, cette méthode ne fournit pas toute l’évidence nécessaire à l’étayage d’une conclusion définitive quant à une absence d’effets toxiques pour la reproduction et le développement. De plus, en l’absence de données tirées d’autres essais de toxicité pour la reproduction et le développement, des résultats positifs sont utiles à une évaluation initiale du danger et permettent de juger de la nécessité de procéder à d’autres essais et de définir le calendrier de ceux-ci.
8. Les résultats obtenus concernant les paramètres endocriniens devraient être interprétés à la lumière du «Cadre conceptuel de l’OCDE pour les essais et l’évaluation des produits chimiques perturbant le système endocrinien» (8). La ligne directrice 422 de l’OCDE mise à jour fait partie du niveau 4 de ce Cadre conceptuel en tant qu’essai in vivo apportant des données sur les effets adverses affectant les paramètres endocriniens pertinents. Un signal endocrinien ne sera néanmoins pas toujours considéré comme une preuve suffisante en tant que telle que le produit chimique d’essai est un perturbateur endocrinien.
9. Cette méthode d’essai met également l’accent sur la recherche d’éventuels effets neurologiques et elle insiste sur la nécessité de soumettre les animaux à des observations cliniques minutieuses afin de recueillir le maximum d’observations. La méthode devrait permettre de déceler des produits chimiques présentant des risques de neurotoxicité et pour lesquels des études plus approfondies dans cette voie seraient justifiées. En outre, la méthode peut aussi donner des indications relatives à l’immunotoxicité.
10. En l’absence de données résultant d’autres études de toxicité systémique, de toxicité pour la reproduction et le développement, de neurotoxicité et/ou d’immunotoxicité, des résultats positifs permettent de faire une évaluation préliminaire des dangers et d’orienter les décisions quant à la nécessité d’effectuer et de programmer des essais supplémentaires. Ce test peut être particulièrement utile dans le dossier OCDE d’Examen détaillé des données (EDD) des substances existantes, celles pour lesquelles on dispose de peu ou pas de données toxicologiques, où il peut être utilisé comme une alternative à la conduite de deux tests séparés, respectivement pour la toxicité à dose répétée (ligne directrice 407 de l’OCDE, correspondant au chapitre B.7 de la présente annexe) et pour la toxicité pour la reproduction et le développement (ligne directrice 421 de l’OCDE, correspondant au chapitre B.63 de la présente annexe). Il peut être aussi utilisé pour sélectionner la gamme des doses en vue d’études sur la reproduction et le développement plus extensives, ou dans les cas où cela est jugé pertinent.
11. Il est généralement admis qu’il existe des différences de sensibilité entre les femelles gravides et celles qui ne le sont pas. En conséquence, il peut s’avérer plus difficile de déterminer les niveaux de dose appropriés qui permettent l’évaluation de la toxicité systémique générale et de la toxicité particulière pour la reproduction et le développement dans cet essai combiné que lorsque des essais distincts sont menés séparément. De plus, du fait de la complexité technique de l’essai, la réalisation de cet essai de dépistage combiné peut dépasser les compétences de laboratoires inexpérimentés. Cependant, outre le plus petit nombre d’animaux implique l’essai combiné peut être un meilleur moyen de distinguer les effets directs sur la reproduction et le développement de ceux, secondaires à d’autres effets (systémiques).
12. Dans le présent essai, la période d’administration des doses est plus longue que dans l’étude classique de toxicité à doses répétées sur 28 jours. En revanche, elle utilise moins d’animaux de chaque sexe par groupe par rapport au nombre d’animaux utilisés dans l’exécution d’une étude classique à doses répétées sur 28 jours qui serait faite à la suite d’un essai de dépistage de toxicité pour la reproduction et le développement.
13. La présente méthode d’essai postule que le produit chimique d’essai est administré par voie orale. Des modifications peuvent être nécessaires si d’autres voies d’exposition sont utilisées.
14. Avant d’utiliser la méthode d’essai sur un mélange pour générer des données avec pour objectif recherché l’application réglementaire, on considérera si, et si oui pourquoi, elle peut fournir des résultats adéquats dans cet objectif. De telles considérations ne sont pas nécessaires quand les exigences réglementaires stipulent que le mélange doit être testé.
15. On trouvera à l’appendice 1 les définitions des termes utilisés.
PRINCIPE DE L’ESSAI
16. Le produit chimique d’essai est administré en doses successives à plusieurs groupes de mâles et de femelles. L’administration aux mâles devrait s’étendre sur une période d’au moins quatre semaines jusque, et y compris, le jour précédant le sacrifice programmé de l’animal (cette période de quatre semaines couvre une période minimale de deux semaines avant et au cours de la période d’accouplement et une période approximative de deux semaines après l’accouplement). En ce qui concerne les mâles, étant donné la brièveté de l’administration avant l’accouplement, la fécondité pourrait ne pas être un indicateur particulièrement sensible de la toxicité testiculaire. En conséquence, il est indispensable de procéder à un examen histologique détaillé des testicules. On considère que la combinaisonde l’administration des doses pendant deux semaines avant l’accouplement et des observations subséquentes sur l’accouplement et la fécondité (portant à quatre semaines minimum la période totale d’administration des doses), complétée par l’analyse histopathologique approfondie des gonades mâles, permet la détection de la plupart des effets sur la fécondité masculine et sur la spermatogenèse.
17. Les doses doivent être administrées aux femelles pendant toute la durée de l’étude, c’est-à-dire deux semaines avant l’accouplement (visant à couvrir au moins deux cycles menstruels complets), plus le temps variable qui peut s’écouler jusqu’à la conception, la durée de la gestation et au moins treize jours après la parturition, jusque et y compris le jour précédant le sacrifice de l’animal.
18. La durée de l’étude, après l’acclimatation des animaux et évaluation du cycle œstral préalable au traitement, dépend du comportement des femelles mais couvre environ 63 jours, [14 jours avant l’accouplement, la période d’accouplement (qui peut atteindre 14 jours), 22 jours de gestation et 13 jours de lactation].
19. Au cours de la période d’administration des doses, les animaux sont soigneusement observés à un rythme quotidien pour déceler tout signe de toxicité. Les animaux qui meurent ou qui sont sacrifiés au cours de l’essai sont autopsiés, et, au terme de l’essai, les animaux survivants sont sacrifiés et autopsiés.
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Choix des espèces
20. La présente méthode d’essai est conçue pour être appliquée au rat. Si les paramètres spécifiés dans la présente ligne directrice 422 sont examinés chez une autre espèce de rongeur, une justification détaillée sera donnée. Dans le programme international de validation pour la détection des perturbateurs endocriniens pour la ligne directrice 407, le rat était la seule espèce utilisée. Il convient d’éviter l’utilisation de souches de faible fécondité ou dont on sait qu’elles sont souvent affectées de défauts de développement. Il faut utiliser des animaux sains et vierges, qui n’ont jamais fait l’objet d’essais antérieurs. Les animaux d’essai doivent être caractérisés par leur espèce, leur souche, leur sexe, leur poids et leur âge. Au début de l’étude, la variation de poids des animaux utilisés devrait être minimale et ne pas dépasser ± 20 % du poids moyen pour chaque sexe. Lorsque l’essai est conduit à titre d’étude préliminaire à une étude de toxicité à long terme ou une étude portant sur une génération complète, il est préférable d’utiliser des animaux issus de la même souche et de la même source dans les deux études.
Conditions d’encagement et d’alimentation
21. Toutes les procédures se conformeront aux normes locales en vigueur en matière de protection des animaux de laboratoire. La température dans la salle des animaux doit être maintenue à 22 °C (± 3 °). L’humidité relative doit être maintenue à 30 pour cent au moins et ne doit pas dépasser 70 pour cent, sauf durant le nettoyage de la salle. Un éclairage artificiel doit être dispensé pour obtenir une photopériode de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. L’alimentation pourra comporter une nourriture classique de laboratoire et de l’eau à satiété. Le choix du régime alimentaire peut être dicté par la nécessité d’assurer un mélange satisfaisant du produit chimique d’essai lorsque celui-ci est administré par le biais de la nourriture.
22. Les animaux sont encagés par petits groupes d’individus de même sexe; on peut encager les animaux individuellement si une nécessité scientifique le justifie. Dans le cas d’un encagement en groupe, le nombre d’animaux par cage ne doit pas dépasser cinq. L’accouplement doit avoir lieu dans des cages prévues à cet effet. Les femelles gravides doivent être placées dans des cages individuelles et disposer de matériaux nécessaires à la confection des nids. Les femelles allaitantes doivent être hébergées séparément avec leur portée.
23. La nourriture sera analysée régulièrement à la recherche de contaminants. Un échantillon de nourriture sera prélevé jusqu’à la finalisation du rapport.
Préparation des animaux
24. De jeunes adultes sains doivent être choisis au hasard pour être affectés aux groupes traités et aux cages. Les animaux sont marqués afin de permettre leur identification et sont placés dans leur cage pendant au moins cinq jours avant le début de l’étude afin de les acclimater aux conditions du laboratoire.
Préparation des doses
25. Il est recommandé d’administrer le produit chimique d’essai par voie orale, à moins que d’autres voies soient considérées comme plus appropriées. Lorsque la voie orale est choisie, le produit chimique d’essai est généralement administré par gavage; toutefois, dans certains cas, les produits chimiques d’essai peuvent aussi être administrés dans l’alimentation ou dans l’eau de boisson.
26. Le cas échéant, le produit chimique d’essai est dissout ou mis en suspension dans un véhicule approprié. Il est recommandé, dans la mesure du possible, de recourir en priorité à une solution ou à une suspension aqueuse, en second lieu à une solution dans l’huile (huile de maïs, par exemple), ou à défaut dans d’autres véhicules. Les caractéristiques de toxicité des véhicules, s’ils sont non aqueux, doivent être connues. La stabilité et le caractère homogène du produit chimique d’essai dans le véhicule doivent être déterminés.
MODE OPÉRATOIRE
Nombre et sexe des animaux
27. Il est recommandé de constituer des groupes d’au moins 10 males et 12-13 femelles. Avant le début de l’exposition, on évaluera les cycles œstraux chez les femelles, et les animaux qui ne présentent pas un cycle classique de 4-5 jours ne seront pas inclus dans l’étude; c’est pourquoi on recommande l’utilisation de femelles supplémentaires, pour parvenir à 10 femelles par groupe. Sauf dans le cas d’effets toxiques marqués, on devrait obtenir au moins 8 femelles gravides par groupe, soit le nombre minimum généralement acceptable. Il s’agit d’aboutir à un nombre suffisant de gestations et à une progéniture suffisamment abondante pour permettre une évaluation fiable de l’action du produit chimique d’essai sur la fertilité, la gravidité, le comportement maternel et l’allaitement, ainsi que sur la croissance et le développement de la descendance F1 à partir de la conception jusqu’au 13ème jour après la parturition. S’il est prévu de sacrifier des animaux au cours de cette période, le nombre d’animaux d’essai doit être augmenté du nombre d’animaux qu’il est prévu de sacrifier avant le terme de l’étude. Il convient d’envisager l’adjonction d’un groupe satellite supplémentaire de cinq animaux par sexe dans le groupe témoin et dans le groupe soumis à la dose maximale afin d’observer la réversibilité, la persistance ou l’apparition d’effets toxiques systémiques différés, pendant au moins 14 jours après la fin du traitement. Les animaux du groupe satellite ne seront pas accouplés et ne pourront donc pas être utilisés pour évaluer la toxicité pour la reproduction et le développement.
Détermination des doses
28. En général, il faudra utiliser au moins trois groupes d’essai et un groupe témoin. Si on ne dispose pas de données appropriées relatives à la toxicité générale, il y aura lieu d’effectuer une étude d’orientation (avec des animaux de même souche et même source) afin de déterminer les doses à utiliser. Exception faite de l’administration du produit chimique d’essai, les animaux du groupe témoin doivent être traités de la même manière que ceux des groupes soumis à l’essai. Si un véhicule est utilisé pour administrer le produit chimique d’essai, le groupe témoin doit en recevoir le volume administré le plus élevé.
29. La détermination des niveaux des doses doit prendre en compte toutes les données sur la toxicité et les caractéristiques (toxico-)cinétiques disponibles. Il faut aussi prendre en compte le fait que les femelles gestantes et non-gestantes peuvent présenter des sensibilités différentes. La dose la plus élevée doit être choisie de façon à provoquer des effets toxiques mais sans provoquer la mort ou des souffrances manifestes. Ensuite, il convient de déterminer les doses par ordre décroissant pour mettre en évidence toute relation entre traitement et réponse et, au niveau de la dose la plus faible, l’absence d’effets nocifs. On considère généralement optimal de définir des intervalles d’un facteur deux à quatre, l’intégration d’un quatrième groupe étant souvent jugé préférable à l’utilisation d’intervalles trop importants (supérieurs à un facteur de 10) entre les niveaux des doses.
30. En cas d’observation d’une toxicité générale (par exemple réduction du poids corporel, effets sur le foie, le cœur, les poumons ou les reins, etc.) ou d’autres modifications susceptibles de ne pas constituer une réponse toxique (par exemple diminution de la prise de nourriture, grossissement du foie), les effets observés sur les paramètres endocriniens devront être interprétés avec précaution.
Épreuve limite
31. Si l’administration orale d’une dose au moins égale à 1 000 mg/kg de poids corporel/jour ou, en cas d’administration par le biais de l’alimentation, à un pourcentage équivalent dans la nourriture ou dans l’eau (en fonction du poids corporel), selon les modalités précisées pour cette étude, ne provoque aucun effet toxique observable et si aucune toxicité n’est à prévoir compte tenu des données relatives à des substances présentant une structure voisine, on peut juger qu’il n’est pas nécessaire d’entreprendre une étude complète faisant intervenir plusieurs niveaux de doses. Toutefois, l’exposition humaine prévisible peut conduire à retenir un niveau de dose plus élevé pour l’essai limite. Pour d’autres types d’administration, tels que l’inhalation et l’absorption par voie cutanée, les propriétés physico-chimiques des substances d’essai peuvent souvent dicter l’exposition maximale qui peut être mise en œuvre.
Administration des doses
32. Le produit chimique d’essai est administré aux animaux chaque jour de la semaine. En cas de gavage, les animaux doivent recevoir une dose unique au moyen d’une sonde stomacale ou d’une canule d’intubation adaptée. Le volume maximal de liquide pouvant être administré en une fois dépend de la taille de l’animal soumis à l’essai. Il ne doit pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel, sauf s’il s’agit d’une solution aqueuse pour laquelle le volume peutatteindre 2 ml/100 g de poids corporel. Exception faite de produits chimiques d’essai irritants ou corrosifs qui feront normalement apparaître des effets d’autant plus marqués que les concentrations seront élevées, la variabilité du volume d’essai devrait être réduite au minimum grâce à un ajustement de la concentration de sorte que le volume soit constant quel que soit le niveau de la dose.
33. En cas d’administration par le biais de l’alimentation ou de l’eau, il importe de veiller à ce que les quantités de produit chimique d’essai utilisées ne perturbent pas l’équilibre normal de la nutrition ou de l’hydratation. Lorsque le produit chimique d’essai est administré par la nourriture, on peut retenir soit une concentration constante dans les aliments (ppm), soit un niveau de dose constant par rapport au poids du corps de l’animal; l’option retenue doit être précisée. En cas d’administration par gavage, la dose doit être apportée quotidiennement à heures fixes et ajustée au moins une fois par semaine pour être maintenue à un niveau constant par rapport au poids du corps de l’animal. Lorsque l’étude combinée est une étude préliminaire à une étude de toxicité à long terme ou à une étude approfondie de la toxicité pour la reproduction, il faut prendre soin d’assurer une alimentation identique dans les deux études.
Calendrier de l’étude
34. L’administration de la substance aux animaux des deux sexes doit commencer deux semaines avant l’accouplement, après une période d’acclimatation d’au moins cinq jours et après avoir observé que les femelles présentaient un cycle œstral normal (au cours d’une période prétraitement de 2 semaines). L’étude doit être programmée de telle sorte que l’accouplement débute peu après que les animaux ont atteint leur pleine maturité sexuelle. Celle-ci intervient à des âges qui varient légèrement selon les espèces et selon les laboratoires, à savoir 10 semaines pour les rats Sprague Dawley et 12 semaines environ pour les rats Wistar. Les femelles ayant mis bas doivent être sacrifiées le 13ème jour qui suit la parturition ou peu après. Afin d’astreindre les femelles à un jeûne de douze heures avant le prélèvement de sang (si telle est l’option choisie), il n’est pas nécessaire de sacrifier les femelles et leur progéniture le même jour. Le jour de la naissance (où la parturition est achevée) marque le jour 0 de la période post partum. Les femelles qui ne montrent aucun signe de copulation sont sacrifiées 24 à 26 jours après le dernier jour de la période d’accouplement. L’administration de la substance d’essai aux mâles et aux femelles se poursuit durant la période d’accouplement. Au-delà, elle doit continuer pour les mâles, au moins jusqu’à la fin de la période totale d’administration, soit un minimum de 28 jours. Les mâles sont ensuite sacrifiés ou bien maintenus en vie et continuent alors à recevoir la substance d’essai en vue, le cas échéant, d’un second accouplement.
35. L’administration quotidienne du produit chimique d’essai aux femelles de la génération parentale doit continuer pendant toute la gestation et au moins jusqu’au 3ème jour post partum inclus ou jusqu’au jour précédant le sacrifice. En ce qui concerne les études dans lesquelles le produit chimique d’essai est administré par inhalation ou par voie cutanée, l’administration doit se poursuivre au moins jusqu’au 19ème jour inclus de la gestation, et l’administration doit être initiée à nouveau dès que possible et pas après le 4ème jour suivant la naissance (jour post-naissance - JPN).
36. Les animaux appartenant au groupe satellite, réservés aux observations de suivi, si elles sont prévues, ne sont pas soumis à l’accouplement. Ils devraient être maintenus en vie sans être traités pendant 14 jours au moins après le premier sacrifice de femelles prévu, afin de déceler l’apparition différée, la persistance ou la disparition complète des effets toxiques.
37. On trouvera une représentation schématique du calendrier d’essai à l’appendice 2.
Cycle œstral
38. Les cycles œstraux sont contrôlés avant le début du traitement pour sélectionner pour l’étude des femelles présentant un cycle régulier (voir paragraphe 27). Les frottis vaginaux sont examinés chaque jour depuis le début du traitement jusqu’à la confirmation de l’accouplement. Si l’on suspecte que des effets liés à un stress aigu lors de l’initiation du traitement pourraient perturber le cycle œstral, les laboratoires peuvent exposer les animaux de l’essai pendant deux semaines, puis effectuer des frottis vaginaux chaque jour pour contrôler le cycle œstral pendant un minimum de deux semaines débutant au début de la période de pré-accouplement et se poursuivant durant la période d’accouplement, jusqu’à ce que l’accouplement soit avéré. Pour obtenir des cellules vaginales ou cervicales, on prendra soin d’éviter d’agresser la muqueuse ce qui risquerait d’induire une pseudo-gestation (8) (9).
Modalités d’accouplement
39. On utilise normalement des couples 1:1 (un mâle pour une femelle). Il peut y avoir exception à cette règle si des mâles viennent à mourir. La femelle doit être placée avec le même mâle jusqu’à ce que la copulation soit avérée ou pendant deux semaines. Chaque matin, il convient d’examiner les femelles pour vérifier la présence de sperme ou d’un bouchon vaginal. Le jour 0 de la gestation est celui où l’accouplement est avéré (présence de sperme ou d’un bouchon vaginal). Lorsque le couple s’avère improductif, on peut envisager de ré-accoupler les femelles avec des mâles éprouvés du même groupe.
Taille des portées
40. Au quatrième jour après la naissance, on peut ajuster la taille de chaque portée en éliminant des petits surnuméraires choisis au hasard, afin de s’approcher autant que possible du nombre de quatre ou cinq petits par sexe par portée, en fonction de la taille normale d’une portée dans la souche de rats utilisée. Des échantillons de sang seront prélevés sur deux des animaux surnuméraires, mis en commun, et utilisés pour la détermination des niveaux sériques de T4. Il ne convient pas de procéder à une élimination sélective des petits, par exemple basée sur le poids corporel ou la distance ano-génitale (DAG). Lorsque le nombre de petits mâles et femelles est tel qu’il empêche de disposer de quatre ou cinq animaux de chaque sexe par portée, il est acceptable de procéder à des ajustements partiels (par exemple, six mâles et quatre femelles). Aucun petit ne sera éliminé quand la taille de la portée devient inférieure à la limite d’ajustement de 8 à 10 petits/portée. S’il n’existe qu’un petit surnuméraire au-dessus de la limite d’ajustement, alors ce seul petit surnuméraire sera éliminé et un échantillon de sang prélevé afin de déterminer la concentration sérique de T4.
41. Si la taille des portées n’est pas ajustée, deux petits par portée seront sacrifiés au 4è jour après la naissance et des échantillons de sang seront prélevés pour la mesure des concentrations sériques d’hormones thyroïdiennes. Si possible, les deux petits par portée seront des femelles afin de réserver les males pour l’examen de la persistance du mamelon, exception faite du cas où l’élimination de ces petits ne laisse aucune femelle pour les évaluations terminales. Aucun petit ne sera éliminé quand la taille de la portée devient inférieure à la limite d’ajustement de 8 à 10 petits/portée (en fonction de la taille normale d’une portée chez la souche de rats employée). S’il n’existe qu’un petit surnuméraire au-dessus de la limite d’ajustement, alors ce seul petit surnuméraire sera éliminé et un échantillon de sang prélevé afin de déterminer la concentration sérique de T4.
Observations
42. Tous les jours, les animaux doivent faire l’objet d’un examen clinique général, de préférence aux même(s) moments de la journée et en considérant la période du pic des effets attendus après administration des doses. L’état de santé des animaux doit être noté. Des observations de morbidité et de mortalité sont effectuées sur tous les animaux au moins deux fois par jour.
43. Chaque animal de la génération parentale doit faire l’objet d’un examen clinique détaillé avant la première exposition (pour permettre des comparaisons sur le même sujet) et au moins une semaine après. Ces examens doivent être effectués hors de la cage d’hébergement sur une aire standard. Ces observations doivent être soigneusement notées, de préférence au moyen de systèmes de notations explicitement définis par le laboratoire. Il faut s’efforcer de minimaliser les variations des conditions de l’essai et les examens doivent être conduits de préférence par des observateurs tenus dans l’ignorance du traitement. Les observations notées devraient porter, sans que cette liste soit exhaustive, sur les modifications de la peau, de la fourrure, des yeux, des membranes muqueuses, sur l’apparition de sécrétions et d’excrétions et sur les activités réflexes (par exemple larmes, érection des poils, diamètre de la pupille, rythme respiratoire inhabituel). Il convient également de noter tout changement de la démarche, de la posture, de la réaction à la manipulation ainsi que l’apparition de mouvements spasmodiques ou de contractures, de stéréotypes (par exemple toilettage excessif, circuits répétitifs), parturition difficile ou prolongée ou comportements bizarres (par exemple automutilation, marche à reculons) (11).
44. A un certain moment au cours de l’étude, il convient également d’étudier la réactivité sensorielle à des stimuli de divers types (par exemple stimuli auditif, visuel et proprioceptif) (8) (9) (11), la force de préemption (12) et l’activité motrice (13). Ces études doivent être menées sur cinq mâles et cinq femelles choisis au hasard dans chaque groupe. On trouvera dans les références bibliographiques susmentionnées plus de détails sur les modes opératoires. Toutefois, il est possible de recourir à d’autres modes opératoires. Chez les mâles, ces observations fonctionnelles devraient être effectuées vers la fin de la période d’administration de la substance d’essai, peu de temps avant la date prévue pour leur sacrifice mais avant l’échantillonnage du sang pour les analyses hématologiques ou de chimie clinique (voir paragraphes 53-56 ainsi que la note de bas de page relative à ces paragraphes). Les femelles devraient se trouver dans le même état physiologique au cours de ces tests fonctionnels qui devraient être menés, de préférence une fois au cours de la dernière semaine de lactation (par exemple, 6è-13è jour de lactation), peu de de temps avant la date fixée pour leur sacrifice. Dans la mesure du possible, il faudra limiter le plus possible la durée des périodes de séparation des mères et des petits.
45. On peut omettre ces observations fonctionnelles à effectuer une fois vers la fin de l’étude lorsque cette dernière est une étude d’orientation préliminaire à une étude ultérieure subchronique (90 jours) ou à long terme. Dans ce cas, les observations fonctionnelles devraient être effectuées au cours de l’étude à plus long terme. Dans d’autres cas, les données disponibles sur les observations fonctionnelles dans cette étude à dose répétée peuvent augmenter la capacité de choisir les doses pour une étude consécutive subchronique ou à long terme.
46. À titre exceptionnel, on peut également omettre les observations fonctionnelles pour des groupes qui manifestent des effets toxiques à un niveau qui risquerait d’interférer significativement avec les résultats des essais fonctionnels.
47. Il convient de noter la durée de la gestation, calculée à partir du jour 0 défini ci-dessus. Chaque portée devrait être examinée aussitôt que possible après sa mise-bas afin de déterminer le nombre et le sexe des petits, des mort-nés, des vivants, des avortons (petits d’une taille nettement inférieure à celle des individus témoins) ainsi que la présence de grosses anomalies.
48. Il convient de dénombrer et de déterminer le sexe des petits vivants et de peser les portées dans les 24 heures suivant la parturition (jour 0 ou 1 post partum), et au moins les 4ème et 13ème jours post partum. Outre les observations portant sur les animaux parents (voir paragraphes 43 et 44) il faut noter tout comportement anormal des rejetons.
49. On mesure la DAG de chaque petit au même jour suivant la naissance, entre les JPN 0 et 4. Le poids corporel des petits est relevé le jour de la mesure de la DAG; la DAG est rapportée à une mesure de la taille du petit, de préférence la racine cubique du poids corporel (14). On devra compter le nombre de mamelons/aréoles chez les petits mâles aux JPN 12 ou 13, comme le document d’orientation 151 de l’OCDE le recommande (15).
Poids corporel et consommation de nourriture et d’eau
50. Les mâles et les femelles doivent être pesés le premier jour d’administration de la substance d’essai, puis au moins une fois par semaine, ainsi que le dernier jour. Au cours de la gestation, les femelles doivent être pesées les jours 0, 7, 14 et 20, et dans les 24 heures qui suivent la parturition (jour 0 ou 1 post partum), ainsi que les 4ème et 13ème jours post partum. Ces observations sont à enregistrer de manière individuelle pour chaque animal adulte.
51. Durant les périodes de pré-accouplement, de gestation et de lactation, la consommation alimentaire doit être mesurée au moins une fois par semaine. Cette mesure est facultative pendant la période d’accouplement. La consommation d’eau doit également être mesurée durant les périodes en question lorsque le produit chimique d’essai est administré par ce moyen.
Hématologie
52. Une fois au cours de l’étude, il convient d’effectuer sur cinq mâles et cinq femelles choisis au hasard dans chaque groupe les examens hématologiques suivants: hématocrite, concentrations d’hémoglobine, comptage des érythrocytes, réticulocytes, comptage total et différentiel des leucocytes, comptage des plaquettes et mesure du temps et du potentiel de coagulation du sang. D’autres analyses telles que la concentration en méthémoglobine et les corps de Heinz seront réalisées si le produit chimique d’essai ou ses métabolites supposés ont ou sont suspectés d’avoir des propriétés oxydantes.
53. Les échantillons de sang doivent être prélevés sur un site bien déterminé. Les femelles doivent se trouver dans le même état physiologique au cours de l’échantillonnage. Afin d’éviter des difficultés pratiques liées à la variabilité du début de la gestation, les prélèvements de sang chez les femelles doivent être effectués à la fin de la période de pré-accouplement au lieu d’être prélevé juste avant ou au cours du sacrifice des animaux. Les échantillons de sang des mâles devraient de préférence être prélevés juste avant, ou pendant le sacrifice des animaux. On peut aussi prélever le sang des mâles à la fin de la période de pré-accouplement au cas où cette option aurait été choisie pour les femelles.
54. Les échantillons de sang doivent être conservés dans des conditions adéquates.
Biochimie clinique
55. Les études de biochimie clinique ont pour objet d’étudier les principaux effets toxiques sur les tissus et, plus précisément, sur le rein et le foie. Elles doivent être exécutées sur des échantillons de sang prélevés sur les cinq mâles et les cinq femelles choisis dans chaque groupe. Il est recommandé d’effectuer les prélèvements de sang sur des animaux à jeun depuis la veille au soir L’étude du plasma ou du sérum comporte la détermination des substances ci-après: sodium, potassium, glucose, cholestérol total, urée, créatinine, protéines totales et albumine, au moins deux enzymes indicatrices d’effets sur les cellules hépatiques (telles que l’alanine-aminotransférase, l’aspartate-aminotransférase et la sorbitol-déshydrogénase) ainsi que les acides biliaires. Dans certaines circonstances, la mesure d’autres enzymes (hépatiques ou autres) et de la bilirubine peut fournir des informations utiles.
56. Des échantillons sanguins sont prélevés sur un site défini selon le schéma suivant:
— chez au moins deux petits par portée au jour 4 après la naissance, si le nombre de petits le permet (voir paragraphes 40-41);
— chez toutes les mères et chez au moins deux petits par portée à la fin de l’expérience au jour 13, et
— chez les adultes mâles à la fin de l’expérience.
Tous ces échantillons sont conservés dans des conditions appropriées. Les échantillons de sang des petits à JPN13 et des adultes mâles font l’objet d’un dosage sérique d’hormones thyroïdiennes (T4). D’autres évaluations de T4 dans les échantillons de sang des mères et des petits à JPN 4 peuvent être réalisées, le cas échéant. De manière optionnelle on pourra mesurer d’autres hormones, le cas échéant. Le sang des petits peut être mis en commun par portée pour l’analyse des hormones thyroïdiennes. Les hormones thyroïdiennes (T4 et TSH) seront de préférence mesurées sous forme «totale».
57. À titre facultatif, on peut effectuer les observations ci-après sur les urines de cinq mâles choisis au hasard dans chaque groupe, recueillies pendant un intervalle de temps déterminé au cours de la dernière semaine de l’étude: apparence, volume, osmolalité ou masse volumique, pH, protéines, glucose, sang/cellules sanguines.
58. En outre, on peut envisager de rechercher dans le sérum des indicateurs de dommages aux tissus. D’autres analyses pourraient être effectuées si les propriétés connues du produit chimique d’essai sont susceptibles, ou peuvent être soupçonnées, de perturber des activités métaboliques et leurs indicateurs tels que le calcium, les phosphates, les triglycérides à jeun, le glucose à jeun, certaines hormones, la méthémoglobine et la cholinestérase. Le dosage de ces substances se fera au cas par cas.
59. Les facteurs suivants peuvent influencer la variabilité et les concentrations absolues des déterminations hormonales:
— le moment du sacrifice, à cause des variations diurnes des concentrations hormonales,
— la méthode de sacrifice, qui devra éviter un stress inutile chez les animaux pouvant affecter les concentrations en hormones thyroïdiennes
— les kits d’essai pour les déterminations hormonales, dont les courbes standards peuvent différer d’un kit à l’autre.
60. Les échantillons de plasma spécifiquement destinés à la détermination des hormones doivent être obtenus à des moments de la journée comparables. Les valeurs numériques obtenues lors de l’analyse des concentrations hormonales diffèrent en fonction du kit commercial utilisé.
61. Si l’on ne dispose pas d’une base de données historiques adéquate, il faut envisager de déterminer les paramètres hématologiques et biochimiques avant d’administrer la substance d’essai, ou de façon préférable, réaliser ces déterminations dans un groupe d’animaux qui ne soit pas inclus dans le groupe d’animaux de l’expérience. Pour les femelles, les données doivent provenir des femelles allaitantes.
PATHOLOGIE
Autopsie générale
62. Tous les animaux adultes étudiés doivent faire l’objet d’une autopsie générale complète et détaillée qui comporte un examen minutieux de la surface externe du corps, de tous les orifices et des cavités crânienne, thoracique et abdominale ainsi que du contenu de ces cavités. On s’intéressera plus particulièrement aux organes de l’appareil reproducteur. Le nombre de sites d’implantation d’embryons doit être consigné. Les frottis vaginaux sont examinés le matin du jour de la nécropsie pour déterminer quelle est la phase du cycle œstral et permettre une corrélation avec l’histopathologie des organes reproducteurs femelles.
63. Les testicules et épididymes de même que la prostate et les vésicules séminales avec les glandes de coagulation entières de tous les animaux mâles adultes devront être débarrassés de tout tissu adhérent si nécessaire, et leur poids mesuré aussitôt après la dissection pour éviter toute déshydratation. En outre, il est possible de relever le poids d’autres organes, tels que le complexe des muscles élévateur de l’anus et bulbo-caverneux, les glandes de Cowper et le gland du pénis chez les mâles, et les ovaires et l’utérus (y compris le col) chez les femelles. Le cas échéant, ces mesures doivent être effectuées aussitôt que possible après la dissection. Les ovaires, les testicules, les épididymes, les organes sexuels accessoires, et tous les organes des animaux adultes présentant des lésions macroscopiques seront conservés.
64. La glande thyroïde de tous les adultes mâles et femelles ainsi que d’un male et d’une femelle de 13 jours de chaque portée doit être préservée dans le milieu de fixation le plus approprié en vue des examens histopathologiques prévus ultérieurement. Le poids de la thyroïde peut être déterminé après la fixation. L’élimination des tissus adhérents doit également s’opérer avec beaucoup de soin et seulement après la fixation pour éviter d’abîmer les tissus, et par là de compromettre l’analyse d’histopathologie. Des échantillons de sang doivent être prélevés à un endroit spécifié juste avant ou pendant la procédure d’euthanasie des animaux, et stockés dans des conditions appropriées (voir paragraphe 56).
65. En outre, on choisira au hasard au moins cinq mâles et cinq femelles adultes dans chaque groupe (à l’exception de ceux identifiés comme moribonds et/ou euthanasiés avant la fin de l’étude) dont on prélèvera le foie, les reins, les glandes surrénales, le thymus, la rate, le cerveau et le cœur, débarassés de tout tissu adhérent si nécessaire, et seront pesés aussitôt après dissection afin d’éviter toute déshydratation. Les tissus ci-après seront prélevés pour les conserver dans le milieu de fixation le plus approprié, en fonction du type de tissu et des examens histopathologiques que l’on entend effectuer: toutes les lésions importantes, le cerveau (les régions représentatives comportant l’encéphale, le cervelet et la protubérance annulaire), la moelle épinière, l’œil, l’estomac, l’intestin grêle et le gros intestin (y compris les plaques de Peyer), le foie, les reins, les surrénales, la rate, le cœur, le thymus, la trachée et les poumons (qui seront conservés par injection d’un fixateur suivie d’une immersion), les gonades (testicules et ovaires), les organes sexuels accessoires (utérus et col de l’utérus, épididymes, prostate, vésicule séminales et glandes coagulantes), le vagin, la vessie, les ganglions lymphatiques (le ganglion lymphatique le plus proximal et un autre, en fonction de l’expérience du laboratoire(16)), un nerf périphérique (le sciatique ou le tibial) de préférence tout près du muscle, unmuscle squelettique et un os, avec la moelle osseuse (coupe ou à défaut une ponction examinée immédiatement). Il est recommandé de fixer les testicules par immersion dans un fixateur de Bouin ou de Davidson modifié (16) (7) (18); la fixation au formol est déconseillée pour ces tissues. La tunique albuginée peut être perforée en douceur et de façon superficielle aux deux pôles de l’organe avec une aiguille permettant une pénétration rapide du liquide de fixation. Les résultats des observations cliniques et des autres observations pourraient inciter à l’examen d’autres tissus. On devrait également conserver tout autre organe considéré comme étant susceptible d’être un organe cible d’après les propriétés connues du produit chimique d’essai.
66. Les tissus suivants peuvent apporter des informations utiles sur les effets endocriniens: gonades (ovaires et testicules), organes sexuels accessoires (utérus et col de l’utérus, épididymes, vésicules séminales et glande coagulante, prostate dorsolatérale et ventrale), vagin, hypophyse, glande mammaire mâle et glande surrénale. Les changements survenant dans les glandes mammaires mâles n’ont pas encore été insuffisamment documentés, mais ce paramètre peut s’avérer très sensible aux substances à action oestrogénique. L’observation des organes/tissus non cités au paragraphe 65 est facultative.
67. Les petits morts ainsi que ceux qui sont sacrifiés au 13ème jour post partum, ou peu après, doivent être au moins soumis à un examen externe rigoureux visant à déterminer d’éventuelles anomalies flagrantes. Une attention particulière devra être apportée aux organes génitaux reproducteurs externes, pour lesquels on recherchera des signes de modification de leur développement.
Histopathologie
68. On doit effectuer un examen histopathologique approfondi des organes et des tissus conservés et prélevés sur les animaux choisis dans le groupe témoin et dans le groupe exposé à de fortes doses (en mettant l’accent sur les phases de spermatogénèse dans les gonades mâles et sur l’examen histopathologique des structures cellulaires interstitielles des testicules). La glande thyroïde des petits et des animaux adultes restants pourra être examinée si nécessaire. Au cas où l’on observerait des modifications liées au traitement dans le groupe exposé à des doses élevées, il convient d’étendre ces examens à des animaux des autres groupes traités. Le document d’orientation sur l’histopathologie (10) donne plus de détails sur la dissection, la fixation, la section et l’histopathologie des tissues endocriniens.
69. Toutes les lésions importantes doivent être examinées. Afin d’aider à définir la concentration sans effet nocif observé (CSENO), il conviendra d’examiner des organes cibles dans d’autres groupes exposés, en particulier dans les groupes correspondant à des niveaux de dose égaux ou inférieurs à la CSENO.
70. En cas d’utilisation d’un groupe satellite, les examens histopathologiques doivent être effectués sur des tissus et des organes sur lesquels des effets ont été décelés dans les groupes traités.
RESULTATS ET RAPPORT
Résultats
71. Des données individuelles sont à fournir pour chaque animal. Elles doivent en outre être présentées sous la forme d’un tableau indiquant pour chaque groupe étudié le nombre d’animaux au début de l’essai, le nombre d’animaux morts au cours de l’essai ou euthanasiés, ainsi que le moment de la mort ou de l’euthanasie, le nombre d’animaux fertiles, le nombre de femelles gravides, le nombre d’animaux présentant des signes de toxicité, une description des signes de toxicité observés, comprenant le moment du déclenchement, la durée et la gravité des effets toxiques éventuels, les types de modifications histopathologiques, ainsi que toutes les informations dignes d’intérêt concernant les portées. On trouvera à l’annexe 3 un modèle de rapport succinct sous forme de tableau qui s’avère très utile pour l’évaluation des effets sur la reproduction et le développement.
72. Chaque fois que c’est possible, les résultats numériques devraient être évalués au moyen d’une méthode statistique appropriée et généralement acceptée. Les comparaisons de l’effet en fonction de la dose utilisée ne devront pas utiliser de tests-t multiples. Les méthodes statistiques utilisées devraient être choisies lors de la conception de l’étude. L’analyse statistique de la DAG et de persistance du mamelon doit être basée sur les données individuelles des petits, en prenant en compte les effets sur la portée. S’il y a lieu, l’unité d’analyse sera la portée. L’analyse statistique du poids corporel des petits doit être basée sur les données individuelles des petits, en prenant en compte la taille de la portée. Compte tenu de la portée restreinte de l’étude, l’analyse statistique visant à vérifier le caractère significatif des résultats n’a qu’une valeur limitée pour de nombreux effets observés, notamment les effets sur la reproduction. Certaines des méthodes les plus couramment utilisées, notamment les tests paramétriques pour mesurer la tendance centrale sont inappropriées. Si une analyse statistique est réalisée, la méthode retenue doit convenir à la distribution de la variable examinée et doit être arrêtée préalablement à la mise en route de l’étude.
Évaluation des résultats
73. Les résultats de cette étude sur la toxicité doivent être évalués en fonction des effets observés, de l’autopsie et des données microscopiques. L’évaluation portera notamment sur le lien entre, d’une part, la dose du produit chimique d’essai et, d’autre part, la présence ou l’absence, l’incidence et la gravité des anomalies, y compris les lésions grossières, les organes cibles désignés, l’infertilité, les anomalies cliniques, l’action sur la reproduction et les portées, les modifications du poids corporel, les effets sur la mortalité et tout autre effet toxique.
74. La période de traitement du mâle étant de courte durée, l’histopathologie des testicules et des épididymes doit aller de pair avec les données sur la fertilité dans le cadre de l’évaluation des effets sur la reproduction chez le mâle. L’utilisation des données des témoins historiques pour la reproduction/développement (par exemple pour la taille des portées, DAG, persistance du mamelon, taux sériques de T4), pourrait, le cas échéant, s’avérer être une aide utile pour l’interprétation des données.
75. Pour le contrôle de la qualité, il est proposé que les données des témoins historiques soient collectées et que les coefficients de variation soient calculés dans le cas de données numériques, tout particulièrement pour les paramètres en lien avec la détection de perturbateurs endocriniens. Ces données peuvent être utilisées à des fins de comparaison quand les études sont évaluées.
Rapport
76. Le rapport d’essai doit contenir les informations suivantes:
Produit chimique d’essai:
— source, numéro de lot, date limite d’utilisation si c’est disponible;
— stabilité du produit chimique d’essai, si elle est connue.
Substance mono-constituant:
— apparence physique, hydro-solubilité, autres propriétés physico-chimiques importantes pour la conduite de l’étude;
— identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.
Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:
— caractérisés autant que possible par l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence, la quantité et les propriétés physico-chimiques des constituants
.
Véhicule (s’il y a lieu):
— raisons justifiant le choix du véhicule lorsqu’il ne s’agit pas d’eau.
Animaux soumis à l’essai:
— espèce et souche;
— nombre, sexe et âge des animaux;
— origine, conditions d’encagement, type d’alimentation, etc.;
— poids de chaque animal au début de l’essai;
— justification de l’espèce si l’espèce choisie n’est pas le rat.
Conditions de l’essai:
— critères de choix des niveaux de doses;
— précisions concernant la formulation du produit chimique d’essai et de la préparation de l’alimentation, la concentration obtenue, la stabilité et l’homogénéité de la préparation;
— description détaillée de l’administration du produit chimique d’essai;
— conversion de la concentration du produit chimique d’essai dans la nourriture ou l’eau (ppm) en dose effective (mg/kg de poids corporel/jour), le cas échéant;
— précisions concernant la qualité des aliments et de l’eau;
— description détaillée des protocoles de randomisation utilisés pour sélectionner les petits éliminés de la portée, s’il y a eu élimination.
Résultats:
— modifications du poids corporel;
— données relatives à la consommation d’aliments et d’eau, le cas échéant;
— données sur les effets toxiques provoqués en fonction du sexe et de la dose, concernant notamment la fertilité, la gestation et tout autre signe de toxicité;
— durée de la gestation;
— effets toxiques ou autres sur la reproduction, la progéniture, la croissance post-natale, etc.;
— nature, gravité et durée des manifestations cliniques observées (réversibles ou non);
— évaluations de l’activité sensorielle, de la force de préhension et de l’activité motrice;
— analyses de sang et valeurs normales de référence;
— analyses de biochimie clinique et valeurs normales de référence;
— nombre de femelles adultes présentant un cycle œstral normal ou anormal et durée du cycle;
— nombre de petits vivants à la naissance et pertes après implantation;
— nombre de petits présentant des anomalies évidentes, évaluation macroscopique des organes génitaux externes, nombre d’avortons;
— indication du moment de la mort survenue pendant l’étude, ou si l’animal a survécu jusqu’à la fin;
— nombre d’embryons implantés, taille et poids des portées au moment de la consignation de ces données;
— données relatives au poids corporel des petits;
— DAG de tous les petits (et poids corporel le jour de la mesure de la DAG);
— persistance du mamelon chez les petits mâles;
— taux d’hormones thyroïdiennes chez les petits âgés de 13 jours et les mâles adultes (ainsi que chez les mères et chez les petits âgés de 4 jours si cela a été mesuré);
— poids corporel lors du sacrifice et poids des organes des animaux de la génération parentale;
— résultats de l’autopsie;
— description détaillée de l’examen histopathologique;
— données sur l’absorption (si elles sont disponibles);
— traitement statistique des résultats, le cas échéant.
Examen des résultats.
Conclusions.
Interprétation des résultats
77. L’étude permettra d’évaluer la toxicité pour la reproduction et le développement liée à l’administration de doses répétées. Puisque l’accent est mis à la fois sur la toxicité générale et sur les effets toxiques sur la reproduction et le développement, les résultats de l’étude permettront de faire une distinction entre les effets toxiques pour la reproduction et pour le développement se produisant en l’absence de toxicité générale et les effets qui ne s’expriment qu’à des niveaux qui sont également toxiques pour les parents (voir paragraphes 7-11). Elle pourrait aider à déterminer s’il y a lieu d’approfondir les recherches et fournir des orientations pour la conception d’études ultérieures. Le document d’orientation no 43 de l’OCDE devra être consulté pour aider à l’interprétation des résultats liés à la reproduction et au développement (19). Le document d’orientation no 106 de l’OCDE sur l’évaluation histologique des essais endocriniens et de reproduction chez les rongeurs (16) fournit des informations sur la préparation et l’évaluation des organes (endocriniens) et des frottis vaginaux; ces informations peuvent être utiles dans le cadre de la présente méthode d’essai.
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B.65 MÉTHODE D’ESSAI IN VITRO SUR MEMBRANE D’ÉTANCHÉITÉ POUR LA CORROSION CUTANÉE
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice435 (2015) de l’OCDE. La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions irréversibles de la peau, qui se manifestent sous forme de nécroses visibles dans l’épiderme et jusque dans le derme, après application d’un produit chimique d’essai, tel que défini par le Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations-Unies (ONU) (1) et le règlement (CE) no 1272/2008 de l’Union européenne relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges (ci-après le «règlement CLP». Cette méthode d’essai, équivalente à la ligne directrice 435 mise à jour de l’OCDE propose une méthode d’essai in vitro sur membrane d’étanchéité qui peut être utilisée pour identifier les produits chimiques corrosifs. La méthode d’essai emploie une membrane artificielle conçue pour réagir au traitement par des produits chimiques de façon similaire à de la peau d’animaux vivants.
2. La corrosivité cutanée est habituellement évaluée en appliquant le produit chimique testé sur la peau d’animaux vivants et en déterminant l’ampleur de la lésion tissulaire après un intervalle de temps donné (2). Outre la présente méthode d’essai, un certain nombre de méthodes in vitro ont été adoptées comme alternatives (3) (4) à la méthode standard in vivo sur lapin (Chapitre B.4 de la présente annexe, équivalent à la ligne directrice 404) utilisée pour identifier les produits chimiques corrosifs (2). La stratégie d’essai et d’évaluation à plusieurs niveaux du SGH de l’ONU pour l’estimation et la classification de la corrosivité cutanée, ainsi que le document Guide de l’OCDE sur les Approches Intégrées sur les Essais et l’Évaluation (IATA) pour l’irritation et la corrosion de la peau autorise l’utilisation de procédés d’essai in vitro validés et acceptés tels que décrits dans les modules 3 et 4 (1) (5). Le Document guide IATA décrit plusieurs modules qui rassemblent les sources d’information et les outils d’analyse et (i) fournit des orientations sur la façon d’intégrer et d’utiliser les données d’essais et autres données pour l’évaluation du potentiel d’irritation ou de corrosion de la peau des produits chimiques d’essai et (ii) propose une approche quand des essais supplémentaires sont requis, y compris quand des résultats négatifs sont obtenus (5). Grâce à cette approche modulaire, les résultats positifs de méthodes d’essai in vitro peuvent servir à classer un produit chimique dans la catégorie corrosive sans impliquer d’essais sur les animaux, ce qui réduit et optimise l’usage des animaux et évite la douleur et les souffrances infligées aux animaux concernés.
3. Des études de validation du modèle in vitro de membrane d’étanchéité disponible dans le commerce sous l’appellation Corrositex® (6)(7)(8) ont été réalisées, démontrant une précision de 79 % pour la prédiction de la corrosivité de la peau (128/163), une sensibilité de 85 % (76/89), et une spécificité de 70 % (52/74) pour une base de données de 163 produits chimiques (substances et mélanges) (7). Une fois la validité de cette méthode de référence (MRV) reconnue, son utilisation a été recommandée dans le cadre d’une stratégie d’essai à plusieurs niveaux pour évaluer le risque potentiel de corrosion dermique engendré par des produits chimiques (5) (7). Préalablement à l’utilisation d’un modèle in vitro de membrane d’étanchéité pour évaluer la corrosion cutanée à des fins réglementaires, il convient de déterminer sa fiabilité, sa pertinence (précision) et ses limites afin de garantir son équivalence à celle de la MRV (9), en accord avec les standards de performances pré-définis (10). L’acceptation mutuelle des données ne sera garantie qu’après examen et intégration de toute méthode d’essai nouvelle ou actualisée proposée et conforme aux normes de performance dans la méthode d’essai équivalente de l’OCDE. Actuellement, la ligne directrice 435 de l’OCDE et la présente méthode d’essai ne couvrent qu’une seule méthode in vitro: le modèle Corrositex®, disponible dans le commerce.
4. D’autres méthodes pour les essais de corrosion cutanée se basent sur l’utilisation de peau humaine reconstituée (ligne directrice 431 de l’OCDE) (3) et de la peau de rat isolée (ligne directrice 430 de l’OCDE) (4). La présente méthode d’essai permet également de sous-catégoriser les produits chimiques corrosifs en trois sous-catégories du SGH et dans les trois groupes d’emballage ONU pour les transports pour le risque de corrosivité. Cette méthode d’essai a été adoptée initialement en 2006, et mise à jour en 2015 pour faire référence au Document guide IATA, et mettre à jour la liste des substances d’épreuve de compétence.
DÉFINITIONS
5. Les définitions utilisées figurent dans l’appendice.
CONSIDÉRATIONS INITIALES ET LIMITATIONS
6. L’essai décrit dans cette méthode d’essai permet d’identifier les substances et mélanges chimiques corrosifs et de les classer en sous-catégories de substances corrosives conformément au SGH de l’ONU/CLP (tableau 1) (1). Ce procédé d’essai peut également contribuer aux décisions prises sur la corrosivité et la non corrosivité de classes spécifiques de produits chimiques, par exemple, les acides organiques et minéraux, les dérivés acides, et les bases dans certainscas d’essais de transport (7)(11)(12). La présente méthode d’essai décrit un protocole générique similaire à un procédé d’essai de référence validé (7). Si la présente méthode d’essai ne fournit pas de données adéquates pour l’irritation de la peau, il convient de noter en revanche que la méthode d’essai B.46 (équivalente à la méthode d’essai 439 de l’OCDE) concerne spécifiquement l’irritation cutanée in vitro (13). Pour effectuer une évaluation complète des effets locaux sur la peau faisant suite à une exposition cutanée unique, le Document guide no 203 sur IATA doit être consulté (5).
Tableau 1
La catégorie et les sous-catégories de corrosivité cutanée du SGH de l’ONU
| Catégorie de corrosivité (catégorie 1) (pour les autorités qui n’utilisent pas de sous-catégories) | Sous-catégories éventuelles de corrosivité (pour les autorités qui utilisent des sous-catégories, y compris le règlement CLP) | Corrosives chez ≥ 1 sur 3 animaux
| Exposition | Observation
| Corrosive | Sous-catégorie corrosive 1A | ≤ 3 minutes | ≤ 1 heure
| Sous-catégorie corrosive 1B | > 3 minutes / ≤ 1 heures | ≤ 14 jours
| Sous-catégorie corrosive 1C | > 1 heure / ≤ 4 heures | ≤ 14 jours
7. La méthode de référence validée (7) comporte une limite par rapport à de nombreux produits chimiques non-corrosifs et certains produits chimiques corrosifs pour lesquels la méthode ne pourra pas s’appliquer, selon les résultats de l’essai de compatibilité initial (voir paragraphe 13). Les produits chimiques aqueux dont le pH est compris dans l’intervalle de 4,5 à 8,5, se prêtent rarement à l’essai; toutefois, 85 % des produits chimiques d’essai dans cet intervalle de pH n’étaient pas corrosifs dans les essais sur animaux (7). La méthode in vitro sur membrane d’étanchéité peut être utilisée pour tester des matières solides (solubles ou insolubles dans l’eau), des liquides (aqueux ou non aqueux) et des émulsions. Néanmoins, les produits chimiques d’essai qui ne provoquent pas de modifications détectables dans l’essai de compatibilité (c’est-à-dire un changement de couleur dans le système de détection chimique (CDS) du procédé d’essai de référence validé) ne peuvent être testés par la méthode sur membrane d’étanchéité et il faudra donc recourir à d’autres méthodes d’essais.
PRINCIPE DE L’ESSAI
8. Le système d’essai comporte deux éléments, une membrane biologique macromoléculaire synthétique et un CDS; le procédé d’essai est fondé sur la détection par le CDS de dommages provoqués par des produits chimiques d’essai corrosifs sur la membrane d’étanchéité après l’application du produit chimique d’essai sur la surface de la membrane d’étanchéité macromoléculaire synthétique (7), dommages vraisemblablement dus à un ou des mécanismes de corrosion similaire à ceux qui agissent sur la peau vivante.
9. Il convient de mesurer la pénétration de la membrane d’étanchéité (ou sa percée) par plusieurs protocoles ou CDS, en particulier un changement de couleur d’un colorant indicateur de pH ou d’une quelconque autre propriété de la solution indicatrice située sous la barrière.
10. La validité de la membrane d’étanchéité, c’est-à-dire sa pertinence et sa fiabilité, doit être déterminée pour l’utilisation prévue. Il faut ainsi s’assurer que les différentes préparations confèrent effectivement des propriétés d’étanchéité, par exemple, qu’elles sont capables de maintenir une barrière contre des produits chimiques non corrosifs, et aptes à classer des propriétés corrosives des produits chimiques en diverses sous-catégories de corrosivité du SGH de l’ONU (1). La classification attribuée dépend du temps nécessaire à un produit chimique pour pénétrer la membrane d’étanchéité jusqu’à la solution indicatrice.
DÉMONSTRATION DES COMPÉTENCES
11. Avant d’appliquer en routine la méthode in vitro sur membrane d’étanchéité, conformément à la présente méthode d’essai, les laboratoires doivent faire la preuve de leur compétence technique en classifiant correctement les douze produits énumérés au tableau 2. Dans le cas où une substance figurant dans le tableau 2 serait indisponible, où dans d’autres cas où il est justifié de la remplacer par une autre substance (par exemple à partir de la liste de substances de référence (10)), cette autre substance peut être utilisée si des données de référence appropriées in vivo et in vitro sont disponibles, et dans la mesure où les mêmes critères de sélection que ceux décrits sous le tableau 1 sont utilisés.
Tableau 2
Liste des produits chimiques d’épreuve de compétence
| Produit chimique | Numéro CAS | Classe chimique | Sous-Cat. SGH de l’ONU d’après les résultats in vivo | Sous-Cat SGH de l’ONU d’après les résultats in vitro
| Trifluorure de bore dihydraté | 13319-75-0 | acide inorganique | 1A | 1A
| Acide nitrique | 7697-37-2 | acide inorganique | 1A | 1A
| Pentachlorure de phosphore | 10026-13-8 | Précurseur d’acide organique | 1A | 1A
| Chlorure de valeryle | 638-29-9 | Chlorure d’acide | 1B | 1B
| Hydroxyde de sodium | 1310-73-2 | Base inorganique | 1B | 1B
| 1-(2-Aminoethyl) pipérazine | 140-31-8 | Amine aliphatique | 1B | 1B
| Chlorure de benzène-sulfonyle | 98-09-9 | Chlorure d’acide | 1C | 1C
| N,N-diméthyle benzylamine | 103-83-3 | Aniline | 1C | 1C
| Tetraéthylène pentamine | 112-57-2 | Amine aliphatique | 1C | 1C
| Eugénol | 97-53-0 | Phenol | NC | NC
| Acrylate de nonyle | 2664-55-3 | Acrylate/méthacrylates | NC | NC
| Bicarbonate de soude | 144-55-8 | Sel inorganique | NC | NC
PROTOCOLE
12. Les paragraphes suivants proposent une description des composants et des protocoles d’un procédé d’essai sur membrane d’étanchéité artificielle pour l’évaluation de la corrosivité (7) (15), sur la base de la MRV, i.e. la méthode commercialement disponible Corrositex®. La membrane d’étanchéité et les solutions de compatibilité et indicatrices ainsi que les solutions permettant la catégorisation peuvent être produites, préparées ou obtenues dans le commerce, comme dans le cas de la MRV Corrositex®. Un exemple de protocole de procédé d’essai sur échantillon du procédé d’essai de référence validé est disponible (7). L’essai doit être effectué à température ambiante (17-25 °C) et les composants doivent se conformer aux critères suivants.
Essai de compatibilité du produit chimique d’essai
13. Avant de procéder à l’essai sur membrane d’étanchéité, un essai de compatibilité est mis en œuvre afin de déterminer si le produit chimique d’essai est détectable par le CDS. Si ce n’est pas le cas, le procédé d’essai sur membrane d’étanchéité ne convient pas à l’évaluation de la corrosivité potentielle de ce produit chimique d’essai particulier et il conviendra d’utiliser un autre procédé d’essai. Le CDS et les conditions d’exposition employés pour l’essai de compatibilité doivent reproduire l’exposition subie dans le futur essai sur membrane d’étanchéité.
Essai de catégorie d’échelle de temps du produit chimique d’essai
14. Si le procédé d’essai le permet, un produit chimique d’essai qualifié par l’essai de compatibilité peut également subir un essai de catégorie d’échelle de temps, c’est-à-dire un criblage permettant de distinguer entre acides ou bases faibles et forts. Par exemple, dans le procédé d’essai de référence validé, un essai de catégorie d’échelle de temps permet de définir l’une des deux échelles de temps à utiliser selon que l’on détecte une réserve acide ou alcaline significative (pouvoir tampon). Il convient d’utiliser deux échelles de temps de percée différentes pour déterminer la corrosivité et la sous-catégorie de corrosivité cutanée du SGH de l’ONU, en fonction de la réserve acide ou alcaline du produit chimique d’essai.
ÉLÉMENTS DU PROCÉDÉ D’ESSAI SUR MEMBRANE D’ÉTANCHÉITÉ
Membrane d’étanchéité
15. La membrane d’étanchéité comprend deux éléments: un gel aqueux macromoléculaire protéique et une membrane de support perméable. Le gel protéique doit être étanche aux liquides et aux solides, mais susceptible d’être corrodé et perméabilisé. Il convient de stocker la membrane d’étanchéité terminée dans des conditions prédéfinies afin d’éviter la détérioration du gel, par exemple, par séchage, croissance microbienne, déplacement des couches, craquelures, qui pourraient nuire à ses performances. On déterminera une période de stockage acceptable et les préparations de membranes d’étanchéité ne seront plus utilisées au-delà.
16. La membrane de support perméable assure un soutien mécanique au gel protéique pendant le processus de gélification et l’exposition au produit chimique d’essai. La membrane de support doit prévenir tout affaissement ou déplacement du gel et être aisément perméable à tout produit chimique d’essai.
17. Le gel protéique, composé de protéines, par exemple, kératine, collagène ou mélanges de protéines qui forment une matrice de gel, sert de cible pour le produit chimique d’essai. Le matériau protéique est placé sur la surface de la membrane de support et se gélifie avant la pose de la membrane d’étanchéité sur la solution indicatrice. L’épaisseur et la densité du gel protéique doivent être uniformes, et le matériau doit être exempt de bulles d’air et de défauts qui pourraient affecter son intégrité fonctionnelle.
Système de détection chimique (CDS)
18. La solution indicatrice, identique à celle utilisée pour l’essai de compatibilité, doit répondre à la présence d’un produit chimique d’essai. On peut employer un colorant ou une combinaison de colorants indicateurs de pH, par exemple du rouge crésol et de l’orange méthyl, qui change de couleur en présence du produit chimique d’essai. Le système de mesure peut être visuel ou électronique.
19. Il convient d’évaluer la pertinence et la fiabilité des systèmes de détection développés pour détecter le passage du produit chimique testé à travers la membrane d’étanchéité afin de définir la gamme de produits chimiques d’essai susceptible d’être détecté et les limites quantitatives de détection.
MISE EN ŒUVRE DE L’ESSAI
Assemblage des éléments de la méthode d’essai
20. La membrane d’étanchéité est placée dans un flacon (ou un tube) contenant la solution indicatrice de telle sorte que la membrane support soit entièrement au contact de la solution indicatrice en l’absence de toute bulle d’air. On s’assurera du maintien de l’intégrité de la membrane.
Application du produit chimique d’essai
21. Une quantité appropriée du produit chimique d’essai, par exemple 500 μl d’un liquide ou 500 mg d’un solide finement pulvérisé (7), est soigneusement déposée sur la surface supérieure de la membrane d’étanchéité et uniformément répartie. Un nombre approprié de répliques, par exemple quatre (7), est préparé pour chaque produit chimique d’essai et ses témoins correspondants (voir paragraphes 23 à 25). La durée d’application du produit chimique d’essai à la membrane d’étanchéité est notée. Pour garantir un enregistrement précis des courtes durées de corrosion, les durées d’application du produit chimique d’essai dans les flacons des répliques sont échelonnées.
Mesure des pénétrations dans la membrane d’étanchéité
22. Chaque flacon est contrôlé de manière adéquate et le moment auquel intervient le premier changement dans la solution indicatrice, c’est-à-dire la pénétration de la membrane d’étanchéité, est noté, et la durée écoulée entre l’application et la pénétration de la membrane d’étanchéité déterminée.
Contrôles
23. Dans les essais qui requièrent l’utilisation d’un véhicule ou d’un solvant avec le produit chimique d’essai, ceux-ci doivent être compatibles avec le système de membrane d’étanchéité, c’est-à-dire ne pas nuire à l’intégrité du système de membrane d’étanchéité et ne pas modifier la corrosivité du produit chimique d’essai. Le cas échéant, un témoin de solvant (ou de véhicule) sera soumis à l’essai en même temps que le produit chimique testé afin de démontrer la compatibilité du solvant avec le système de membrane d’étanchéité.
24. Il convient également de soumettre simultanément à l’essai le produit chimique d’essai et un produit chimique témoin positif (corrosif) dont l’activité de corrosion est intermédiaire, par exemple, 110±15 mg hydroxyde de sodium (sous-catégorie de corrosivité 1B du SGH de l’ONU) (7), afin de vérifier que les performances du système d’essai sont acceptables. Il peut être utile d’inclure un second témoin positif de même classe chimique que le produit chimique d’essai pour évaluer le potentiel de corrosivité relatif d’un produit chimique d’essai corrosif. On choisira un ou plusieurs témoins positifs de corrosivité intermédiaire (sous-catégorie 1B du SGH de l’ONU) de manière à déterminer des changements de durée de pénétration éventuellement trop longs ou trop courts par rapport à la valeur de référence établie, et qui signalent par conséquent un fonctionnement incorrect du système d’essai. A cette fin, les produits chimiques extrêmement corrosifs (sous-catégorie 1A du SGH de l’ONU) ou non corrosifs n’ont qu’une utilité limitée. Un produit chimique corrosif de sous-catégorie 1B du SGH de l’ONU doit permettre la détection d’une durée de percée trop courte ou trop longue. Il est possible d’employer un produit chimique faiblement corrosif (sous-catégorie 1C du SGH de l’ONU) comme témoin positif pour mesurer l’aptitude du procédé d’essai à distinguer systématiquement les produits chimiques faiblement corrosifs des produits chimiques non corrosifs. Quelle que soit l’approche utilisée, il est nécessaire de définir un intervalle acceptable de réponses des témoins positifs fondé sur l’intervalle historique des durées de percée du ou des témoins positifs employés, par exemple sous la forme moyenne ± 2-3 écarts types. Dans chaque étude, il convient de déterminer la durée de percée exacte du témoin positif de manière à pouvoir détecter des écarts hors de l’intervalle acceptable.
25. On testera également un témoin négatif (non corrosif), par exemple acide citrique 10 %, acide propionique 6 % (7), parallèlement au produit chimique d’essai pour obtenir une mesure de contrôle de qualité supplémentaire démontrant l’intégrité fonctionnelle de la membrane d’étanchéité.
Critères d’acceptabilité de l’étude
26. Conformément aux paramètres de durée établis pour chaque sous-catégorie de corrosivité du SGH de l’ONU, la durée (en minutes) écoulée entre l’application du produit chimique d’essai sur la membrane d’étanchéité et la pénétration de la membrane est utilisée pour prédire la corrosivité du produit chimique d’essai. Pour qu’une étude soit jugée acceptable, le témoin positif correspondant doit donner la durée de réponse de pénétration attendue (par exemple 8-16 min. de temps de pénétration pour l’hydroxyde de soude si cette substance est utilisée comme témoin positif), le témoin négatif correspondant ne doit pas être corrosif et, le témoin de solvant correspondant éventuellement ne doit pas présenter de corrosivité ni altérer le potentiel de corrosivité du produit chimique d’essai. Avant d’introduire l’utilisation en routine d’une méthode conforme à la présente méthode d’essai, les laboratoires devront démontrer leur compétence technique à l’aide des 12 substances recommandées dans le tableau 2. Dans le cas des nouvelles méthodes similaires développées dans le cadre de cette méthode d’essai, qui sont structurellement et fonctionnellement similaires à la méthode de référence validée (14), les normes de performance pré-définies décrites seront utilisées pour démontrer la fiabilité et la précision de la nouvelle méthode avant son application aux essais réglementaires (10).
Interprétation des résultats et classification de corrosivité des produits chimiques d’essai
27. La durée (en minutes) écoulée entre l’application du produit chimique d’essai à la membrane d’étanchéité et la pénétration de la membrane est utilisée pour classer le produit chimique d’essai en sous-catégories de corrosivité selon le SGH de l’ONU (1) et, le cas échéant, dans un groupe d’emballage ONU (16). Les valeurs de durée limites de chacune des trois sous-catégories de corrosivité sont définies pour chaque procédé d’essai proposé. Les décisions ultimes d’établissement des durées limites seront adoptées en s’efforçant de limiter le plus possible la sous-classification du danger de corrosion (c’est-à-dire des faux négatifs). Dans la présente méthode d’essai, les temps limites de la méthode Corrositex® tels que décrits dans le tableau 3 doivent être utilisés car cette méthode est actuellement la seule qui relève de la ligne directrice (7).
Tableau 3
Modèle de prédiction de Corrositex®
| Temps de pénétration moyen (min). | Prédiction selon le SGH de l’ONU
| Produits chimiques d’essai de catégorie 1 (déterminée par le test de catégorisation de la méthode | Produits chimiques d’essai de catégorie 2 (déterminée par le test de catégorisation de la méthode)
| 0-3 min. | 0-3 min. | Corrosif, sous-catégorie 1A optionnelle
| > 3 à 60 min. | > 3 à 30 min. | Corrosif, sous-catégorie 1B optionnelle
| > 60 à 240 min. | > 30 à 60 min. | Corrosif, sous-catégorie 1C optionnelle
| > 240 min. | > 60 min. | Non corrosif
RÉSULTATS ET RAPPORTS
Résultats
28. La durée (en minutes) écoulée entre l’application et la pénétration de la membrane par le produit chimique d’essai et le ou les témoins positifs est rapportée sous forme de tableaux contenant les résultats individuels de chaque réplique et la moyenne ± écart type pour chaque essai.
Rapport d’essai
29. Le rapport d’essai doit contenir les informations suivantes:
Produit chimique d’essai et substances témoins:
— Identification chimique: désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro(s) CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale et/ou autres identifiants, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent;
— Caractérisation, dans la mesure du possible, par exemple par l’identité chimique (voir ci-dessus), la pureté, les caractéristiques quantitatives et les propriétés physico-chimiques pertinentes (voir ci-dessus) des constituants, selon les données disponibles;
— Apparence physique, hydrosolubilité, solubilité dans le DMSO et autres propriétés physico-chimiques pertinentes, selon les données disponibles;
— Source et numéro de lot si disponible;
— Traitement du produit chimique d’essai ou de la substance témoin avant la conduite de l’essai, s’il y a lieu (par exemple chauffage, broyage);
— Stabilité du produit chimique d’essai, date de péremption, ou date de vérification analytique si disponible;
— Conditions de stockage.
Véhicule:
— Identification, concentration (s’il y a lieu), volume utilisé;
— Justification pour le choix du véhicule.
Modèle de membrane d’étanchéité in vitro et protocole utilisés, y compris précision et fiabilité démontrées
Conditions d’essais:
— description de l’appareil et des protocoles de préparation utilisés;
— source et composition de la membrane d’étanchéité in vitro utilisée;
— composition et propriétés de la solution indicatrice;
— méthode de détection;
— quantités de produit chimique d’essai et de substances témoins;
— nombre de répliques;
— description et justification de l’essai de catégorisation d’échelle de temps;
— méthode d’application;
— durées d’observation.
— description de l’évaluation de des critères de classification appliqués;
— démonstration de la compétence dans la mise en œuvre de la méthode d’essai avant son utilisation routinière au moyen des substances d’épreuve de compétence.
Résultats:
— présentation sous forme de tableau des données brutes individuelles issues de chaque échantillon d’essai et de contrôle individuel pour chaque réplique;
— descriptions des autres effets observés;
— classification obtenue en lien avec le modèle prédictif/les critères de décision employés.
Discussion des résultats
Conclusions
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(14) U.S. EPA (1996). Method 1120, Dermal Corrosion. Disponible à l’adresse: http://www.epa.gov/osw/hazard/testmethods/sw846/pdfs/1120.pdf.
(15) Nations Unies (UN) (2013). Recommandations relatives au transport des marchandises dangereuses des Nations unies, règlements types, 18e édition révisée (Partie, Chapitre 2.8), Nations Unies, 2013. Disponible à l’adresse: http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/unrec/rev18/English/Rev18_Volume1_Part2.pdf.
B.66 ESSAIS IN VITRO DE TRANSACTIVATION PAR TRANSFECTION STABLE VISANT LA DÉTECTION DES SUBSTANCES AGONISTES ET ANTAGONISTES DES RÉCEPTEURS DES ŒSTROGÈNES
INTRODUCTION GÉNÉRALE
Ligne directrice d’essai de l’OCDE axée sur la performance
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 455 (2016) de l’OCDE. La ligne directrice 455 pour les essais de produits chimiques est axée sur la performance (LDAP) et décrit la méthodologie des essais in vitro de transactivation par transfection stable visant la détection des substances agonistes et antagonistes des récepteurs des œstrogènes (essais de TA ER). Elle comprend plusieurs essais structurellement et fonctionnellement similaires pour détecter les substances agonistes et antagonistes des récepteurs des œstrogènes (ERα et/ou ERβ), et devrait faciliter le développement de nouveaux essais similaires ou modifiés, conformément aux principes de validation exposés dans le document d’orientation de l’OCDE intitulé«Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment» (1). Les méthodes d’essai de référence totalement validées (appendices 2 et 3) qui sont à la base de la présente méthode d’essai axée sur la performance sont les suivantes:
— Essai de TA par transfection stable (essai STTA) faisant appel à la lignée cellulaire hERα-HeLa-9903 (2); et
— Essai de TA ER VM7Luc (3) faisant appel à la lignée cellulaire VM7Luc-4E2 qui exprime principalement hERα, et pour partie hERβ (4) (5).
Des normes de performance (6) (7) sont disponibles pour l’élaboration et la validation d’essais similaires visant le même danger/effet, et elles permettent de modifier la LDAP 455 en temps utile par l’ajout de nouveaux essais similaires. Toutefois, l’ajout de tels nouveaux essais similaires n’est possible qu’après examen et vérification, par l’OCDE, du respect des normes de performance. Les essais inclus dans la ligne directrice 455 peuvent être utilisés, sans discrimination, pour répondre aux exigences des pays membres de l’OCDE en matière d’essai de TA ER, dans le cadre du système d’Acceptation mutuelle de données de l’OCDE.
Contexte et principes des essais inclus dans la présente méthode d’essai
2. L’OCDE a lancé en 1998 une activité à caractère hautement prioritaire visant à réviser les lignes directrices existantes ou à établir de nouvelles lignes directrices concernant la détection et les essais de produits chimiques susceptibles d’avoir des effets perturbateurs sur le système endocrinien. Le Cadre conceptuel de l’OCDE pour les essais et l’évaluation des perturbateurs endocriniens (CC) a été révisé en 2012. Les versions originale et révisée de ce CC figurent en tant qu’annexes dans le document d’orientation de l’OCDE sur les lignes directrices normalisées pour évaluer l’effet perturbateur des produits chimiques sur le système endocrinien (8). Le CC comprend cinq niveaux, chacun d’entre eux correspondant à un degré différent de complexité biologique. Les essais de TA ER décrits dans la présente méthode d’essai correspondent au niveau 2, qui couvre «les essais in vitro fournissant des données sur certains mécanismes et voies d’activité endocrinienne». La présente méthode d’essai concerne les essais in vitro de transactivation (TA) conçus pour la détection des substances agonistes et antagonistes des récepteurs des œstrogènes (ER).
3. L’interaction des œstrogènes et des récepteurs des oestrogènes (ER) peut affecter la transcription des gènes régulés par les œstrogènes, ce qui est susceptible d’entraîner l’induction ou l’inhibition de processus cellulaires, notamment les mécanismes nécessaires à la prolifération cellulaire, au développement normal du fœtus et aux fonctions reproductives (9) (10) (11). La perturbation des systèmes œstrogéniques normaux pourrait déclencher des troubles du développement (ontogenèse) et nuire à la santé génésique et à l’intégrité du système reproductif.
4. Les essais in vitro de TA sont fondés sur une interaction directe ou indirecte entre les substances chimiques et un récepteur spécifique qui régule la transcription du produit d’un gène rapporteur. Ces essais sont largement utilisés pour évaluer l’expression génique régulée par des récepteurs nucléaires particuliers, comme les ER (12) (13) (14) (15) (16). Ils sont proposés pour détecter la transactivation œstrogénique régulée par ER (17) (18) (19). Il existe au moins deux grands sous-types de ER nucléaires, désignés α et β, qui sont encodés par des gènes distincts. Les protéines correspondantes présentent des distributions tissulaires, des affinités de liaison avec les ligands et des fonctions biologiques propres différentes (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26). Les ERα nucléaires sont les médiateurs de la réponse œstrogénique classique (27) (28) (29) (30), c’est pourquoi la plupart des modèles de mesure de l’activation ou de l’inhibition des ER actuellement en cours de développement sont spécifiques aux ERα. Ces essais servent à détecter les substances chimiques qui activent (ou inhibent) les ER par la liaison du ligand au récepteur. Lecomplexe récepteur-ligand se fixe ensuite à certains éléments de réponse de l’ADN et transactive ainsi le gène rapporteur, induisant une augmentation de l’expression cellulaire d’un marqueur protéique. Ces essais s’appuient sur diverses réponses des gènes rapporteurs. Dans les systèmes faisant appel à la luciférase, l’enzyme luciférase transforme son substrat, la luciférine, en produit bioluminescent mesurable quantitativement à l’aide d’un luminomètre. Parmi les exemples de marqueurs fréquents figurent aussi une protéine fluorescente, ainsi que le gène LacZ qui encode la β-galactosidase, une enzyme qui transforme un substrat incolore, le X-gal (5-bromo-4-chloro-indolylgalactopyranoside) en produit bleu quantifiable au moyen d’un spectrophotomètre. Ces marqueurs peuvent être évalués rapidement et à faible coût à l’aide des nombreux kits d’essai disponibles dans le commerce.
5. Les études de validation des méthodes de STTA et de TA VM7Luc ont démontré la pertinence et la fiabilité de ces essais aux fins prévues (3) (4) (5) (30). Les normes de performance des essais de TA ER fondés sur la luminescence et utilisant des lignées cellulaires de glandes mammaires sont inclus dans le rapport d’évaluation de l’ICCVAM intitulé «ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals» (3). Ces normes ont été modifiées en vue d’être applicables aux deux essais STTA et VM7Luc (2).
6. Les définitions et abréviations utilisées dans la présente méthode d’essai sont présentées à l’appendice 1.
Portée et limites des essais de transactivation
7. Ces essais sont proposés à des fins de criblage et de priorisation, mais ils peuvent aussi livrer des informations sur les mécanismes d’action pouvant être utilisées dans le cadre d’une approche fondée sur le poids de la preuve. Ils s’appuient sur la TA induite par l’établissement d’une liaison chimique avec les ER dans un système in vitro. Aussi ne convient-il pas que les résultats obtenus soient directement extrapolés aux mécanismes complexes de signalisation et de régulation qui caractérisent un système endocrinien intact in vivo.
8. La TA médiée par les ER est considérée comme l’un des mécanismes clés de la perturbation endocrinienne (PE), bien que d’autres processus aient les mêmes effets, notamment (i) les interactions avec d’autres récepteurs et systèmes enzymatiques du système endocrinien, (ii) la synthèse hormonale (iii) l’activation et/ou l’inactivation métaboliques des hormones, (iv) la distribution hormonale vers les tissus cibles, et (v) l’élimination des hormones de l’organisme. Aucun des essais relevant de la présente méthode d’essai ne porte sur ces modes d’action.
9. La présente méthode d’essai porte sur l’aptitude des produits chimiques à activer (activité agoniste) et aussi à inhiber (activité antagoniste) la transcription régulée par les ER. Certains produits chimiques peuvent, selon le type cellulaire utilisé, présenter à la fois une activité agoniste et antagoniste, ils sont connus sous la dénomination de modulateurs sélectifs des récepteurs des oestrogènes (MSRE). On peut envisager de soumettre les produits chimiques dont la réponse est négative dans les essais étudiés ici à un essai de liaison aux ER, avant de pouvoir conclure qu’ils ne se lient pas aux récepteurs. En outre, ces essais ne livrent qu’une indication probable de l’activité de la molécule parente, compte tenu des capacités métaboliques limitées des systèmes cellulaires in vitro. Étant donné que l’étude de validation n’a porté que sur des substances isolées, il n’existe aucune information quant à l’applicabilité de l’essai aux mélanges. Cette méthode d’essai est néanmoins théoriquement applicable pour tester des substances multi-constituants, des substances UVCB et des mélanges. Avant d’utiliser la méthode d’essai sur une substance multi-constituants, une substance UVCB ou un mélange en vue de générer des données à des fins réglementaires, il convient d’examiner si, et le cas échéant pourquoi, ladite méthode peut fournir des résultats adéquats aux fins visées. Ces questions ne se posent pas quand la réglementation exige de réaliser l’essai sur le mélange.
10. À titre d’information, le tableau 1 fournit les résultats de l’essai agoniste des 34 substances testées avec les deux méthodes de référence entièrement validées décrites dans la présente méthode d’essai. Parmi ces substances, 26 sont définitivement classées comme agonistes des ER et 8 comme négatives d’après les rapports publiés, notamment sur les essais in vitro de liaison aux ER et de TA et/ou les essais utérotrophiques (2) (3) (18) (31) (32) (33) (34). Le tableau 2 fournit les résultats de l’essai antagoniste des 15 substances testées avec les deux méthodes de référence entièrement validées décrites dans la présente méthode d’essai. Parmi ces substances, 4 sont définitivement/probablement classées comme antagonistes des ER et 10 comme négatives d’après les rapports publiés, notamment sur les essais in vitro de liaison aux ER et de TA (2) (3) (18) (31). S’agissant des données résumées dans les tableaux 1 et 2, les deux méthodes de référence ont abouti aux mêmes conclusions pour l’ensemble des substances à l’exception de l’une d’elles (Mifepristone) pour l’essai antagoniste, et chaque substance a été classée correctement comme agoniste/antagoniste des ER ou comme négative. D’autres renseignements sur ce groupe de produits chimiques ainsi que sur les produits chimiques supplémentaires testés dans les essais de STTA et de TA ER VM7Luc dans le cadre des études de validation sont fournis dans les normes de performance pour les essais de TA ER (6) (7), appendice 2 (tableaux 1, 2 et 3).
Tableau 1
Vue d’ensemble des résultats des essais de STTA et de TA ER VM7Luc obtenus pour les substances testées selon les deux méthodes agonistes et classées comme agonistes des ER (Pos.) ou négatifs (Nég.)
Abréviations: No CAS = Numéro d’enregistrement au Chemical Abstracts Service; M = molaire; CE50 = concentration efficace de la substance d’essai induisant une réponse égale à la moitié de la réponse maximale; Nég. = négative; Pos. = positive; NT: non testé; TP10 (et TP50) = concentration de la substance d’essai pour laquelle l’activité est égale à 10 % (ou 50 % pour la TP50) de l’activité maximale induite par le témoin positif (E2 à 1 nm), dans chaque plaque.
| | Substance | No CAS | Essai STTA | Essai de TA ER VM7Luc | Source des données pour la classification
| Activité de TA ER | TP10 (M) | TP50 (M) | Activité de TA ER | TP10, (M) | TP50 (M) | |
| 1 | 17-ß-œstradiol | 50-28-2 | Pos | < 1,00 × 10-11 | < 1,00 × 10-11 | Pos | 5,63 × 10-12 | Pos (227/227) | Pos | Pos
| 2 | 17-α œstradiol | 57-91-0 | Pos | 7,24 × 10-11 | 6,44 × 10-10 | Pos | 1,40 × 10-9 | Pos(11/11) | Pos | Pos
| 3 | 17-α-éthinylestradiol | 57-63-6 | Pos | < 1,00 × 10-11 | < 1,00 × 10-11 | Pos | 7,31 × 10-12 | Pos(22/22) | Pos | Pos
| 4 | 17-β-trenbolone | 10161-33-8 | Pos | 1,78 × 10-8 | 2,73 × 10-7 | Pos | 4,20 × 10-8 | Pos (2/2) | NT | NT
| 5 | 19-nortestostérone | 434-22-0 | Pos | 9,64 × 10-9 | 2,71 × 10-7 | Pos | 1,80 × 10-6 | Pos(4/4) | Pos | Pos
| 6 | 4-cumylphénol | 599-64-4 | Pos | 1,49 × 10-7 | 1,60 × 10-6 | Pos | 3,20 × 10-7 | Pos(5/5) | Pos | NT
| 7 | 4-tert-octylphénol | 140-66-9 | Pos | 1,85 × 10-9 | 7,37 × 10-8 | Pos | 3,19 × 10-8 | Pos(21/24) | Pos | Pos
| 8 | Apigénine | 520-36-5 | Pos | 1,31 × 10-7 | 5,71 × 10-7 | Pos | 1,60 × 10-6 | Pos(26/26) | Pos | NT
| 9 | Atrazine | 1912-24-9 | Nég | — | — | Nég | — | Nég (30/30) | Nég | NT
| 10 | Bisphénol A | 80-05-7 | Pos | 2,02 × 10-8 | 2,94 × 10-7 | Pos | 5,33 × 10-7 | PoS (65/65) | Pos | Pos
| 11 | Bisphénol B | 77-40-7 | Pos | 2,36 × 10-8 | 2,11 × 10-7 | Pos | 1,95 × 10-7 | Pos(6/6) | Pos | Pos
| 12 | Phtalate de butyle et de benzyle | 85-68-7 | Pos | 1,14 × 10-6 | 4,11 × 10-6 | Pos | 1,98 × 10-6 | Pos(12/14) | Pos | Nég
| 13 | Corticostérone | 50-22-6 | Nég | — | — | Nég | — | Nég(6/6) | Nég | NT
| 14 | Coumestrol | 479-13-0 | Pos | 1,23 × 10-9 | 2,00 × 10-8 | Pos | 1,32 × 10-7 | Pos(30/30) | Pos | NT
| 15 | Daidzéine | 486-66-8 | Pos | 1,76 × 10-8 | 1,51 × 10-7 | Pos | 7,95 × 10-7 | Pos(39/39) | Pos | Pos
| 16 | Diéthylstilbestrol | 56-53-1 | Pos | < 1,00 × 10-11 | 2,04 × 10-11 | Pos | 3,34 × 10-11 | Pos(42/42) | Pos | NT
| 17 | Phtalate de dibutyle | 84-74-2 | Pos | 4,09 × 10-6 | | Pos | 4,09 × 10-6 | Pos(6/11) | Pos | Nég
| 18 | Éthylparaben | 120-47-8 | Pos | 5,00 × 10-6 | (pas de TP50) | Pos | 2,48 × 10-5 | Pos | | NT
| 19 | Œstrone | 53-16-7 | Pos | 3,02 × 10-11 | 5,88 × 10-10 | Pos | 2,34 × 10-10 | Pos(26/28) | Pos | Pos
| 20 | Génistéine | 446-72-0 | Pos | 2,24 × 10-9 | 2,45 × 10-8 | Pos | 2,71 × 10-7 | Pos(100/102) | Pos | Pos
| 21 | Halopéridol | 52-86-8 | Nég | — | — | Nég | — | Nég (2/2) | Nég | NT
| 22 | Kaempférol | 520-18-3 | Pos | 1,36 × 10-7 | 1,21 × 10-6 | Pos | 3,99 × 10-6 | Pos(23/23) | Pos | NT
| 23 | Képone | 143-50-0 | Pos | 7,11 × 10-7 | 7,68 × 10-6 | Pos | 4,91 × 10-7 | Pos(14/18) | Pos | NT
| 24 | Kétoconazole | 65277-42-1 | Nég | — | — | Nég | — | Nég (2/2) | Nég | NT
| 25 | Linuron | 330-55-2 | Nég | — | — | Nég | — | Nég (8/8) | Nég | NT
| 26 | méso-hexestrol | 84-16-2 | Pos | < 1,00 × 10-11 | 2,75 × 10-11 | Pos | 1,65 × 10-11 | Pos(4/4) | Pos | NT
| 27 | Méthyltestostérone | 58-18-4 | Pos | 1,73 × 10-7 | 4,11 × 10-6 | Pos | 2,68 × 10-6 | Pos(5/6) | Pos | NT
| 28 | Morine | 480-16-0 | Pos | 5,43 × 10-7 | 4,16 × 10-6 | Pos | 2,37 × 10-6 | Pos(2/2) | Pos | NT
| 29 | Noréthynodrel | 68-23-5 | Pos | 1,11 × 10-11 | 1,50 × 10-9 | Pos | 9,39 × 10-10 | Pos(5/5) | Pos | NT
| 30 | p,p’-méthoxychlore | 72-43-5 | Pos | 1,23 × 10-6 | (pas de TP50)b | Pos | 1,92 × 10-6 | Pos(24/27) | Pos | Pos
| 31 | Phénobarbital | 57-30-7 | Nég | — | — | Nég | — | Nég(2/2) | Nég | NT
| 32 | Réserpine | 50-55-5 | Nég | — | — | Nég | — | Nég(4/4) | Nég | NT
| 33 | Spironolactone | 52-01-7 | Nég | — | — | Nég | — | Nég(4/4) | Nég | NT
| 34 | Testostérone | 58-22-0 | Pos | 2,82 × 10-8 | 9,78 × 10-6 | Pos | 1,75 × 10-5 | Pos(5/10) | Pos | NT
Tableau 2
Comparaison des résultats des essais de STTA et de TA ER VM7Luc obtenus pour les substances testées selon les deux méthodes antagonistes et classées comme antagonistes des ER (Pos.) ou négatifs (Neg.)
Abréviations: No CAS = Numéro d’enregistrement au Chemical Abstracts Service; M = molaire; CI50 = concentration induisant la moitié de l’inhibition maximale; Nég. = négative; PN = présumée négative; Pos. = positive; PP = présumée positive.
| | Substance | No CAS | Essai ER STTA | Essai de TA ER VM7Luc | ER STTA réponses attendues | ICCVAM Consensus de classification | Classe chimique dans le système MeSH | Type de produit
| Activité de TA ER | CI50 (M) | Activité de TA ER | CI50, (M)
| 1 | 4-hydroxytamoxifène | 68047-06-3 | Pos. | 3,97 × 10-9 | Pos. | 2,08 × 10-7 | Pos. modéré | Pos. | Hydrocarbure (Cyclique) | Produit pharmaceutique
| 2 | Dibenzo[a.h] anthracène | 53-70-3 | Pos. | No IC50 | Pos. | No IC50 | Pos. | PP | Composé polycyclique | Produit chimique de laboratoire, produit naturel
| 3 | Mifépristone | 84371-65-3 | Pos. | 5,61 × 10-6 | Nég. | — | faiblement Pos. | Nég. | Stéroïde | Produit pharmaceutique
| 4 | Raloxifène HCl | 82640-04-8 | Pos. | 7,86 × 10-10 | Pos. | 1,19 × 10-9 | Pos. modéré | Pos. | Hydrocarbure (Cyclique) | Produit pharmaceutique
| 5 | Tamoxifène | 10540-29-1 | Pos. | 4,91 × 10-7 | Pos. | 8,17 × 10-7 | Pos. | Pos. | Hydrocarbure (Cyclique) | Produit pharmaceutique
| 6 | 17-ß-œstradiol | 50-28-2 | Nég. | — | Nég. | — | PN | PN | Stéroïde | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 7 | Apigénine | 520-36-5 | Nég. | — | Nég. | — | Nég. | Nég. | Composé hétérocyclique | Colorant, produit naturel, intermédiaire de synthèse pharmaceutique
| 8 | Atrazine | 1912-24-9 | Nég. | — | Nég. | — | Nég. | PN | Composé hétérocyclique | Herbicide
| 9 | Di-n-butyl phtalate | 84-74-2 | Nég. | — | Nég. | — | Nég. | Nég. | Ester, Acide phtalique | Ingrédient cosmétique, produit chimique industriel, plastifiant
| 10 | Fénarimol | 60168-88-9 | Nég. | — | Nég. | — | Non testé | PN | Composé hétérocyclique, Pyrimidine | Fongicide
| 11 | Flavone | 525-82-6 | Nég. | — | Nég. | — | PN | PN | Flavonoïde, Composé hétérocyclique | Produit naturel, produit pharmaceutique
| 12 | Flutamide | 13311-84-7 | Nég. | — | Nég. | — | Nég. | PN | Amide | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 13 | Génistéine | 446-72-0 | Nég. | — | Nég. | — | PN | Nég. | Flavonoïde, Composé hétérocyclique | Produit naturel, produit pharmaceutique
| 14 | p-n-nonylphenol | 104-40-5 | Nég. | — | Nég. | — | Non testé | Nég. | Phénol | Intermédiaire chimique
| 15 | Resvératrol | 501-36-0 | Nég. | — | Nég. | — | PN | Nég. | Hydrocarbure (Cyclique) | Produit naturel
ÉLÉMENTS DE L’ESSAI DE TA ER
Éléments essentiels de l’essai
11. La présente méthode d’essai s’applique aux essais faisant appel à un ERα transfecté de façon stable ou endogène, et une chimère de gène rapporteur transfectée de façon stable et régulée par un ou plusieurs éléments de réponse aux œstrogènes; d’autres récepteurs, comme ERβ, peuvent toutefois être présents. Ces éléments constituent l’essence des essais visés.
Témoins
12. Les raisons qui ont amené à proposer les étalons de référence pour l’essai agoniste et antagoniste sont décrites. Les témoins simultanément inclus dans l’essai (négatif, solvant et positif) selon le cas servent à indiquer que l’essai fonctionne dans les conditions expérimentales, et permettent de comparer les expériences. Ainsi, pour une expérience donnée, les témoins sont généralement pris en compte dans les critères d’acceptabilité (1).
Procédures standard de contrôle de qualité
13. Il convient de suivre les procédures standard de contrôle de qualité décrites pour chaque essai afin de garantir que la lignée cellulaire reste stable au cours des multiples passages, demeure exempte de mycoplasmes (c’est-à-dire exempte de contamination bactérienne), et conserve sa capacité à fournir les réponses médiées par les ER attendues au fil du temps. Par ailleurs, l’identité exacte des lignées cellulaires est vérifiée, ainsi que la présence d’autres contaminants (p. ex. moisissures, levures et virus).
Démonstration de la compétence du laboratoire
14. Avant de tester des produits chimiques inconnus par l’un des essais relevant de la présente méthode d’essai, il convient que chaque laboratoire démontre sa capacité à mettre en œuvre l’essai. Pour démontrer cette capacité, il convient que chaque laboratoire teste les 14 substances d’épreuve de compétence indiquées dans le tableau 3 pour l’essai agoniste et les 10 substances d’épreuve de compétence indiquées dans le tableau 4 pour l’essai antagoniste. Cette démonstration de la compétence permet également de confirmer la réactivité du système d’essai. La liste des substances d’épreuve de compétence constitue une sous-catégorie des substances de référence indiquées dans les normes de performance des essais de TA ER (6). Ces substances sont disponibles dans le commerce, représentent les classes de produits chimiques communément associées à une activité œstrogénique agoniste ou antagoniste, manifestent une gamme d’activité correspondant aux puissances attendues pour l’effet agoniste ou antagoniste des ER (de faible à forte), et incluent des substances négatives. Ces substances d’épreuve de compétence sont testées au moins deux fois, à des jours différents. La compétence est démontrée lorsque chaque substance d’épreuve de compétence est correctement classée (réponse positive/négative). L’épreuve de compétence est répétée par chaque technicien dans le cadre de la formation aux essais. Selon le type cellulaire, certaines de ces substances d’épreuve peuvent se comporter comme des MSRE et présenter à la fois une activité agoniste et antagoniste. Cependant, dans les tableaux 3 et 4, les substances d’épreuve sont classées par leur activité connue pour être prépondérante; c’est celle qui sera utilisée pour l’évaluation de la capacité à mettre en œuvre la méthode d’essai.
15. Pour démontrer la performance et dans un but de contrôle de la qualité, il convient que chaque laboratoire établisse des bases de données agonistes et antagonistes avec les données des étalons de référence (par exemple le 17β-estradiol et le tamoxifène), des substances témoins positives et négatives et du solvant témoin (par exemple DMSO). Au début, la base de données est générée à partir d’au moins 10 épreuves agonistes indépendantes (par exemple 17β-estradiol) et 10 épreuves antagonistes indépendantes (par exemple tamoxifène). Il convient d’ajouter les résultats de l’analyse ultérieure de ces étalons de référence et témoin solvant pour élargir la base de données et permettre de s’assurer de la compétence et de la performance du bio-essai par le laboratoire au cours du temps.
Tableau 3
Liste des (14) substances d’épreuve de compétence pour l’essai agoniste
Abbreviations: CASRN = Chemical Abstracts Service Registry Number; EC50 = half maximal effective concentration of test substance; NÉG = Négative; POS = Positive; PC10 (and PC50) = the concentration of a test substance at which the response is 10 % (or 50 % for PC50) of the response induced by the Positive control (E2, 1nM) in each plate.
| No | Substance | No CAS | Réponse attendue | Essai STTA | Essai de TA ER VM7Luc | Classe chimique dans le système MeSH | Type de produit
| TP10 (M) | TP50 (M) | Fourchette de concentrations de l’essai (M) | CE50 pour VM7Luc (M) | Concen-tration maximale pour l’essai prélimi-naire (M)
| 14 | Diéthylstilbestrol | 56-53-1 | Pos. | < 1,00 × 10-11 | 2,04 × 10-11 | 10-14 – 10-8 | 3,34 × 10-11 | 3,73 × 10-4 | Hydrocarbure (cyclique) | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 12 | 17STARTSYMBOLFONTF0B5ENDSYMBOLFONT-œstradiol | 57-91-0 | Pos. | 4,27 × 10-11 | 6,44 × 10-10 | 10-11 – 10-5 | 1,40 × 10-9 | 3,67 × 10-3 | Stéroïde | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 15 | méso-hexestrol | 84-16-2 | Pos. | < 1,00 × 10-11 | 2,75 × 10-11 | 10-11 – 10-5 | 1,65 × 10-11 | 3,70 × 10-3 | Hydrocarbure (cyclique), phénol | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 11 | 4-tert-octylphénol | 140-66-9 | Pos. | 1,85 × 10-9 | 7,37 × 10-8 | 10-11 – 10-5 | 3,19 × 10-8 | 4,85 × 10-3 | Phénol | Intermédiaire chimique
| 9 | Génistéine | 446-72-0 | Pos. | 2,24 × 10-9 | 2,45 × 10-8 | 10-11 – 10-5 | 2,71 × 10-7 | 3,70 × 10-4 | Flavonoïde, composé hétérocyclique | Produit naturel et pharmaceutique
| 6 | Bisphénol A | 80-05-7 | Pos. | 2,02 × 10-8 | 2,94 × 10-7 | 10-11 – 10-5 | 5,33 × 10-7 | 4,38 × 10-3 | Phénol | Intermédiaire chimique
| 2 | Kaempférol | 520-18-3 | Pos. | 1,36 × 10-7 | 1,21 × 10-6 | 10-11 – 10-5 | 3,99 × 10-6 | 3,49 × 10-3 | Flavonoïde, composé hétérocyclique | Produit naturel
| 3 | Phtalate de butyle et de benzyle | 85-68-7 | Pos. | 1,14 × 10-6 | 4,11 × 10-6 | 10-11 – 10-5 | 1,98 × 10-6 | 3,20 × 10-4 | Acide carboxylique, ester, acide phtalique | Plastifiant, produit chimique industriel
| 4 | p,p’-méthoxychlore | 72-43-5 | Pos. | 1,23 × 10-6 | — | 10-11 – 10-5 | 1,92 × 10-6 | 2,89 × 10-3 | Hydrocarbure (halogéné) | Pesticide, produit vétérinaire
| 1 | Éthylparaben | 120-47-8 | Pos. | 5,00 × 10-6 | — | 10-11 – 10-5 | 2,48 × 10-5 | 6,02 × 10-3 | Acide carboxylique, phénol | Produit pharmaceutique, conservateur
| 17 | Atrazine | 1912-24-9 | Nég. | — | — | 10-10 – 10-4 | — | 4,64 × 10-4 | Composé hétérocyclique | Herbicide
| 20 | Spironolactone | 52-01-7 | Nég. | — | — | 10-11 – 10-5 | — | 2,40 × 10-3 | Lactone, stéroïde | Produit pharmaceutique
| 21 | Kétoconazole | 65277-42-1 | Nég. | — | — | 10-11 – 10-5 | — | 9,41 × 10-5 | Composé hétérocyclique | Produit pharmaceutique
| 22 | Réserpine | 50-55-5 | Nég. | — | — | 10-11 – 10-5 | — | 1,64 × 10-3 | Composé hétérocyclique, indole | Produit pharmaceutique et vétérinaire
Tableau 4
Liste des (10) substances d’épreuve de compétence pour l’essai antagoniste
Abréviations: No CAS = Numéro d’enregistrement au Chemical Abstracts Service; M = molaire; CI50 = concentration induisant la moitié de l’inhibition maximale; Nég. = négative; Nég
| | Substance | No CAS | Essai ER STTA | Essai de TA ER VM7Luc | ER STTA réponses attendues | ICCVAM Consensus de classification | Classe chimique dans le système MeSH | Type de produit
| Activité de TA ER | CI50 (M) | Fourchette de concentrations de l’essai (M) | Activité de TA ER | CI50 (M) | Concen-tration maximale pour l’essai prélimi-naire (M)
| 1 | 4-hydroxytamoxifène | 68047-06-3 | Pos. | 3,97 × 10-9 | 10-12 – 10-7 | Pos. | 2,08 × 10-7 | 2,58 × 10-4 | Pos. modéré | Pos. | Hydrocarbure (cyclique) | Produit pharmaceutique
| 2 | Raloxifène HCl | 82640-04-8 | Pos. | 7,86 × 10-10 | 10-12 – 10-7 | Pos. | 1,19 × 10-9 | 1,96 × 10-4 | Pos. modéré | Pos. | Hydrocarbure (cyclique) | Produit pharmaceutique
| 3 | Tamoxifène | 10540-29-1 | Pos. | 4,91 × 10-7 | 10-10 – 10-5 | Pos. | 8,17 × 10-7 | 2,69 × 10-4 | Pos. | Pos. | Hydrocarbure (cyclique) | Produit pharmaceutique
| 4 | 17β-estradiol | 50-28-2 | Nég. | — | 10-9 – 10-4 | Nég. | — | 3,67 × 10-3 | Nég. | PN | Stéroïde | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 5 | Apigénine | 520-36-5 | Nég. | — | 10-9 – 10-4 | Nég. | — | 3,70 × 10-4 | Nég. | Nég. | Composé hétérocyclique | Colorant, produit naturel, intermédiaire de synthèse pharmaceutique
| 6 | Di-n-butyl phtalate | 84-74-2 | Nég. | — | 10-8 – 10-3 | Nég. | — | 3,59 × 10-3 | Nég. | Nég. | Ester, acide phtalique | Ingrédient cosmétique, produit chimique industriel, plastifiant
| 7 | Flavone | 525-82-6 | Nég. | — | 10-8 – 10-3 | Nég. | — | 4,50 × 10-4 | Nég. | PN | Flavonoïde, composé hétérocyclique | Produit naturel, produit pharmaceutique
| 8 | Génistéine | 446-72-0 | Nég. | — | 10-9 – 10-4 | Nég. | — | 3,70 × 10-4 | Nég. | Nég. | Flavonoïde, composé hétérocyclique | Produit naturel, produit pharmaceutique
| 9 | p-n-nonylphénol | 104-40-5 | Nég. | — | 10-9 – 10-4 | Nég. | — | 4,54 × 10-4 | non testé | Nég. | Phénol | Intermédiaire chimique
| 10 | Resvératrol | 501-36-0 | Nég. | — | 10-8 – 10-3 | Nég. | — | 4,38 × 10-4 | Nég. | Nég. | Hydrocarbure (cyclique) | Produit naturel
Critères d’acceptabilité de l’épreuve
16. L’acceptation ou le rejet d’une épreuve dépend de l’évaluation des résultats obtenus avec les étalons de de référence et les témoins utilisés pour chaque expérience. Il convient que les TP50 (CE50) ou les CI50 des étalons de référence respectent les critères d’acceptabilité de l’essai choisi (pour l’essai de STTA voir l’appendice 2, pour l’essai de TA ER VM7Luc voir l’appendice 3), et que tous les témoins positifs et négatifs soient classés correctement par les expérimentations acceptées. Un laboratoire prouve sa compétence à répéter un essai de manière homogène en établissant et entretenant une base de données compilant les résultats historiques pour les étalons de référence et les témoins (voir paragraphe 15). Les écarts-types (ET) ou coefficients de variation (CV) des moyennes des paramètres d’ajustement des courbes de réponse des étalons de référence obtenus après plusieurs expériences peuvent servir à mesurer la reproductibilité intra-laboratoire. De plus, on respectera les principes suivants eu égard aux critères d’acceptabilité:
— Il convient que les données soient suffisantes pour évaluer quantitativement l’activation des ER (pour l’essai agoniste) ou leur inhibition (pour l’essai antagoniste) (c’est-à-dire efficacité et puissance).
— L’activité moyenne du marqueur obtenue avec la concentration de référence de la substance œstrogénique de référence est supérieure ou égale à la réponse minimale préconisée dans les essais, par rapport à la réponse du véhicule (solvant) témoin, afin de garantir une sensibilité adéquate. S’agissant des essais de STTA et de TA ER VM7Luc, ce minimum correspond à quatre fois la réponse moyenne du véhicule témoin pour chaque plaque.
— Les concentrations testées restent inférieures à la limite de solubilité des produits chimiques d’essai et ne sont pas cytotoxiques.
Analyse des données
17. Pour déterminer si une réponse est positive ou négative, on s’appuiera sur la procédure d’interprétation des données établie pour chaque essai.
18. Le respect des critères d’acceptabilité (paragraphe 16) indique que l’essai fonctionne correctement, mais ne garantit pas que chaque épreuve lancée fournira des données exactes. La réplication des résultats de la première épreuve constitue la meilleure indication que les valeurs obtenues sont exactes. Si deux épreuves donnent des résultats reproductibles (par ex. si elles concluent toutes les deux que le produit chimique d’essai est positif), il n’est pas nécessaire d’en réaliser une troisième.
19. Si deux épreuves ne donnent pas de résultats reproductibles (par ex. produit chimique d’essai positif selon l’une et négatif selon l’autre), ou si un degré de certitude supérieur est requis pour pouvoir conclure, il convient de mener au moins trois épreuves indépendantes. Dans ce cas, la classification est basée sur les deux résultats concordants sur les trois épreuves menées.
Critères généraux d’interprétation des données
20. Il n’existe actuellement aucune méthode d’interprétation des données d’essai de TA ER universellement reconnue. Cependant, il convient que les évaluations qualitatives (par ex. activité positive ou négative) et/ou quantitatives (par ex. CE50, TP50, CI50) de l’activité médiée par les ER s’appuient sur des données empiriques et des raisonnements scientifiques solides. Dans la mesure du possible, les résultats positifs seront caractérisés à la fois par l’amplitude de l’effet induit par rapport à la réponse du véhicule (solvant) témoin ou la substance œstrogénique de référence, et par la concentration correspondant à cet effet (par ex. CE50, TP50, RTPMax, CI50 etc.).
Rapport d’essai
21. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Essai:
— essai employé;
— témoins/étalons de référence/produit chimique d’essai;
— source, numéro de lot, date limite d’utilisation, si disponible;
— stabilité du produit chimique d’essai lui-même, si elle est connue;
— solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant, si elles sont connues;
— mesures du pH, de l’osmolalité et du précipité apparu dans le milieu auquel le produit chimique d’essai est ajouté, le cas échéant.
Substance mono-constituant:
— apparence physique, solubilité dans l’eau et autres propriétés physicochimiques pertinentes;
— données d’identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.
Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:
— caractérisée, autant que possible par p.ex. l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence quantitative et les propriétés physico-chimiques pertinentes des constituants.
Solvent/Vehicle:
— caractérisation (nature, fournisseur et lot);
— justification du choix du solvant/véhicule;
— solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant/véhicule, le cas échéant.
Cellules:
— type et source des cellules:
• ER est-il exprimé de façon endogène? Dans le cas contraire, quel(s) récepteur(s) a/ont été transfecté(s);
• chimère(s) de gènes rapporteurs utilisée(s) (y compris les espèces d’origine);
• méthode de transfection;
• méthode de sélection employée pour maintenir une transfection stable (le cas échéant);
• la méthode de transfection permet-elle d’obtenir des lignées stables?
— nombre de passages des cellules après leur décongélation;
— nombre de passages des cellules au moment de leur décongélation;
— méthodes d’entretien des cultures cellulaires.
Conditions d’essai:
— limites de solubilité;
— description des méthodes d’évaluation de la viabilité employées;
— composition du milieu, concentration de CO2;
— concentrations du produit chimique d’essai;
— volume de véhicule et du produit chimique d’essai ajouté;
— température d’incubation et humidité;
— durée du traitement;
— densité cellulaire au début et au cours du traitement;
— standards de référence positif et négatif;
— réactifs marqueurs (nom du produit, fournisseur, lot);
— critères d’interprétation des résultats positif, négatif ou équivoque.
Vérification de l’acceptabilité:
— multiplication de l’induction dans chaque plaque d’essai et comparaison par rapport au minimum requis pour l’essai concerné eu égard aux données historiques des témoins;
— valeurs réelles des logCE50, logTP50, logIC50 et pente de Hill pour les témoins positifs et étalons de référence simultanément inclus dans l’essai.
Résultats:
— données brutes et normalisées;
— niveau d’induction maximum;
— données relatives à la cytotoxicité;
— concentration minimale avec effet (CME), le cas échéant;
— RTPMax, TPMax, TP50, IC50 et/ou CE50, s’il y a lieu;
— relation concentration-réponse, si possible;
— analyses statistiques, le cas échéant, ainsi qu’une mesure de l’erreur et de la confiance (par exemple erreur-type de la moyenne, écart-type, CV ou IC 95 %) et description de la façon dont ces données ont été obtenues.
Discussion des résultats
Conclusion
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B.67 ESSAIS IN VITRO DE MUTATION GÉNIQUE SUR CELLULES DE MAMMIFÈRES UTILISANT LE GÈNE DE LA THYMIDINE KINASE
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 490 (2016) de l’OCDE. pour les essais de produits chimiques. Les méthodes d’essai sont régulièrement révisées à la lumière des progrès scientifiques, de l’évolution des exigences règlementaires et des considérations relatives au bien-être des animaux. Initialement, l’essai sur cellules de lymphome de souris (ou essai MLA, pour Mouse Lymphoma Assay) et l’essai sur TK6 utilisant des loci de la thymidine kinase (TK) figuraient dans la méthode d’essai B.17. Par la suite, le groupe d’experts sur les cellules de lymphome de souris de l’atelier international sur les essais de génotoxicité (IWGT) a élaboré des recommandations internationales harmonisées pour les critères d’acceptation des essais et l’interprétation des données de l’essai MLA (1) (2) (3) (4) (5), et ces recommandations sont incorporées dans la présente nouvelle méthode d’essai B.67. Cette méthode d’essai est rédigée pour l’essai MLA ainsi que pour l’essai sur TK6, car ce dernier utilise également le locus TK. Cependant, alors que l’essai MLA est largement utilisé à des fins réglementaires, l’essai sur TK6 est utilisé bien moins fréquemment. Il est à noter que malgré la similitude de leurs critères d’évaluation, les deux lignées cellulaires ne sont pas interchangeables et des programmes réglementaires peuvent valider une préférence pour l’un par rapport à l’autre dans le cadre d’un usage réglementaire particulier. Par exemple, la validation du MLA a démontré sa pertinence pour la détection des dommages sur la structure des chromosomes causés par le produit chimique d’essai, en plus de la capacité de l’essai pour identifier les mutations géniques. Elle s’inscrit dans une série de méthodes d’essai sur la toxicologie génétique. L’OCDE a élaboré un document contenant des éléments d’information concis sur les essais de toxicologie génétique ainsi qu’un aperçu des récents changements qui ont été apportés aux lignes directrices de l’OCDE concernant la toxicité génétique (6).
2. Les essais in vitro de mutation génique sur cellules de mammifères ont pour objectif de détecter des mutations induites par des produits chimiques. Les lignées cellulaires utilisées dans ces essais mesurent les mutations directes dans les gènes rapporteurs, en particulier le gène endogène de la thymidine kinase (TK pour les cellules humaines et Tk pour les cellules de rongeurs, collectivement dénommés TK dans la présente méthode d’essai). Deux lignées cellulaires sont concernées par la présente méthode d’essai: la lignée de cellules de lymphome de souris L5178Y TK+/--3.7.2C (généralement dénommée L5178Y) et la lignée de cellules humaines lymphoblastoïdes TK6 (généralement dénommée TK6). Bien que ces deux lignées cellulaires varient en raison de leur origine, croissance cellulaire, statut p53, etc., les essais de mutation génique de la TK peuvent être menés de manière similaire dans les deux types de cellules décrits dans la présente méthode d’essai.
3. La nature autosomique et hétérozygote du gène de la thymidine kinase permet de détecter les colonies viables dont les cellules sont déficientes en enzyme thymidine kinase suite à la mutation de TK+/- en TK-/-. Ce déficit peut résulter d’événements génétiques affectant le gène de la TK, notamment des mutations du gène (mutations ponctuelles, mutations décalant le cadre de lecture, petites délétions, etc.) et des événements chromosomiques (délétions importantes, réarrangements chromosomiques et recombinaison mitotique). Ces derniers événements sont exprimés par la perte d’hétérozygotie, qui est une modification génique courante des gènes suppresseurs lors de la tumorigenèse chez l’homme. En théorie, la perte de la totalité du chromosome portant le gène de la TK résultant de l’altération du fuseau et/ou de la non-disjonction mitotique peut être détectée dans l’essai MLA. En effet, l’analyse cytogénétique et moléculaire combinée montre clairement que certains mutants de la TK dans l’essai MLA sont le résultat d’une non-disjonction. Cependant, les données scientifiques démontrent que les tests de mutation génique de la TK ne peuvent pas détecter de manière fiable les substances aneugènes lors de l’application des critères de cytotoxicité standard (tels que décrits dans la présente méthode d’essai) et que par conséquent, il ne convient pas d’utiliser ces tests pour détecter ces dernières (7) (8) (9).
4. Deux classes phénotypiques distinctes de mutants de la TK sont générées lors des essais de mutation génique de la TK; les mutants dont la croissance est normale qui grandissent à la même vitesse que les cellules TK hétérozygotes, et les mutants à la croissance faible qui grandissent avec des temps de doublement plus longs. Les mutants à la croissance normale et à la croissance faible sont reconnus sous forme de grande colonie ou de petite colonie de mutants dans l’essai MLA, et en tant que colonie de mutants apparaissant précocement ou tardivement dans l’essai sur TK6. La nature moléculaire et cytogénétique des deux sortes de colonies de mutants dans l’essai MLA (petites et grandes) a été étudiée en détail (8) (10) (11) (12) (13). La nature moléculaire et cytogénétique des mutants TK6 apparaissant précocement et tardivement a aussi été largement étudiée (14) (15) (16) (18). Les mutants à la croissance lente pour les deux types de cellules ont subi des lésions génétiques impliquant le ou les gènes régulateurs présumés de la croissance situés près du locus TK, ce qui entraîne des temps de doublement plus longs et la formation de petites colonies ou de colonies apparaissant tardivement (18). L’induction de mutants à croissance lente a été associée à des produits chimiques qui induisent des changements structurels bruts au niveau chromosomique. Les cellules dont les lésions n’impliquent pas de gènes régulateurs présumés de la croissance près du locus TK grandissent à des vitesses similaires à celles des cellules parentales et deviennent des mutants à la croissance normale. L’induction de mutants à la croissance essentiellement normale est associée à des produits chimiques agissant principalement comme mutagènes ponctuels. En conséquence, il est essentiel de comptabiliser à la fois les mutants à croissance lente et les mutants à croissance normale afin de détecter tous les mutants et de fournir des informations sur le ou les types de lésions (mutagènes par rapport à clastogènes) induits par le produit chimique d’essai (10) (12) (18) (19).
5. La méthode d’essai est organisée de manière à fournir des informations générales qui s’appliquent aux essais sur cellules de lymphome de souris (MLA) et sur TK6, ainsi que des indications particulières pour les essais individuels.
6. Les définitions des termes employés sont présentées à l’appendice 1.
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES
7. Les essais conduits in vitro requièrent généralement une source exogène d’activation métabolique, mais celle-ci est incapable de reproduire parfaitement les conditions in vivo.
8. On prendra soin d’éviter les conditions susceptibles de conduire à de faux résultats positifs (à savoir une possible interaction avec le système d’essai) non causés par une interaction entre le produit chimique d’essai et le matériel génétique de la cellule; ces conditions peuvent être une modification du pH ou de l’osmolalité, une interaction avec les composants du milieu (20) (21), ou une cytotoxicité excessive (22) (23) (24). Une cytotoxicité supérieure aux plafonds recommandés tels que définis au paragraphe 28 est considérée comme excessive pour les essais MLA et sur TK6. En outre, il convient de noter que les produits chimiques d’essai qui sont des analogues de la thymidine, ou qui se comportent comme des analogues de la thymidine, peuvent augmenter la fréquence des mutants par croissance sélective des mutants spontanés de fond lors du traitement cellulaire, et que leur évaluation nécessite le recours à des méthodes d’essai additionnelles (25).
9. Pour les nanomatériaux manufacturés, il peut s’avérer nécessaire d’apporter certaines adaptations spécifiques à cette méthode d’essai, mais ces adaptations ne sont pas décrites ici.
10. Avant d’appliquer la présente méthode d’essai à un mélange pour obtenir des données à des fins réglementaires, il convient de vérifier si, et dans l’affirmative pourquoi, elle peut fournir des résultats acceptables dans ce cadre réglementaire. Cette vérification n’est pas nécessaire si l’essai du mélange répond à des exigences réglementaires.
11. Des cellules déficientes en thymidine kinase (TK), en raison de la mutation directe TK+/- en TK-/-, sont résistantes aux effets cytostatiques de la trifluorothymidine (TFT), un analogue de la pyrimidine. Les cellules riches en TK sont sensibles à la TFT, qui entraîne une inhibition du métabolisme et l’arrêt de la division cellulaire. Ainsi, des cellules mutantes peuvent proliférer en présence de TFT et former des colonies visibles, tandis que les cellules normales qui contiennent l’enzyme TK ne le peuvent pas.
PRINCIPE DE L’ESSAI
12. Des cellules en suspension sont exposées au produit chimique d’essai, en présence et en l’absence d’une source exogène d’activation métabolique (voir paragraphe 19), pendant une période de temps appropriée (voir paragraphe 32), puis sont repiquées afin de déterminer la cytotoxicité et de laisser le phénotype s’exprimer avant la sélection des mutants. On détermine la cytotoxicité en mesurant la croissance relative totale des cultures (CRT, voir paragraphe 25) pour l’essai MLA et la survie relative (SR, voir paragraphe 26) pour l’essai sur TK6. Les cultures traitées sont maintenues dans un milieu de croissance pendant une période de temps suffisante, caractéristique de chaque type de cellule (voir paragraphe 37), afin de permettre une expression phénotypique quasi-optimale des mutations induites. Une fois l’expression phénotypique obtenue, on détermine la fréquence des mutants en ensemençant avec un nombre connu de colonies un milieu contenant l’agent sélectif permettant de détecter les colonies mutantes. Dans un milieu exempt d’agent sélectif, on détermine l’efficacité de clonage (viabilité). Après un temps d’incubation approprié, les colonies sont comptées. La fréquence des mutants est calculée en fonction du nombre de colonies mutantes corrigé par l’efficacité de clonage au moment de la sélection des mutants.
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Préparations
Cellules
13. Pour l’essai sur cellules de lymphome de souris (MLA): L’essai MLA ayant été développé et caractérisé en utilisant la sous-lignée TK+/- -3.7.2C de cellules L5178Y, c’est cette sous-lignée spécifique qui doit être utilisée pour cet essai. La lignée cellulaire L5178Y est dérivée d’un lymphome thymique induit par méthylcholanthrène provenant d’une souris DBA-2 (26). Clive et ses collègues ont traité des cellules L5178Y (désignées par Clive sous le nom de TK+/+ -3) avec du méthanesulfonate d’éthyle et isolé un clone de TK-/- (désigné sous le nom de TK-/- -3.7) en utilisant de la bromodéoxyuridine comme agent sélectif. Un clone spontané TK+/- (désigné sous le nom de TK+/- -3.7.2.) etun sous-clone (désigné sous le nom deTK+/--3.7.2C) ont été isolés à partir du clone TK-/- et caractérisés pour être utilisés dans l’essai MLA (27). Le caryotype de la lignée cellulaire a fait l’objet d’une publication (28) (29) (30) (31). Le nombre modal de chromosomes est 40. Un chromosome métacentrique (t12; 13) doit être compté comme un chromosome. Le locus TK de la souris est situé sur l’extrémité distale du chromosome 11. La lignée de cellules L5178Y TK+/- -3.7.2C comporte des mutations sur les deux allèles du gène p53 et produit une protéine p53 mutée (32) (33). C’est probablement grâce au statut du gène p53 de la lignée cellulaire TK+/--3.7.2C que l’essai est capable de détecter des lésions à grande échelle (17).
14. Pour l’essai sur TK6: La lignée TK6 est une lignée de cellules humaines lymphoblastoïdes. La lignée cellulaire parentale est une lignée cellulaire transformée par le virus d’Epstein-Barr, WI-L2, initialement dérivée d’un sujet de sexe masculin âgé de 5 ans atteint de sphérocytose héréditaire. Le premier clone isolé, HH4, a été mutagénisé avec de l’ICR191 et une lignée de cellules TK hétérozygotes, baptisées K6, a été ainsi générée (34). Les cellules TK6 sont presque toutes diploïdes et le caryotype représentatif est 47, XY, 13+, t(14; 20), t(3; 21) (35). Le locus TK chez l’homme est situé sur le bras long du chromosome 17. La lignée TK6 est une lignée de cellules compétentes en p53, car elle comporte une séquence p53 de type sauvage dans les deux allèles et exprime seulement la protéine p53 de type sauvage (36).
15. Lors de l’établissement initial de la culture mère ou de sa reconstitution pour les essais MLA et sur TK6, il recommandé que le laboratoire d’essai veille à l’absence de contamination par mycoplasmes, procède au caryotypage des cellules ou peigne les chromosomes hébergeant le locus TK, et vérifie les temps de doublement de la population. La durée normale du cycle cellulaire des cellules utilisées dans le laboratoire d’essai doit être établie et doit correspondre aux caractéristiques cellulaires publiées (16) (19) (37). Cette culture mère doit être conservée à -150 °C ou à une température inférieure et utilisée pour préparer les cultures cellulaires de travail.
16. Avant de produire un grand nombre de cultures de travail cryoconservées ou juste avant d’être utilisée pour une expérience, il pourra s’avérer nécessaire de débarrasser la culture des cellules mutantes qu’elles contiennent [sauf si la fréquence des mutants (FM) dans le témoin avec solvant figure déjà dans la plage de valeurs acceptables — voir le tableau 2 pour l’essai MLA]. On utilise pour cela le méthotrexate (aminoptérine) afin d’écarter les cellules déficientes en TK et on ajoute de la thymidine, de l’hypoxanthine et de la glycine (L5178Y) ou de la 2’-déoxycytidine (TK6) à la culture afin de garantir une croissance optimale des cellules compétentes en TK (19) (38) (39) (40) Des conseils d’ordre général sur les bonnes pratiques concernant l’entretien des cultures cellulaires ainsi que des conseils spécifiques pour les cellules L5178Y et TK6 sont disponibles dans la littérature (19) (31) (37) (39) (41). Pour les laboratoires ayant besoin de cultures cellulaires mères pour lancer un essai sur cellules de lymphome de souris ou TK6 ou pour obtenir de nouvelles cultures cellulaires mères, une banque de cellules bien caractérisées est disponible (37).
Milieu et conditions de culture
17. Pour les deux essais, il convient d’utiliser un milieu de croissance et des conditions d’incubation (par exemple, récipients de culture, atmosphère humidifiée à 5 % de CO2, température d’incubation de 37 °C) appropriés pour la conservation des cultures. Les cultures cellulaires doivent toujours être maintenues dans des conditions qui garantissent leur croissance en phase exponentielle. Il est particulièrement important de choisir des milieux et des conditions de culture qui stimulent la croissance optimale des cellules pendant la période d’expression et le clonage de cellules, tant mutantes que non mutantes. Pour les essais MLA et sur TK6, il importe également que les conditions de culture garantissent une croissance optimale tant pour les mutants TK en grandes colonies/apparaissant précocement que ceux en petites colonies/apparaissant tardivement. De plus amples détails sur les cultures, notamment le besoin de chauffer de manière adéquate le sérum de cheval pour l’inactiver si un milieu RPMI est utilisé lors de la sélection des mutants, sont disponibles dans la littérature (19) (31) (38) (39) (40) (42).
Préparation des cultures
18. Les cellules sont multipliées à partir de cultures mères, placées dans un milieu de culture à une densité telle que les cultures en suspension poursuivront leur croissance de manière exponentielle tout au long du traitement et des périodes d’expression.
Activation métabolique
19. Le recours à un système d’activation métabolique exogène est nécessaire en cas d’utilisation de cellules L5178Y et TK6 dotées d’une capacité métabolique endogène inadéquate. Le système le plus couramment utilisé, recommandé par défaut, sauf justification contraire, est une fraction post-mitochondriale enrichie en cofacteur (S9), préparéeà partir de foies de rongeurs (généralement des rats) traités avec des inducteurs enzymatiques comme l’Aroclor 1254 (43) (44) (45) ou une association de phénobarbital et de β-naphthoflavone (46) (47) (48) (49) (50) (51). L’utilisation de ce mélange n’est pas contraire à la Convention de Stockholm sur les polluants organiques persistants (52) et s’est révélée aussi efficace que celle de l’Arcolor 1254 pour l’induction d’oxydases à fonction mixte (45) (46) (47) (48) (49). La fraction S9 est généralement utilisée à une concentration comprise entre 1 et 2 % mais qui peut être portée à 10 % (v/v) dans le milieu d’essai final. Le choix du type et de la concentration du système d’activation métabolique exogène ou de l’inducteur métabolique utilisé pourra dépendre de la classe des produits chimiques à tester.
Préparation du produit chimique d’essai
20. Les produits chimiques solides à tester sont dissous dans un solvant approprié puis, le cas échéant, dilués avant application (voir paragraphe 21). Avant le traitement, les produits chimiques liquides peuvent être ajoutés directement et/ou après dilution au système d’essai. Les produits gazeux ou volatils nécessitent une modification appropriée des protocoles standards, par exemple l’utilisation de récipients de culture hermétiquement clos (53) (54) (55). Il convient de préparer les produits chimiques d’essai juste avant le traitement, à moins que les données concernant la stabilité ne démontrent qu’ils peuvent être stockés.
CONDITIONS EXPÉRIMENTALES
Solvants
21. Le solvant doit être choisi de manière à optimiser la solubilité des produits chimiques d’essai, sans engendrer d’effets néfastes sur la conduite de l’essai, c’est-à-dire sans modifier la croissance cellulaire, nuire à l’intégrité du produit chimique d’essai, réagir avec les récipients de culture ou détériorer le système d’activation métabolique. On recommande d’envisager d’abord l’utilisation d’un solvant (ou milieu de culture) aqueux chaque fois que cela est possible. L’eau et le diméthylsulfoxyde sont des exemples de solvants couramment utilisés. En règle générale, les solvants organiques ne doivent pas dépasser 1 % (v/v) et les solvants aqueux (salin ou eau) 10 % (v/v) dans le milieu de traitement final. L’emploi d’un solvant inhabituel (éthanol ou acétone, par exemple) doit être justifié par des données faisant état de sa compatibilité avec le produit chimique d’essai et le système d’essai, ainsi que de son absence de génotoxicité aux concentrations utilisées. En l’absence de telles données, il est important d’inclure dans l’essai des témoins non traités (voir les définitions à l’appendice 1) afin de démontrer que le solvant choisi n’entraîne aucun effet délétère ou mutagène.
MESURE DE LA CYTOTOXICITÉ CELLULAIRE ET CHOIX DES CONCENTRATIONS DU TRAITEMENT
22. Lors de la détermination de la plus forte concentration du produit chimique d’essai à tester, on évitera les concentrations susceptibles de produire de fausses réponses positives, notamment celles qui engendrent une cytotoxicité excessive (voir paragraphe 28), une précipitation (voir paragraphe 29) dans le milieu de culture, ou une modification marquée du pH ou de l’osmolalité (voir paragraphe 8). Si le produit chimique d’essai provoque une modification marquée du pH du milieu au moment de son ajout, il est possible d’ajuster le pH par tamponnage du milieu de traitement final de manière à éviter les faux résultats positifs et à maintenir des conditions de culture appropriées.
23. La concentration est sélectionnée en fonction de la cytotoxicité et d’autres considérations (voir paragraphes 27 à 30). Un essai préliminaire visant à évaluer la cytotoxicité peut s’avérer utile pour mieux cerner les concentrations à utiliser dans l’essai principal, mais il n’est pas obligatoire. Même si une évaluation initiale de la cytotoxicité a été effectuée, il reste indispensable de mesurer la cytotoxicité pour chaque culture dans le cadre de l’expérience principale. Si une expérience est menée pour déterminer les concentrations à utiliser, elle doit couvrir une large gamme de concentrations et doit soit être achevée au Jour 1 après le traitement, soit être menée jusqu’à l’expression du Jour 2 et la sélection des mutants (s’il apparaît que les concentrations utilisées sont appropriées).
24. La cytotoxicité doit être déterminée pour chaque culture d’essai individuelle et chaque culture témoin: les méthodes à employer pour l’essai MLA (2) et l’essai sur TK6 (15) sont définies par la pratique internationalement reconnue.
25. Pour les deux versions de l’essai MLA, avec gélose et avec micropuits, la cytotoxicité est évaluée en utilisant la croissance relative totale (CRT), initialement définie par Clive et Spector en 1975 (2). Cette mesure comprend la croissance relative en suspension (CRS: culture d’essai par rapport au témoin avec solvant) durant le traitement cellulaire, le délai d’expression et l’efficacité de clonage relative (ECR: culture d’essai par rapport au témoin avec solvant) lorsque les mutants sont sélectionnés (2) Il convient de noter que la CRS inclut toute perte cellulaire se produisant dans la culture d’essai durant le traitement (voir les formules à l’appendice 2).
26. Pour l’essai sur TK6, la cytotoxicité est évaluée au regard de la survie relative (SR), à savoir l’efficacité de clonage des cellules étalées sur plaque immédiatement après le traitement, ajustée en fonction d’éventuelles pertes cellulaires en cours de traitement, en fonction du nombre de cellules comparativement au témoin négatif (à qui l’on a attribué une survie de 100 %) (voir les formules à l’appendice 2).
27. Il convient d’évaluer au moins quatre concentrations d’essai (sans compter les témoins avec solvant et les témoins positifs) remplissant les critères d’acceptabilité (cytotoxicité appropriée, nombre de cellules, etc.). Alors que l’utilisation de cultures en double exemplaire est recommandée, chacune des cultures réalisées en un seul ou plusieurs exemplaires peut être utilisée à chaque concentration d’essai. Les résultats obtenus pour chacune des répliques à une concentration donnée doivent faire l’objet de rapports distincts mais peuvent être regroupés pour l’analyse des données (55). Pour les produits chimiques dont la cytotoxicité est faible ou nulle, des niveaux de concentrations espacés d’un facteur de 2 à 3 environ conviendront généralement. En cas de cytotoxicité, les concentrations d’essai retenues doivent couvrir une plage englobant la concentration produisant une cytotoxicité telle que décrite au paragraphe 28 et les concentrations pour lesquelles une cytotoxicité modérée, faible ou nulle est observée. De nombreux produits chimiques d’essai présentent des courbes concentration-réponse à forte pente et, afin de couvrir toute la plage de valeurs de la cytotoxicité ou pour étudier en détail la réponse à la concentration, il pourra s’avérer nécessaire d’utiliser des concentrations plus rapprochées et plus de quatre concentrations, notamment dans les cas où il est nécessaire de répéter l’expérience (voir paragraphe 70). Si l’on réalise des cultures en un seul exemplaire, il peut être particulièrement important d’utiliser plus de 4 concentrations.
28. Si la concentration maximale est basée sur la cytotoxicité, la concentration la plus forte doit viser une CRT comprise entre 20 et 10 % pour l’essai MLA, et une SR comprise entre 20 et 10 % pour l’essai sur TK6 (paragraphe 67).
29. Pour les produits chimiques d’essai peu solubles qui ne sont pas cytotoxiques à des concentrations inférieures à la concentration insoluble la plus faible, la plus forte concentration analysée doit produire une turbidité ou un précipité visible à l’œil nu ou à l’aide d’un microscope inversé à la fin du traitement avec le produit chimique d’essai. Même si une cytotoxicité intervient au-delà de la concentration insoluble la plus faible, il est recommandé de tester une seule concentration produisant une turbidité ou un précipité visible, car de fausses réponses pourraient découler de ce précipité. Les essais MLA et sur TK6 utilisant des cultures en suspension, il convient de s’assurer particulièrement que ce dernier n’interfère pas avec la conduite de l’essai. Il peut être utile de déterminer la solubilité dans le milieu de culture préalablement à l’essai.
30. Si aucun précipité ou aucune cytotoxicité limitante ne sont observés, la concentration d’essai maximale doit correspondre à la plus basse parmi 10 mM, 2 mg/ml ou 2 μl/ml (57) (58). Lorsque la composition du produit chimique d’essai n’est pas définie, par exemple dans le cas de substances de composition inconnue ou variable, de produits de réaction complexes ou de matériels biologiques [c’est-à-dire, subsatnces chimiques de composition inconnue ou variable (UVCB)], de produits extraits de l’environnement etc., il peut être nécessaire d’augmenter la concentration maximale (5 mg/ml par exemple), en l’absence de cytotoxicité suffisante, afin d’accroître la concentration de chacun des composants. Il convient toutefois de noter que ces exigences peuvent être différentes pour les produits pharmaceutiques à usage humain (59).
Témoins
31. Des témoins négatifs concomitants (voir paragraphe 21), constitués uniquement du solvant dans le milieu de traitement et testés de la même façon que les cultures traitées, doivent être inclus pour chaque condition expérimentale.
32. Des témoins positifs concomitants sont nécessaires pour démontrer la capacité du laboratoire d’identifier les mutagènes dans les conditions du protocole d’essai utilisé, ainsi que l’efficacité du système d’activation métabolique exogène (le cas échéant), et pour démontrer la détection adéquate de mutants TK en petites colonies/apparaissant tardivement et en grandes colonies/apparaissant précocement. Le tableau 1 ci-dessous présente des exemples de témoins positifs. D’autres substances chimiques peuvent être utilisées comme témoins positifs, si cela est justifié. Étant donné que les essais in vitro de génotoxicité sur cellules de mammifères sont suffisamment normalisés en ce qui concerne les traitements parallèles de courte durée (de 3 à 4 heures) effectués avec et sans activation métabolique pendant la même durée de traitement, l’utilisation de témoins positifs peut être limitée à un mutagène nécessitant une activation métabolique. Dans ce cas, cette seule réponse dans un témoin positif démontrera à la fois l’activité du système d’activation métabolique et la réactivité du système d’essai. En cas de traitement de longue durée (c’est-à-dire, 24 heures sans S9), celui-ci doit toutefois disposer de son propre témoin positif, étant donné que la durée du traitement sera différente de celle de l’essai ayant recours à une activation métabolique. Chaque témoin positif doit être utilisé à une ou plusieurs concentrations devant normalement donner lieu à une augmentation reproductible et détectable par rapport à la valeur de fond afin de démontrer la sensibilité du système d’essai, et la réponse ne doit pas être compromise par une cytotoxicité supérieure aux limites fixées dans la présente méthode d’essai (voir paragraphe 28).
Tableau 1
Substances de référence recommandées pour la vérification des compétences du laboratoire et pour la sélection des témoins positifs
| Catégorie | Substance | No CAS
| 1. Mutagènes actifs sans activation métabolique
| Méthanesulfonate de méthyle | 66-27-3
| Mitomycine C | 50-07-7
| N-oxyde de nitro-4 quinoline | 56-57-5
| 2. Mutagènes nécessitant une activation métabolique
| Benzo(a)pyrène | 50-32-8
| Cyclophosphamide (monohydraté) | 50-18-0 (6055-19-2)
| Diméthyl-7,12 benzanthracène | 57-97-6
| 3-Méthylcholanthrène | 56-49-5
MODE OPÉRATOIRE
Traitement avec le produit chimique d’essai
33. Les cellules en prolifération sont traitées avec le produit chimique d’essai en présence et en l’absence d’un système d’activation métabolique. La durée d’exposition doit être suffisante (de 3 à 4 heures sont généralement efficaces). Il convient toutefois de noter que ces exigences peuvent être différentes pour les produits pharmaceutiques à usage humain (59). Pour l’essai MLA, dans les cas où le traitement à court terme donne des résultats négatifs, et si les informations présentes suggèrent la nécessité d’un traitement plus long [par ex., analogues nucléosidiques, produits chimiques faiblement solubles, (5) (59)], il convient d’envisager un traitement plus long, c’est-à-dire, de 24 heures sans S9.
34. Le nombre minimal de cellules utilisées pour chaque culture (témoin et traitée) d’essai à chaque étape de l’essai doit être basé sur la fréquence de mutants spontanés. Il est conseillé en général de traiter et repiquer suffisamment de cellules dans chaque culture expérimentale pour préserver au moins 10, mais dans l’idéal 100, mutants spontanés à toutes les phases de l’essai (traitement, expression phénotypique et sélection des mutants) (56).
35. Pour l’essai MLA, la fréquence de mutants spontanés acceptable recommandée se situe entre 35 et 140 × 10-6 (version avec diffusion en gélose) et entre 50 et 170 × 10-6 (version avec micropuits) (voir le tableau 2). Pour avoir au moins 10, et dans l’idéal 100, mutants spontanés survivant au traitement pour chaque culture d’essai, il est nécessaire de traiter au moins 6 × 106 cellules. Le traitement de ce nombre de cellules, et la préservation de suffisamment de cellules durant l’expression et le clonage pour la sélection des mutants, permet d’obtenir un nombre suffisant de mutants spontanés (10 ou plus) durant toutes les phases de l’expérience, même pour les cultures traitées à des concentrations qui résultent en une cytotoxicité de 90 % (mesurée par une CRT de 10 %) (19) (38) (39).
36. Pour l’essai sur TK6, la fréquence de mutants spontanés se situe généralement entre 2 et 10 × 10-6. Pour qu’au moins 10 mutants spontanés survivent au traitement pour chaque culture d’essai, il est nécessaire de traiter au moins 20 × 106 cellules. Le traitement de ce nombre de cellules permet d’obtenir un nombre suffisant de mutants spontanés (10 ou plus), même pour les cultures traitées à des concentrations causant une cytotoxicité de 90 % pendant le traitement (SR de 10 %). Il faut en outre qu’un nombre suffisant de cellules soient cultivées durant la période d’expression et étalées sur plaque pour la sélection des mutants (60).
Délai d’expression phénotypique et mesure de la cytotoxicité et de la fréquence des mutants
37. À l’issue de la période de traitement, les cellules sont cultivées pendant une période de temps définie de façon à permettre l’expression phénotypique quasi-optimale de mutants nouvellement induits; cette période est spécifique à chaque lignée cellulaire. Pour l’essai MLA, la période d’expression phénotypique est de 2 jours. Pour l’essai sur TK6, la période d’expression phénotypique est de 3 à 4 jours. Dans le cas d’un traitement de 24 heures, la période d’expression commence après la fin du traitement
38. Durant la période d’expression phénotypique, les cellules sont dénombrées quotidiennement. Pour l’essai MLA, on utilise les nombres de cellules quotidiens pour calculer la croissance en suspension (CS) quotidienne. Suite à la période d’expression de 2 jours, les cellules sont suspendues dans le milieu avec ou sans agent sélectif afin de déterminer le nombre de mutants (plaques de sélection) et l’efficacité de clonage (plaques de viabilité), respectivement. Pour cet essai, il existe deux méthodes également acceptables pour le clonage de sélection de mutants: le procédé de diffusion en gélose molle et le procédé en milieu liquide dans des plaques de 96 puits (19) (38) (39). Le clonage dans l’essai sur TK6 s’effectue en utilisant des milieux liquides et des plaques à 96 puits (16).
39. La trifluorothymidine (TFT) est le seul agent sélectif recommandé pour les mutants TK (61).
40. Pour l’essai MLA, les plaques de gélose et les plaques micropuits sont comptées après 10 à 12 jours d’incubation. Pour l’essai sur TK6, les colonies contenues dans les plaques micropuits sont évaluées après 10 à 14 jours pour l’identification de mutants apparaissant précocement. Afin de récupérer les mutants TK6 à croissance lente (apparaissant tardivement), il est nécessaire de réalimenter les cellules avec du milieu de croissance et de la TFT après avoir compté les mutants apparaissant précocement, puis d’incuber les plaques pendant 7 à 10 jours supplémentaires (62). Voir aux paragraphes 42 et 44 la discussion concernant le dénombrement des mutants TK à croissance lente et à croissance normale.
41. On trouvera à l’appendice 2 les calculs à effectuer pour les deux essais et les deux versions (diffusion en gélose et micropuits) de l’essai MLA. Pour la méthode de diffusion en gélose utilisée dans l’essai MLA, les colonies sont comptées et le nombre de colonies mutantes est ajusté en fonction de l’efficacité de clonage afin de calculer une fréquence des mutants. Pour la version utilisant les micropuits dans l’essai MLA et dans l’essai sur TK6, l’efficacité de clonage pour la sélection et les plaques d’efficacité de clonage est déterminée selon la distribution de Poisson (63). La fréquence des mutants est calculée à partir de ces deux efficacités de clonage.
Caractérisation des colonies de mutants
42. Pour l’essai MLA, si le produit chimique d’essai est positif (voir paragraphes 62 et 63), la caractérisation des colonies en fonction de leur taille ou de leur croissance doit être réalisée sur au moins une des cultures de traitement (généralement exposée à la concentration acceptable donnant la réponse la plus fortement positive) et sur les témoins négatifs et positifs. Si le produit chimique d’essai est négatif (voir paragraphe 64), la caractérisation des colonies mutantes doit être réalisée sur les témoins négatifs et positifs. Pour la méthode des micropuits de l’essai MLA, les mutants en petites colonies sont ceux qui couvrent moins de 25 % du diamètre du puits et les mutants en grandes colonies sont ceux qui couvrent plus de 25 % du diamètre du puits. Pour la méthode de la diffusion en gélose, un compteur de colonies automatique est utilisé pour dénombrer les colonies mutantes et déterminer la taille des colonies. Les méthodes à suivre pour déterminer la taille des colonies sont décrites de manière détaillée dans la littérature (19) (38) (40). Il est nécessaire de caractériser les colonies dans les témoins négatifs et positifs afin de démontrer que les études sont menées de manière appropriée.
43. Le produit chimique d’essai ne peut pas être déterminé comme étant négatif si les mutants en petites et en grandes colonies ne sont pas adéquatement détectés dans les témoins positifs. La caractérisation des colonies peut être utilisée pour fournir des informations d’ordre général concernant la capacité du produit chimique d’essai de causer des mutations ponctuelles et/ou des événements chromosomiques (paragraphe 4).
44. TK6: Les mutants à la croissance normale et à la croissance lente sont différenciés en fonction de la différence de temps d’incubation (voir paragraphe 40). Pour l’essai sur TK6, les mutants apparaissant précocement, ainsi que ceux apparaissant tardivement, sont évalués pour l’ensemble des cultures, y compris les témoins négatifs et positifs. Il est nécessaire de caractériser les colonies pour les témoins négatifs et positifs afin de démontrer que les études sont menées de manière appropriée. Le produit chimique d’essai ne peut pas être déterminé comme étant négatif si les mutants apparaissant précocement ainsi que ceux apparaissant tardivement ne sont pas adéquatement détectés dans le témoin positif. La caractérisation des colonies peut être utilisée pour fournir des informations d’ordre général concernant la capacité du produit chimique d’essai de causer des mutations ponctuelles et/ou des événements chromosomiques (paragraphe 4).
Compétence du laboratoire
45. Afin d’acquérir une expérience suffisante de l’essai avant de l’utiliser en routine, le laboratoire doit avoir réalisé une série d’expériences avec des substances chimiques positives de référence agissant selon des mécanismes variés (au moins une avec activation métabolique et une sans activation métabolique, sélectionnées parmi les substances chimiques énumérées au tableau 1) et avec plusieurs témoins négatifs (y compris des cultures non traitées et divers solvants/véhicules). Ces réponses de témoins positifs et négatifs doivent être cohérentes par rapport à la littérature. Cette exigence ne s’applique pas aux laboratoires possédant déjà une expérience, c’est-à-dire, qui disposent d’une base de données historiques telle que définie aux paragraphes 47 à 50. Pour l’essai MLA, les valeurs obtenues pour les témoins positifs et négatifs doivent être cohérentes avec les recommandations de l’IWGT (voir tableau 2).
46. Une sélection de substances chimiques utilisées comme témoins positifs (voir tableau 1) doit être testée dans le cadre de traitements de courte et de longue durée (si l’on utilise des traitements de longue durée) en l’absence d’activation métabolique, ainsi que dans le cadre d’un traitement de courte durée en présence d’une activation métabolique, l’objectif étant de démontrer que le laboratoire possède la compétence nécessaire pour détecter des produits chimiques mutagènes, de déterminer l’efficacité du système d’activation métabolique et de prouver l’adéquation des conditions de croissance cellulaire durant le traitement, l’expression phénotypique et la sélection des mutants, ainsi que l’adéquation des procédures d’évaluation. Il conviendra de définir une plage de concentrations des substances chimiques sélectionnées qui permette d’obtenir des augmentations reproductibles et liées à la concentration par rapport aux valeurs de fond, afin de démontrer la sensibilité et la plage dynamique du système d’essai.
Données des témoins historiques
47. Le laboratoire doit établir:
— une plage et une distribution des témoins positifs historiques,
— une plage et une distribution des témoins négatifs (non traités, avec solvant) historiques.
48. Lors de l’acquisition initiale de données en vue d’établir une distribution des témoins négatifs historiques, les données des témoins négatifs concomitants doivent être cohérentes avec les données publiées. Puis, à mesure que de nouvelles données expérimentales viennent étoffer la plage de distribution des témoins, les données des témoins négatifs concomitants doivent idéalement se situer dans les limites de contrôle à 95 % de cette distribution (64) (65)
49. La base des données historiques du laboratoire relatives aux témoins négatifs doit à l’origine être constituée à partir d’au moins 10 expériences, sachant qu’il serait préférable qu’elle en compte au moins 20, réalisées dans des conditions expérimentales similaires. Les laboratoires doivent avoir recours à des méthodes de contrôle de la qualité telles que des graphiques statistiques [cartes C ou cartes X-barre, par exemple (65)] afin de déterminer la variabilité de leurs données de témoins positifs et négatifs et de démontrer leur maîtrise de la méthodologie (66). D’autres détails et recommandations sur la façon de regrouper et d’utiliser des données historiques sont fournis dans la littérature (64).
50. Les données des témoins négatifs désignent la fréquence des mutants issus de cultures réalisées en un seul exemplaire, ou de préférence de cultures répliquées, comme décrit au paragraphe 27. Les témoins négatifs concomitants se situent idéalement dans les limites de contrôle à 95 % de la distribution des données historiques des témoins négatifs contenues dans la base de données du laboratoire. Lorsque les données des témoins négatifs concomitants se situent en dehors des limites de contrôle à 95 %, leur inclusion dans la distribution des témoins historiques peut être acceptable à condition que ces données ne soient pas exagérément extrêmes et qu’il soit prouvé que le système d’essai est «sous contrôle» (voir paragraphe 49) et qu’il n’y a pas eu de défaillance technique ou d’erreur humaine.
51. Toute modification du protocole expérimental doit être étudiée en termes de cohérence avec les bases de données des témoins historiques existantes du laboratoire. Toute incohérence majeure doit conduire à l’établissement d’une nouvelle base de données des témoins historiques.
RÉSULTATS ET RAPPORT
Présentation des résultats
52. La présentation de données pour les essais sur cellules de lymphome de souris (MLA) et sur TK6 comprendra, pour les cultures traitées et témoins, les données requises pour le calcul de la cytotoxicité (CRT ou SR, respectivement) et les fréquences des mutants, comme décrit ci-dessous.
53. Pour l’essai MLA, les données seront présentées séparément pour chaque culture en ce qui concerne la CRS, la CRT, l’efficacité de clonage au moment de la sélection des mutants et le nombre de colonies de mutants (pour la version utilisant la diffusion en gélose) ou le nombre de puits vides (pour la version utilisant les micropuits). La fréquence des mutants sera exprimée par le nombre de cellules mutantes par million de cellules survivantes. Si la réponse est positive, les fréquences des mutants en petites et grandes colonies (et/ou le pourcentage de la fréquence des mutants totale) seront données pour au moins une concentration du produit chimique d’essai (en général la concentration positive la plus élevée) et les témoins positifs et négatifs. En cas de réponse négative, la fréquence des mutants en petite et en grande colonie doit être donnée pour le témoin négatif et pour le témoin positif.
54. Pour l’essai sur TK6, les données seront présentées séparément pour chaque culture en ce qui concerne la SR, l’efficacité de clonage au moment de la sélection de mutants et le nombre de puits vides pour les mutants apparaissant précocement et ceux apparaissant tardivement. La fréquence des mutants sera exprimée comme le nombre de cellules mutantes divisé par le nombre des cellules survivantes, et inclura la fréquence des mutants totale ainsi que la fréquence des mutants (et/ou le pourcentage de la fréquence des mutants totale) correspondant aux mutants apparaissant précocement ou tardivement.
Critères d’acceptabilité
55. Pour les essais MLA et sur TK6, il convient de veiller à ce que les critères suivants soient remplis avant de déterminer les résultats globaux pour un produit chimique d’essai spécifique:
— Deux conditions expérimentales (traitement de courte durée avec et sans activation métabolique — voir paragraphe 33) ont été testées, à moins que l’une d’entre elles ait abouti à des résultats positifs.
— Un nombre adéquat de cellules et de concentrations sont analysables (paragraphes 27 et 34 à 36).
— Les critères de sélection de la concentration maximale sont cohérents avec ceux décrits aux paragraphes 28 à 30.
Critères d’acceptabilité pour les témoins négatifs et positifs
56. L’analyse effectuée par le groupe d’experts sur les cellules de lymphome de souris de l’IWGT portant sur une grande quantité de données provenant de l’essai MLA a donné lieu à un consensus international sur des critères d’acceptabilité spécifiques de l’essai MLA (1) (2) (3) (4) (5). C’est pourquoi la présente méthode d’essai fournit des recommandations spécifiques pour la détermination de l’acceptabilité des témoins positifs et négatifs et pour l’évaluation des résultats d’une substance individuelle dans le cadre d’un essai MLA. La base de données relative à l’essai sur TK6 est beaucoup plus restreinte et n’a pas été évaluée par un groupe de travail.
57. Pour l’essai MLA, chaque expérience doit être évaluée afin de déterminer si le témoin non traité/avec solvant satisfait aux critères d’acceptabilité du groupe de travail MLA de l’IWGT ((4) et le tableau 2 ci-dessous) en ce qui concerne: (1) la fréquence des mutants (FM) (il est à noter que les FM acceptables selon l’IWGT sont différentes pour les versions utilisant la diffusion en gélose et celles utilisant des micropuits), (2) l’efficacité de clonage (EC) au moment de la sélection des mutants et (3) la croissance en suspension (CS) pour le témoin avec solvant (voir les formules à l’appendice 2).
Tableau 2
Critères d’acceptabilité pour l’essai sur cellules de lymphome de souris (MLA)
| Paramètre | Méthode gélose molle | Méthode micropuits
| Fréquence des mutants | 35 à 140 × 10-6 | 50 à 170 × 10-6
| Efficacité de clonage | 65 à 120 % | 65 à 120 %
| Croissance en suspension | 8 à 32 fois (3 à 4 heures de traitement) 32 à 180 fois (24 heures de traitement, si effectué) | 8 à 32 fois (3 à 4 heures de traitement) 32 à 180 fois (24 heures de traitement, si effectué)
58. Pour l’essai MLA, chaque test doit également être évalué pour déterminer si le ou les témoins positifs satisfont à au moins un des deux critères d’acceptabilité suivants définis par le groupe de travail de l’IWGT:
— Le témoin positif démontre une augmentation absolue de la fréquence des mutants totale, c’est-à-dire, une augmentation supérieure à la fréquence des mutants spontanée de fond [une fréquence des mutants induite (FMI) d’au moins 300 × 10-6]. Au moins 40 % de la FMI doit correspondre à la fréquence des mutants en petite colonie.
— Le témoin positif présente une augmentation de la fréquence des mutants en petite colonie d’au moins 150 × 10-6 supérieure à celle observée dans le témoin concomitant non traité/avec solvant (une FMI en petite colonie de 150 × 10-6).
59. Pour l’essai sur TK6, un essai sera acceptable si les données relatives au témoin négatif concomitant sont considérées comme pouvant être ajoutées à la base de données des témoins négatifs historiques du laboratoire (voir paragraphes 48 à 49). En outre, les témoins positifs concomitants (voir paragraphe 32) doivent induire des réponses compatibles avec celles générées dans la base de données des témoins positifs historiques et produire une augmentation statistiquement significative par rapport aux témoins négatifs concomitants.
60. Pour les deux essais, la limite supérieure de cytotoxicité observée dans la culture du témoin positif doit être la même que celle des cultures expérimentales. En d’autres termes, les CRT/SR ne doivent pas être inférieures à 10 %. Il est suffisant d’utiliser une seule concentration (ou une des concentrations des cultures de témoins positifs si plus d’une concentration est utilisée) pour démontrer que les critères d’acceptabilité pour le témoin positif sont respectés. De plus, la fréquence des mutants du témoin positif doit figurer dans la plage acceptable des valeurs établies pour le laboratoire.
Évaluation et interprétation des résultats
61. Pour l’essai MLA, le groupe d’experts sur les cellules de lymphome de souris de l’IWGT a consacré d’importants travaux à la pertinence biologique et aux critères d’une réponse positive par (4). C’est pourquoi la présente méthode d’esssai fournit des recommandations spécifiques pour l’interprétation des résultats de l’essai MLA concernant le produit chimique d’essai (voir paragraphes 62 à 64). La base de données relative à l’essai sur TK6 est beaucoup plus restreinte et n’a pas été évaluée par un groupe de travail. C’est pourquoi les recommandations concernant l’interprétation des données pour l’essai sur TK6 sont exprimées en termes plus généraux (voir paragraphes 65 et 66). Des recommandations complémentaires s’appliquent aux deux essais (voir paragraphes 67 à 71).
MLA
62. Il est recommandé d’adopter une approche permettant de définir les réponses positives et négatives afin de veiller à ce que l’augmentation de la fréquence des mutants soit biologiquement pertinente. Au lieu d’une analyse statistique généralement utilisée pour d’autres essais, cette approche s’appuie sur l’utilisation d’une fréquence de mutants induite prédéfinie (c’est-à-dire, une augmentation de la fréquence des mutants supérieure à celle du témoin concomitant), désignée sous le nom de Facteur d’évaluation global (FEG), et basée sur l’analyse de la distribution des données de fréquence des mutants du témoin négatif des laboratoires participants (4). Pour la version de l’essai MLA utilisant la méthode de diffusion en gélose, le FEG est de 90 × 10-6 et pour la version de l’essai MLA utilisant la méthode des micropuits, le FEG est de 126 × 10-6.
63. À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement positif si, dans les conditions expérimentales étudiées (voir paragraphe 33), l’augmentation de la fréquence des mutants au-delà de la fréquence de fond concomitante excède le FEG, et si cette augmentation est liée à la concentration (par exemple au moyen d’un test de tendance). Le produit chimique d’essai est alors considéré comme capable d’induire des mutations dans ce système d’essai.
64. À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement négatif si, dans toutes les conditions expérimentales étudiées (voir paragraphe 33), il n’y a pas de réponse liée à la concentration ou, si l’on observe une augmentation de la fréquence des mutants, celle-ci n’est pas supérieure au FEG. Le produit chimique d’essai est alors considéré comme incapable d’induire des mutations dans ce système d’essai.
TK6
65. À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement positif si, dans les conditions expérimentales étudiées (voir paragraphe 33):
— au moins une concentration d’essai présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;
— un test de tendance approprié montre que l’augmentation est liée à la concentration (voir paragraphe 33);
— les résultats se situent à l’extérieur de la plage de distribution des données des témoins négatifs historiques (limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson, par exemple; voir paragraphe 48).
Lorsque tous ces critères sont remplis, le produit chimique d’essai est considéré comme capable d’induire des mutations dans ce système d’essai. Des recommandations concernant les méthodes statistiques les plus appropriées sont disponibles dans la littérature (66) (67).
66. À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement négatif si, dans toutes les conditions expérimentales étudiées (voir paragraphe 33):
— aucune concentration d’essai ne présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;
— un test de tendance approprié montre qu’il n’y a pas d’augmentation liée à la concentration;
— l’intégralité des résultats se situe à l’intérieur de la distribution des données des témoins négatifs historiques (limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson, par exemple; voir paragraphe 48).
Le produit chimique d’essai est alors considéré comme incapable d’induire des mutations dans ce système d’essai.
Pour les deux essais MLA et sur TK6:
67. Si la concentration maximale est basée sur la cytotoxicité, la concentration la plus forte doit viser une CRT/SR comprise entre 20 et 10 %. De l’avis général, il faut faire preuve de prudence lors de l’interprétation de résultats positifs uniquement trouvés à une CRT/SR comprise entre 20 et 10 %, et un résultat ne doit être considéré comme positif que si l’augmentation de la fréquence des mutants se produit à une CRT/SR inférieure ou égale à 10 % (si évaluée) (2) (59).
68. Dans certaines circonstances, des informations supplémentaires peuvent aider à déterminer si un produit chimique d’essai n’est pas mutagène lorsqu’aucune culture ne présente une valeur de la CRT à une CRT/SR comprise entre 10 et 20 %. Ces circonstances sont les suivantes: (1) Il n’y a pas de signe de mutagénicité (par exemple, aucune relation dose-réponse, aucune fréquence des mutants supérieure à celles observées dans le témoin négatif concomitant ou les valeurs de fond historiques, etc.) dans une série de points de données situés entre 100 % et 20 % de CRT/RS, et présence d’au moins un point de données entre 20 % et 25 % de CRT/RS. (2) Il n’y a pas de signe de mutagénicité (par exemple, aucune relation dose-réponse, aucune fréquence des mutants supérieure à celles observées dans le témoin négatif concomitant ou les valeurs de fond historiques, etc.) dans une série de points de données situées entre 100 % et 25 % de CRT/RS, et présence d’un point de données négatif légèrement inférieur à 10 % de CRT/RS. Dans ces deux cas, il peut être conclu que le produit chimique d’essai est négatif.
69. Il n’est pas nécessaire de vérifier une réponse clairement positive ou négative.
70. Lorsque la réponse n’est ni clairement négative ni clairement positive, tel que décrit ci-dessus, ou en vue d’établir la signification biologique d’un résultat, les données doivent être soumises à un jugement d’expert et/ou des investigations plus poussées. Il peut être utile de répéter l’expérience, éventuellement dans des conditions expérimentales modifiées [espacement des concentrations de façon à augmenter la probabilité d’atteindre des points de données dans la plage de valeurs de 10 à 20 % de CRT/SR, autres conditions d’activation métabolique (c’est-à-dire, concentration de S9 ou origine de S9) et durée du traitement, par exemple].
71. Dans de rares cas, même après de nouvelles investigations, l’ensemble de données ne permettra pas de conclure que les résultats sont positifs ou négatifs. La réponse au produit chimique d’essai devra alors être considérée comme équivoque (et donc potentiellement aussi bien positive que négative).
RAPPORT D’ESSAI
72. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Produit chimique d’essai:
— source, numéro de lot, date limite d’utilisation si disponibles;
— stabilité du produit chimique d’essai, si elle est connue;
— solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant, si elles sont connues;
— mesure du pH, de l’osmolalité et de la précipitation dans le milieu de culture auquel le produit chimique d’essai a été ajouté, le cas échéant.
Substance mono-constituant:
— apparence physique, hydrosolubilité, autres propriétés physico-chimiques importantes pour la conduite de l’étude;
— identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés, s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.
Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:
— caractérisés autant que possible par l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence, la quantité et les propriétés physico-chimiques des constituants.
Solvant:
— justification du choix du solvant;
— pourcentage de solvant présent dans le milieu de culture final.
Cellules:
Pour les cultures mères du laboratoire:
— type et source des cellules, et antécédents dans le laboratoire d’essai;
— caractéristiques du caryotype et/ou nombre modal de chromosomes;
— méthodes d’entretien des cultures cellulaires;
— absence de mycoplasmes;
— temps de doublement des cellules.
Conditions de l’essai:
— justification du choix des concentrations et du nombre de cultures, y compris données concernant la cytotoxicité et les limites de solubilité, par exemple;
— composition du milieu, concentration de CO2, degré d’humidité;
— concentration du produit chimique d’essai sous la forme de sa concentration finale dans le milieu de culture (par exemple, en μg ou mg/ml ou mM du milieu de culture);
— concentration (et/ou volume) de solvant et de produit chimique d’essai ajoutée au milieu de culture;
— température d’incubation;
— temps d’incubation;
— durée du traitement;
— densité des cellules pendant le traitement;
— type et composition du système d’activation métabolique (source du S9, méthode de préparation du mélange S9, concentration ou volume de mélange S9 et de S9 dans le milieu de culture final, contrôles de la qualité du S9);
— substances témoins positives et négatives, concentrations finales pour chacune des conditions de traitement;
— durée de la période d’expression (avec le nombre de cellules déposées et de repiquages et les programmes de nutrition, le cas échéant);
— identité de l’agent sélectif et sa concentration;
— pour l’essai MLA, la version utilisée (méthode de diffusion en gélose ou micropuits) doit être précisée;
— critères d’acceptabilité des essais;
— méthodes utilisées pour dénombrer les cellules viables et les cellules mutantes;
— méthodes utilisées pour mesurer la cytotoxicité;
— toute information supplémentaire concernant la cytotoxicité et la méthode utilisée;
— temps d’incubation après étalement sur une plaque;
— définition des colonies dont le type et la taille sont pris en compte (y compris les critères pour les «petites» et «grandes» colonies, le cas échéant);
— critères pour conclure que l’étude est positive, négative ou équivoque;
— méthodes utilisées pour déterminer le pH et l’osmolalité, si cela a été effectué, et la précipitation, si cela est pertinent.
Résultats:
— nombre de cellules exposées et nombre de cellules repiquées pour chaque culture;
— paramètres de toxicité (CRT pour l’essai MLA et SR pour l’essai sur TK6);
— signes de précipitation et moment de la détermination;
— nombre de cellules étalées sur plaque dans un milieu sélectif et dans un milieu non sélectif;
— nombre de colonies dans un milieu non sélectif et nombre de colonies résistantes dans un milieu sélectif, et fréquences de mutants correspondantes;
— taille des colonies pour les témoins négatifs et positifs et, si le produit chimique est positif, au moins une concentration, et fréquences des mutants correspondantes;
— relation concentration-réponse, si possible;
— données relatives aux témoins négatifs (solvants) et positifs (concentrations et solvants) concomitants;
— données relatives aux témoins négatifs (solvants) et positifs (concentrations et solvants) historiques, y compris ordres de grandeur, moyennes, écarts-types, nombre d’essais sur lesquels les témoins historiques sont basés;
— analyses statistiques (pour chaque culture et chaque lot de réplicats, le cas échéant), et valeurs p, le cas échéant; et pour l’essai MLA, évaluation du FEG.
Discussion des résultats.
Conclusion
BIBLIOGRAPHIE
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B.68 MÉTHODE D’ESSAI D’EXPOSITION DE COURTE DURÉE IN VITRO POUR L’IDENTIFICATION DES PRODUITS CHIMIQUES i) PROVOQUANT DES LÉSIONS OCULAIRES GRAVES OU ii) NE RELEVANT D’AUCUNE CLASSIFICATION POUR IRRITATION OCULAIRE OU LÉSION OCULAIRE GRAVE
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrie 491 (2017) de l’OCDE. La méthode d’exposition de courte durée (Short Time Exposure, STE) est une méthode d’essai in vitro qui, dans certaines circonstances et assortie de restrictions spécifiques, peut être utilisée pour la classification des dangers et l’étiquetage des produits chimiques (substances et mélanges) provoquant des lésions oculaires graves ou ne relevant d’aucune classification pour lésion oculaire grave ou irritation oculaire, conformément au Système général harmonise de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies (ONU) (1) et au règlement (CE) no 1272/2008 de l’Union européenne relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges (ci-après le «règlement CLP»).
2. Pendant de nombreuses années, les dangers potentiels pour l’œil que présentent les produits chimiques ont été principalement évalués par des tests in vivo effectués sur des yeux de lapins (méthode d’essai B.5, équivalente à la ligne directrice 405 de l’OCDE). Il est généralement admis que dans notre horizon de prévision, aucun essai unique d’irritation oculaire in vitro ne pourra remplacer le test in vivo sur œil de lapin pour établir le degré d’irritation ou de lésion oculaire grave provoque par les différentes classes de produits chimiques. Cependant, la combinaison de plusieurs méthodes de substitution dans le cadre d’une stratégie d’essais (à plusieurs niveaux) pourrait remplacer le test sur les yeux de lapin (2). L’approche «top-down» est indiquée lorsque, d’après les informations existantes, on s’attend à̀ ce qu’un produit chimique soit fortement irritant ou puisse provoquer de graves lésions oculaires, alors que l’approche «bottom-up» est conçue pour être appliquée quand, au vu des informations existantes, un produit chimique devrait a priori ne pas causer une irritation oculaire suffisante pour nécessiter une classification. Alors que la méthode STE n’est pas jugée valable pour remplacer purement et simplement la méthode d’essai in vivo sur œil de lapin, son utilisation est acceptable comme élément d’une stratégie d’essai à plusieurs niveaux visant à établir une classification et un étiquetage réglementaires, telle que l’approche «top-down»/«bottom-up», pour identifier sans experimentation supplémentaire les produits chimiques (i) provoquant des lésions oculaires graves (catégorie 1 du SGH de l’ONU/du règlement CLP) et (ii) les produits chimiques (à l’exception des substances hautement volatiles et de tous les produits solides autres que les tensioactifs) qui ne nécessitent aucune classification pour irritation oculaire ou lésion oculaire grave («sans catégorie» du SGH de l’ONU/du règlement CLP) (1) (2). Toutefois, un produit chimique qui, avec la méthode STE, n’est pas identifié comme provoquant des lésions oculaires graves (catégorie 1 du SGH de l’ONU/du règlement CLP) ou comme ne relevant d’aucune classification («sans catégorie» du SGH de l’ONU/du règlement CLP) nécessiterait d’être soumis à des essais complémentaires visant à établir une classification définitive. En outre, les autorités réglementaires compétentes devraient être consultées avant de mettre en œuvre la méthode STE dans une approche «bottom-up» dans le cadre d’autres systèmes de classification que le SGH de l’ONU/du règlement CLP. Le choix de la méthode d’essai la plus pertinente et l’utilisation de cette méthode d’essai doivent être envisagés dans le contexte du Document d’orientation de l’OCDE sur les Approches Intégrées sur les Essais et l’Évaluation pour les lésions oculaires sévères et l’irritation de l’œil (14).
3. L’objet de la présente méthode d’essai est de décrire les procédures utilisées pour évaluer le danger potentiel qu’un produit chimique d’essai présente pour l’œil, mesure par le caractère cytotoxique du produit chimique lors d’un test d’exposition de courte durée (STE). L’effet cytotoxique des produits chimiques sur les cellules épithéliales cornéennes est un mécanisme d’action important qui provoque des lésions de l’épithélium cornéen et une irritation oculaire. Dans la méthode d’essai STE, la viabilité cellulaire est évaluée par un dosage quantitatif des cristaux de formazan bleu extraits des cellules et produits par les cellules vivantes lors de la conversion enzymatique du colorant vital MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium), encore appelé Bleu de thiazol (3). La viabilité cellulaire observée est comparée à celle du témoin avec solvant (viabilité relative) et utilisée comme estimation du danger potentiel pour les yeux que présente le produit chimique d’essai. Les produits chimiques d’essai sont classés dans la catégorie 1 du SGH de l’ONU/du règlement CLP lorsqu’une viabilité cellulaire inférieure ou égale à (≤) 70 % est observée aux deux concentrations testées (5 % et 0,05 %). À l’inverse, les produits chimiques pour lesquels la viabilité cellulaire est supérieure à (>) 70 % aux deux concentrations testées (5 % et 0,05 %) sont classés «sans catégorie» selon le système SGH/le règlement CLP.
4. Dans la présente méthode d’essai, le terme «produit chimique d’essai» désigne ce qui est testé et ne fait pas référence à l’applicabilité de la méthode STE pour les essais sur des substances et/ou mélanges. Les définitions sont données à l’appendice 1.
REMARQUES PRELIMINAIRES ET LIMITES
5. La présente méthode d’essai est basée sur un protocole expérimental mis au point par Kao Corporation (4). Ce protocole a fait l’objet de deux études de validation différentes: l’une par le Comité de validation de la Société japonaisepour les méthodes alternatives aux expérimentations animales (JSAAE) (5), l’autre par le Centre japonais de validation des méthodes alternatives (JaCVAM) (6). Un examen par les pairs a été conduit par le NICEATM/ICCVAM sur la base des rapports des études de validation et des documents de référence (BRD) relatifs à la méthode d’essai (7).
6. Lors de l’utilisation de la méthode d’essai STE pour l’identification de produits chimiques (substances et mélanges) pouvant provoquer de graves lésions oculaires (Catégorie 1 du SGH de l’ONU (1)/du règlement CLP), les données obtenues pour 125 produits chimiques (substances et mélanges) ont démontré une précision globale de la méthode de 83 % (104/125), un taux de faux positifs de 1 % (1/86) et un taux de faux négatifs de 51 % (20/39) par comparaison avec les données obtenues avec la méthode in vivo sur œil de lapin (7). Le taux de faux négatif observé n’est pas préoccupant dans le contexte de cet essai, étant donné que tous les produits chimiques qui induisent une viabilité cellulaire ≤ 70 % à une concentration de 5 % et > 70 % à une concentration de 0,05 % devront être testés à nouveau à l’aide de méthodes d’essai in vitro dûment validées ou, en dernier recours, avec la méthode in vivo sur œil de lapin, en fonction des exigences de la réglementation et selon la démarche expérimentale séquentielle fondée sur l’analyse du poids de la preuve actuellement recommandée (1) (8). Ce sont principalement des substances mono-constituant qui ont été testées, même si l’on dispose également d’un nombre limité de données relatives à l’essai de mélanges. La méthode est néanmoins techniquement applicable aux essais de substances multi-constituants et de mélanges. Toutefois, avant d’appliquer la présente méthode d’essai à un mélange pour obtenir des données à des fins réglementaires, il convient de vérifier si et, dans l’affirmative, pourquoi les résultats peuvent être acceptables dans le cadre réglementaire imposé. De telles considérations ne sont pas nécessaires quand les exigences réglementaires stipulent que le mélange doit être testé. Aucune autre limite particulière de la méthode d’essai STE n’a été mise en évidence lors de son application pour l’identification de produits chimiques de la catégorie 1 du SGH de l’ONU/du règlement CLP. L’application de cette méthode d’essai peut être envisagée pour tester des produits chimiques, une viabilité cellulaire ≤ 70 % aux deux concentrations (5 % et 0,05 %) étant alors considérée comme l’indicateur d’un effet provoquant des lésions oculaires graves qui justifie de classer le produit chimique d’essai dans la catégorie 1 du SGH de l’ONU/du règlement CLP sans mener d’essai complémentaire.
7. Lors de l’utilisation de la méthode d’essai STE pour l’identification de produits chimiques (substances et mélanges) ne relevant d’aucune classification pour irritation oculaire ou lésion oculaire grave («sans catégorie» du SGH de l’ONU/du règlement CLP), les données obtenues pour 130 produits chimiques (substances et mélanges) ont démontré une précision globale de la méthode de 85 % (110/130), un taux de faux négatifs de 12 % (9/73) et un taux de faux positifs de 19 % (11/57) par comparaison avec les résultats obtenus avec la méthode in vivo sur œil de lapin (7). Si l’on exclut des données celles relatives aux substances hautement volatiles et aux substances solides autres que les tensioactifs, la précision globale est de 90 % (92/102), le taux de faux négatifs est de 2 % (1/54) et le taux de faux positifs est de 19 % (9/48) (7). En conséquence, la limite potentielle de la méthode d’essai STE lors d’une utilisation pour l’identification de substances ne relevant d’aucune classification pour irritation oculaire ou lésion oculaire grave («sans catégorie» du SGH de l’ONU/du règlement CLP) est un taux élevé de faux négatifs pour i) les substances hautement volatiles présentant une pression de vapeur supérieure à 6 kPa et pour ii) les produits chimiques solides (substances et mélanges) en dehors des tensioactifs et mélanges composés uniquement de tensioactifs. Ces produits chimiques sont exclus du domaine d’applicabilité de la méthode d’essai STE (7).
8. Outre les données relatives aux produits chimiques mentionnés aux paragraphes 6 et 7, les ensembles de données générés avec la méthode d’essai STE comprennent des données internes pour 40 mélanges, lesquelles, par comparaison avec les données issues des essais selon la méthode in vivo de Draize, démontrent une précision de la méthode de 88 % (35/40), un taux de faux positifs de 50 % (5/10), et un taux de faux négatifs de 0 % (0/30) pour l’analyse de mélanges ne relevant d’aucune classification selon le SGH de l’ONU/le règlement CLP (9). La méthode d’essai STE est donc applicable dans une approche «bottom-up» pour l’identification de mélanges «sans catégorie» dans le SGH de l’ONU/le règlement CLP, à l’exception des mélanges solides autres que ceux composés uniquement de tensioactifs, par extension des limitations applicables aux substances solides exprimées au paragraphe 7. De plus, les mélanges qui contiennent des substances présentant une pression de vapeur supérieure à 6 kPa doivent être analysés avec attention pour éviter toute sous-évaluation et leur cas doit être justifié un à un.
9. La méthode d’essai STE ne peut être utilisée pour l’identification de produits chimiques relevant de la catégorie 2 du SGH de l’ONU/du règlement CLP ou de la catégorie 2A (irritation oculaire) ou 2B (légère irritation oculaire) du SGH de l’ONU, en raison du nombre considérable de produits chimiques de la catégorie 1 du SGH de l’ONU/du règlement CLP sous-évalués dans les catégories 2, 2A ou 2B, et de produits chimiques ne relevant d’aucune catégorie du SGH de l’ONU/du règlement CLP surévalués dans les catégories 2, 2A ou 2B (7). Aussi pourrait-il être nécessaire de mener des essais complémentaires avec une autre méthode adaptée.
10. La méthode d’essai STE convient pour des produits chimiques d’essai dissous ou en suspension uniforme pendant au moins 5 minutes dans du sérum physiologique, dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 5 % dans une solution saline, ou dans une huile minérale. La méthode d’essai STE ne convient pas pour des produits chimiques insolubles ou qui ne peuvent pas être en suspension uniforme pendant au moins 5 minutes dans du sérum physiologique, dans du DMSO à 5 % en solution saline, ou dans une huile minérale. L’utilisation d’une huile minérale dans la méthode d’essai STE est possible car il s’agit d’une exposition de courte durée. En conséquence, la méthode d’essai STE convient pour prévoir le potentiel de dangerosité pour les yeux de produits chimiques d’essai insolubles dans l’eau (alcools gras à longue chaine ou cétones, par exemple), à condition que ces produits chimiques soient solubles dans au moins l’un des trois solvants proposés ci-avant (4).
11. Dans la présente méthode d’essai, le terme «produit chimique d’essai» désigne ce qui est testé et ne fait pas référence à l’applicabilité de la méthode d’essai STE aux substances et/ou aux mélanges.
PRINCIPE DE L’ESSAI
12. La méthode d’essai STE est un test in vitro de cytotoxicité, réalisé sur une monocouche confluente de fibroblastes de cornée de lapin du Statens Seruminstitut (SIRC), cultivés sur des plaques microtitres 96 puits (4). Après 5 minutes d’exposition à un produit chimique d’essai, on détermine quantitativement la cytotoxicité en mesurant, à l’aide du test MTT (4), la viabilité relative des cellules SIRC. L’observation d’une diminution de la viabilité cellulaire est utilisée pour prédire les effets indésirables potentiels pouvant provoquer des lésions oculaires.
13. Il a été signalé que 80 % d’une solution appliquée sur l’œil d’un lapin est excrétée via le sac conjonctival dans les trois à quatre minutes, tandis que plus de 80 % d’une solution appliquée sur l’œil humain est excrétée en une à deux minutes (10). La méthode d’essai STE vise à s’approcher de ces durées d’exposition et prend comme effet mesuré la cytotoxicité pour évaluer les lésions subies par les cellules SIRC après cinq minutes d’exposition au produit chimique d’essai.
DÉMONSTRATION DES COMPÉTENCES
14. Avant d’utiliser en routine la méthode d’essai STE décrite dans la présente méthode d’essai, les laboratoires doivent démontrer leurs compétences techniques en classant correctement les onze substances recommandées au tableau 1. Ces substances ont été sélectionnées pour représenter l’ensemble de la gamme des réponses correspondant à des lésions oculaires graves ou à une irritation oculaire, sur la base des résultats obtenus in vivo avec le test sur œil de lapin (LD 405) et du système de classification SGH de l’ONU/du règlement CLP (1). La disponibilité des substances dans le commerce, l’existence de données de référence in vivo de bonne qualité, et l’existence de données de bonne qualité issues de la méthode d’essai STE in vitro constituent d’autres critères de sélection (3). Si un des produits chimiques de la liste n’est pas disponible ou si cela se justifie, on pourra utiliser un autre produit chimique pour lequel des données de références acceptables in vitro et in vivo sont disponibles, à condition de retenir les mêmes critères que ceux retenus dans la présente Ligne directrice.
Tableau 1
Liste des produits chimiques d’épreuve de compétence
Abréviations: Numéro CAS = Numéro d’enregistrement auprès du Chemical Abstracts Service
| Substance | No CAS | Classe chimique | État physique | Cat. SGH ONU/CLP In vivo | Solvant dans essai STE | Cat. SGH ONU/CLPSTE
| Chlorure de benzalkonium (10 %, aqueux) | 8001-54-5 | Composé onium | Liquide | Catégorie 1 | Solution saline | Catégorie 1
| Triton X-100 (100 %) | 9002-93-1 | Éther | Liquide | Catégorie 1 | Solution saline | Catégorie 1
| Acid Red 92 | 18472-87-2 | Hétérocycle; composé bromé; composé chloré | Solide | Catégorie 1 | Solution saline | Catégorie 1
| Hydroxyde de sodium | 1310-73-2 | Alcali; produit chimique inorganique | Solide | Catégorie 1 | Solution saline | Catégorie 1
| Butyrolactone | 96-48-0 | Lactone; hétérocycle | Liquide | Catégorie 2A (Catégorie 2 dans le CLP) | Solution saline | Aucune prédiction ne peut être faite
| Octan-1-ol | 111-87-5 | Alcool | Liquide | Catégorie 2A/B(Catégorie 2 dans le CLP) | Huile minérale | Aucune prédiction ne peut être faite
| Cyclopentanol | 96-41-3 | Alcool; hydrocarbure, cyclique | Liquide | Catégorie 2A/B (Catégorie 2 dans le CLP) | Solution saline | Aucune prédiction ne peut être faite
| Acétate de 2-éthoxyéthyle | 111-15-9 | Alcool; éther | Liquide | Sans catégorie | Solution saline | Sans catégorie
| Dodécane | 112-40-3 | Hydrocarbure, acyclique | Liquide | Sans catégorie | Huile minérale | Sans catégorie
| Méthylisobutylcétone | 108-10-1 | Cétone | Liquide | Sans catégorie | Huile minérale | Sans catégorie
| Sulfate de 1,1-diméthylguanidine | 598-65-2 | Amidine; composé du soufre | Solide | Sans catégorie | Solution saline | Sans catégorie
PROCÉDURE
Préparation de la monocouche cellulaire
15. La lignée cellulaire de cornée de lapin SIRC est utilisée dans la méthode d’essai STE. Il est recommandé d’acquérir les cellules SIRC auprès d’une banque de cellules reconnue, par exemple la lignée CCL60 auprès de l’American Type Culture Collection.
16. Les cellules SIRC sont cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % CO2, dans un flacon contenant un milieu de culture constitué de milieu essentiel minimal d’Eagle (MEM) supplémenté avec 10 % de sérum de veau fétal (SVF), 2 mM de L-glutamine, 50-100 unités/ml de pénicilline et 50-100 μg/ml de streptomycine. Les cellules devenues confluentes dans le flacon de culture doivent être séparées à l’aide d’une solution de trypsine-acide éthylènediaminetétraacétique, avec ou sans raclette. Les cellules sont repiquées dans un flacon de culture (par exemple, 2 ou 3 repiquages) avant d’être utilisées dans les tests de routine et ne doivent pas être utilisées après plus de 25 repiquages après décongélation.
17. Les cellules prêtes à être utilisées dans l’essai STE sont préparées à la densité adaptée et ensemencées dans une plaque microtitre 96 puits. La densité d’ensemencement recommandée est de 6,0 × 103 cellules par puits lorsque les cellules sont utilisées quatre jours après l’ensemencement, ou 3,0 × 103 cellules par puits lorsque les cellules sont utilisées cinq jours après l’ensemencement, pour un volume de culture de 200 μl. Les cellules utilisées dans le test STE ensemencées dans un milieu de culture à la densité adéquate atteignent une confluence supérieure à 80 % au moment de l’essai, c’est-à-dire quatre ou cinq jours après l’ensemencement.
Application des produits chimique d’essai et des substances témoins
18. Il est recommandé de commencer par dissoudre ou suspendre le produit chimique d’essai dans du sérum physiologique. Si le produit chimique d’essai est peu soluble, insoluble ou ne peut pas être mis en suspension uniforme pendant au moins 5 minutes dans du sérum physiologique, du DMSO à 5 % (N°CAS 67-68-5) dans une solution saline peut alors être choisi comme solvant. Si le produit chimique ne peut être dissous ou mis en suspension uniforme pendant 5 minutes, soit dans du sérum physiologique, soit dans du DMSO à 5 % dans une solution saline, le troisième solvant possible est une huile minérale (N°CAS 8042-47-5).
19. Les produits chimiques d’essai sont dissous ou uniformément suspendus à une concentration de 5 % (m/v) dans le solvant choisi, puis une série de dilutions de facteur 10 est réalisée jusqu’à obtention de concentration à 0,5 % et 0,05 %. Chaque produit chimique est testé aux deux concentrations (5 % et 0,05 %). Les cellules cultivées sur la plaque 96 puits sont exposées à 200 μl/puits de la solution (ou suspension) de produit chimique à 5 %, ou à 0,05 %, pendant 5 minutes à température ambiante. Les produits chimiques (substances mono-constituant, ou substances ou mélanges multi-constituants) sont considérés comme purs et dilués ou suspendus selon la présente méthode, quel que soit leur degré de pureté.
20. Le milieu de culture décrit au paragraphe 16 est utilisé comme témoin pour chaque plaque de chaque répétition. En outre, les cellules sont aussi exposées, pour chaque plaque de chaque répétition, à des échantillons témoins de solvant. Il a été confirmé que les solvants indiqués au paragraphe 18 n’ont aucun effet indésirable sur la viabilité des cellules SIRC.
21. Dans la méthode d’essai STE, du laurylsulfate de sodium (SLS) à 0,01 % dans une solution physiologique est utilisé comme témoin positif pour chaque plaque de chaque répétition. Afin de calculer la viabilité cellulaire en présence du témoin positif, chaque plaque de chaque répétition comprend aussi un témoin avec une solution physiologique.
22. Un blanc est nécessaire afin de déterminer la compensation de densité optique par la solution tampon, et ne contient que le tampon phosphate en solution physiologique, sans calcium ni magnésium (PBS-) ni cellule.
23. Chaque échantillon (produit chimique d’essai à 5 % ou 0,05 %, témoin avec milieu, témoin avec solvant et témoin positif) est testé avec trois réplicats pour chaque répétition, en exposant les cellules à 200 μl du produit chimique approprié (d’essai ou témoin) pendant cinq minutes à température ambiante.
24. Des substances étalons peuvent s’avérer utiles pour évaluer le potentiel d’irritation oculaire de produits chimiques inconnus relevant de classes spécifiques de substances chimiques ou de produits, ou encore pour évaluer le potentiel d’irritation relatif d’un irritant oculaire dans une gamme spécifique de réactions d’irritation.
Mesures de la viabilité cellulaire
25. Après l’exposition, les cellules sont rincées deux fois dans 200 μl de PBS, puis 200 μl de solution MTT (0,5 mg MTT/ml de milieu de culture) sont ajoutés. Après deux heures de réaction dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2), la décantation de la solution de MTT est effectuée, le MTT formazan est extrait par l’ajout de 200 μl de 40 mM isopropanol-acide chlorhydrique pendant 60 minutes dans le noir à température ambiante, et l’absorbance de la solution de MTT formazan est mesurée à 570 nm avec un lecteur de plaque. Il n’y a interférence entre le produit chimique d’essai et le MTT (due à des colorants ou à des réducteurs directs du MTT) que si une quantité significative de produit chimique d’essai perdure dans le système d’essai après le rinçage, ce qui est le cas avec la cornée humaine reconstituée en 3D ou avec les tissus de l’épiderme humain reconstitués, mais est sans incidence pour les cultures cellulaires en 2D utilisées dans la méthode d’essai STE.
Interprétation des résultats et modèle de prévision
26. Les valeurs de densité optique (DO) obtenues pour chaque produit chimique d’essai sont ensuite utilisées pour calculer la viabilité cellulaire exprimée relativement à celle du témoin avec solvant, fixée à 100 %. La viabilité cellulaire relative est exprimée en pourcentage et obtenue en divisant la DO du produit chimique d’essai par la DO du témoin avec solvant, après soustraction de la DO du blanc de chaque valeur.
Viabilité cellulaire(%) OD570 produit chimique d'essai OD570 blancOD570 témoin avec solvant OD570 of blanc 100
De même, la viabilité cellulaire de chaque témoin avec solvant est exprimée en pourcentage et s’obtient en divisant la DO de chaque témoin avec solvant par la DO du témoin avec milieu, après soustraction de la DO du blanc de chaque valeur.
27. Trois répétitions indépendantes, chacune contenant trois réplicats (soit 9 puits), sont réalisées. On utilise la moyenne arithmétique des trois puits pour chaque produit chimique d’essai et chaque témoin de solvant dans chaque répétition indépendante pour calculer la moyenne arithmétique de la viabilité cellulaire relative. La moyenne arithmétique finale de la viabilité cellulaire est calculée à partir des trois répétitions indépendantes.
28. Les valeurs seuils de la viabilité cellulaire pour l’identification des produits chimiques testés induisant des lésions oculaires graves (catégorie 1 du SGH de l’ONU/du règlement CLP) ou ne relevant d’aucune classification pour irritation oculaire ou lésion oculaire grave («Sans catégorie» du SGH de l’ONU/du règlement CLP) sont fournies ci-après.
Tableau 2
Modèle de prédiction de la méthode d’essai STE
| Viabilité cellulaire | Classification SGH ONU/CLP | Applicabilité
| À 5 % | À 0,05 %
| > 70 % | > 70 % | Sans Categorie | Substances et mélanges, à l’exception: i) des substances hautement volatiles présentant une pression de vapeur supérieure à 6 kPa et ii) des produits chimiques (substances et mélanges) solides sauf les tensioactifs et les mélanges composés uniquement de tensioactifs
| ≤ 70% | > 70 % | Aucune prédiction ne peut être faite | Non applicable
| ≤ 70% | ≤ 70% | Categorie 1 | Substances et mélanges
Critères d’acceptabilité
29. L’acceptabilité des résultats de l’essai repose sur les critères suivants:
a) La densité optique du témoin avec milieu (exposé au milieu de culture) est supérieure ou égale à 0,3 après soustraction de la densité optique du blanc.
b) La viabilité du témoin avec solvant est supérieure ou égale à 80 % par rapport à celle du témoin avec milieu. Lorsque plusieurs témoins avec solvant sont utilisés à chaque répétition, chacun de ces témoins devra démontrer une viabilité cellulaire supérieure à 80 % pour qualifier les produits chimiques quand ceux-ci ont été testés avec ces solvants.
c) La viabilité cellulaire obtenue avec le témoin positif (0,01 % SLS) est comprise dans un intervalle de deux écarts-types de la moyenne historique. Les limites d’acceptabilité supérieure et inférieure pour le témoin positif sont régulièrement mises à jour, tous les trois mois ou à chaque fois qu’un essai acceptable est mené dans des laboratoires conduisant peu fréquemment (c’est-à-dire moins d’une fois par mois) ce type d’étude. Lorsqu’un laboratoire n’a pas réalisé un nombre suffisant d’expériences pour établir une distribution de témoins positifs statistiquement robuste, il est acceptable d’utiliser les limites d’acceptabilité supérieure et inférieure établies au moment de la mise au point de la méthode – soit entre 21,1 % et 62,3 % d’après les données expérimentales historiques – et de déterminer la distribution interne au cours des premiers tests de routine.
d) L’écart-type de la viabilité cellulaire finale pour le produit chimique d’essai, issu de trois répétitions indépendantes, est inférieur à 15 % pour les deux concentrations, 5 % et 0,05 %.
Si l’un de ces critères au moins n’est pas rempli, les résultats sont tenus pour non valides et trois répétitions indépendantes supplémentaires doivent être menées.
RÉSULTATS ET RAPPORT
Résultats
30. Les données de chaque puits (les valeurs de viabilité cellulaire, par exemple) pour chaque répétition, ainsi que la moyenne générale, l’écart-type et la classification doivent être rapportés.
Rapport d’essai
31. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Produit chimique d’essai et substances témoins
— Substance mono-constituant: identification chimique, telle que désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro(s) CAS, code SMILES ou InChi, formule structurale, et/ou autres identifiants;
— Substance multi-constituants, UVCB et mélange: caractérisation, dans la mesure du possible, par exemple par l’identité chimique (voir ci-dessus), la pureté, les caractéristiques quantitatives et les propriétés physico-chimiques pertinentes (voir ci-dessus) des constituants, selon les données disponibles;
— État physique, volatilité, pH, LogP, poids moléculaire, classe chimique et autres propriétés physico-chimiques pertinentes pour la conduite de l’essai, selon les données disponibles;
— Pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc;
— Traitement avant essai, s’il y a lieu (chauffage, broyage, par exemple);
— Conditions de stockage et stabilité, selon les données disponibles.
Conditions d’application et mode opératoire de la méthode d’essai
— Nom et adresse du donneur d’ordre, de l’installation d’essai et du directeur de l’étude;
— Description de la méthode d’essai utilisée;
— Lignée cellulaire utilisée et source, nombre de repiquages et degré de confluence des cellules utilisées pour l’essai;
— Détails de la procédure d’essai utilisée;
— Nombre de répétitions et de réplicats utilisés;
— Concentrations de produit chimique d’essai utilisées (si différente des recommandations);
— Justification du choix de solvant pour chaque produit chimique d’essai;
— Durée d’exposition au produit chimique d’essai (si différente des recommandations);
— Description de toutes modifications apportées au mode opératoire;
— Description des critères d’évaluation et de décision appliqués;
— Référence à la moyenne et à l’écart-type historiques du témoin positif;
— Démonstration de la compétence du laboratoire dans l’application de la méthode d’essai (en testant les substances d’épreuve, par exemple) ou démonstration de performances adéquates répétées dans l’application de la méthode d’essai.
Résultats
— Pour chaque produit chimique d’essai et substance témoin, et chaque concentration testée, un tableau présente les valeurs de DO individuelles obtenues pour chaque puits (réplicat), la moyenne arithmétique des valeurs de DO pour chaque répétition indépendante, le pourcentage (%) de viabilité cellulaire pour chaque répétition indépendante, ainsi que la moyenne arithmétique finale du pourcentage (%) de viabilité cellulaire et l’écart-type pour les trois répétitions;
— Résultats pour le témoin avec milieu, le témoin avec solvant et le témoin positif démontrant que les critères d’acceptabilité pour l’étude sont remplis;
— Description des autres effets observés;
— Classification globale obtenue compte tenu du modèle de prédiction / des critères de décision utilisés.
Discussion des résultats
Conclusions
BIBLIOGRAPHIE
(1) ONU. (2013). Système Général Harmonisé de Classification et d’Etiquetage des Produits Chimiques (SGH), Cinquième édition révisée, New York & Genève: Publications des Nations Unies. ISBN: 978-92-1-117006-1. Disponible à l’adresse: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_f.html.
(2) Scott L, et al. (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-Up and Top-Down Approaches. Toxicol. In Vitro 24, 1-9.
(3) Mosmann T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to 7 Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65, 55-63.
(4) Takahashi Y, et al. (2008). Development of the Short Time Exposure (STE) Test: an In Vitro Eye Irritation Test Using SIRC Cells. Toxicol. In Vitro 22,760-770.
(5) Sakaguchi H, et al. (2011). Validation Study of the Short Time Exposure (STE) Test to Assess the Eye Irritation Potential of Chemicals. Toxicol. In Vitro 25,796-809.
(6) Kojima H, et al. (2013). Second-Phase Validation of Short Time Exposure Tests for Assessment of Eye Irritation Potency of Chemicals. Toxicol. In Vitro 27, pp.1855-1869.
(7) ICCVAM (2013). Short Time Exposure (STE) Test Method Summary Review Document, NIH. Available at: [http://www.ntp.niehs.nih.gov/iccvam/docs/ocutox_docs/STE-SRD-NICEATM-508.pdf].
(8) Chapitre B.5 de la présente annexe, Effet irritant/corrosif aigu sur les yeux.
(9) Saito K, et al. (2015). Predictive Performance of the Short Time Exposure Test for Identifying Eye Irritation Potential of Chemical Mixtures.
(10) Mikkelson TJ, Chrai SS and Robinson JR. (1973). Altered Bioavailability of Drugs in the Eye Due to Drug-Protein Interaction. J. Pharm. Sci.1648-1653.
(11) ECETOC (1998). Eye Irritation Reference Chemicals Data Bank. Technical Report (No 48. (2)), Brussels, Belgium.
(12) Gautheron P, et al. (1992). Bovine Corneal Opacity and Permeability Test: an In Vitro Assay of Ocular Irritancy. Fundam Appl Toxicol. 18, 442–449.
(13) OCDE (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34). Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
(14) OCDE (2017). Guidance Document on an Integrated Approaches on Testing and Assessment for Serious Eye Damage and Eye irritation. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No263). Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.
B.69 MÉTHODE D’ESSAI SUR MODÈLE D’ÉPITHÉLIUM CORNÉEN HUMAIN RECONSTITUÉ (ECHR) POUR L’IDENTIFICATION DE PRODUITS CHIMIQUES NE NÉCESSITANT AUCUNE CLASSIFICATION NI ÉTIQUETAGE POUR IRRITATION OCULAIRE OU LÉSIONS OCULAIRES GRAVES
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 492 (2017) de l’OCDE. Une lésion oculaire grave est une lésion des tissus oculaires ou une dégradation sévère de la vue, provoquée par l’application d’un produit chimique d’essai sur la face antérieure de l’œil, et qui n’est pas totalement réversible dans les 21 jours suivant l’application, selon la définition du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies (ONU) (1) et du règlement (CE) no 1272/2008 de l’Union européenne relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges (ci-après le «règlement CLP»). Toujours selon le SGH de l’ONU et le règlement CLP, une irritation oculaire est définie comme la production de changements dans l’œil suite à l’application d’un produit chimique d’essai sur la surface antérieure de l’œil et qui sont totalement réversibles dans les 21 jours suivant l’application. Les produits chimiques d’essai provoquant des lésions oculaires graves sont classés dans la catégorie 1 du SGH de l’ONU et du règlement CLP, tandis que ceux provoquant une irritation oculaire sont classés dans la catégorie 2 du SGH/du CLP. Les produits chimiques d’essai non classés pour irritation oculaire ou lésion oculaire grave sont définis comme ne répondant pas aux critères de classification des catégories 1 ou 2 (2A ou 2B) du SGH de l’ONU et du CLP; autrement dit, ils sont considérés comme ne relevant d’aucune catégorie du SGH de l’ONU/du CLP («sans catégorie»).
2. Jusqu’à présent, l’évaluation des lésions oculaires graves/irritations oculaires impliquait généralement le recours à des animaux de laboratoire [méthode d’essai B.5;(2)]. Le choix de la méthode d’essai la plus pertinente et l’utilisation de cette méthode d’essai doivent être envisagés dans le contexte du Document d’orientation de l’OCDE sur les Approches Intégrées sur les Essais et l’Évaluation pour les lésions oculaires sévères et l’irritation de l’œil (39).
3. La présente méthode d’essai décrit une procédure in vitro permettant l’identification de produits chimiques (substances et mélanges) ne relevant d’aucune classification pour l’irritation oculaire ou les lésions oculaires graves, conformément au SGH de l’ONU et au règlement CLP. Un modèle d’épithélium cornéen humain reconstitué (EChR) est utilisé, qui reproduit fidèlement les propriétés histologiques, morphologiques, biochimiques et physiologiques de l’épithélium cornéen humain. Quatre autres méthodes d’essai in vitro ont été validées, considérées scientifiquement valides et adoptées en tant que méthodes d’essai B.47 (3), B.48 (4), B.61 (5) et B.68 (6), à utiliser pour évaluer le danger de lésions oculaires graves/d’irritation oculaire chez l’humain.
4. Deux essais validés sont inclus dans la présente méthode d’essai. Ils font appel à un un modèle tissulaire d’EChR disponible dans le commerce. Le test d’irritation oculaire (TIO) EpiOcular™ et le TIO SkinEthic™ avec épithélium cornéen humain (HCE) ont été validés dans des études d’évaluation de l’irritation oculaire/lésions oculaires graves (7)(8)(9)(10)(11)(12)(13). Ces deux essais utilisent comme système d’essai un modèle tissulaire d’EChR disponible dans le commerce et sont désignés ci-après en tant méthodes de référence validées (MRV1 et MRV2, respectivement). D’après les études de validation et l’examen indépendant par des pairs dont ils ont fait l’objet (9)(12), le TIO EpiOcular™ et le TIO HCE SkinEthic™ sont capables d’identifier correctement des produits chimiques (substances et mélanges) ne relevant d’aucune classification pour l’irritation oculaire ou les lésions oculaires graves selon le SGH de l’ONU, et les essais ont été jugés scientifiquement valides et recommandés pour cet objectif (13).
5. Il est généralement admis que dans notre horizon de prévision, aucun essai unique d’irritation oculaire in vitro ne pourra remplacer complètement le test oculaire in vivo de Draize (2)(14) pour établir le degré d’irritation oculaire provoqué par les différentes classes de produits chimiques. Cependant, la combinaison de plusieurs méthodes de substitution dans le cadre d’une stratégie d’essais (à plusieurs niveaux) telle que l’approche «bottom-up/top-down» pourrait remplacer le test de Draize (15). L’approche «bottom-up» (15) est conçue pour être appliquée quand, au vu des informations existantes, un produit chimique devrait a priori ne causer aucune irritation oculaire suffisante pour nécessiter une classification, tandis que l’approche «top-down» (15) est indiquée lorsque, d’après les informations existantes, on s’attend à ce qu’un produit chimique provoque des lésions oculaires graves. Le TIO EpiOcular™ et le TIO HCE SkinEthic™ sont recommandés pour identifier sans expérimentation supplémentaire les produits chimiques ne relevant d’aucune classification pour l’irritation oculaire ou les lésions oculaires graves selon le SGH de l’ONU/le règlement CLP («sans catégorie»), dans le cadre d’une approche «bottom-up/top-down» suggérée par Scott et al., par exemple comme première étape d’une approche «bottom-up» ou comme une des étapes finales dans une approche «top-down» (15). Cependant, le TIO EpiOcular™ et le TIO HCE SkinEthic™ ne sont pas conçus pour permettrede faire la distinction entre les produits chimiques de catégorie 1 du SGH de l’ONU/du règlement CLP (lésions oculaires graves) et ceux de catégorie 2 du SGH de l’ONU/du règlement CLP (irritation oculaire). Cette distinction doit être faite à une autre étape d’une stratégie par niveaux (15). Un produit chimique identifié comme nécessitant une classification pour l’irritation oculaire ou les lésions oculaires graves à l’aide du TIO EpiOcular™ ou du TIO HCE SkinEthic™ devrait être soumis à des essais complémentaires (in vitro et/ou in vivo) visant à tirer une conclusion définitive («sans catégorie», catégorie 1 ou catégorie 2 selon le SGH de l’ONU/le règlement CLP), en utilisant les méthodes d’essai B.47, B.48, B.61 ou B.68, par exemple.
6. L’objectif de la présente méthode d’essai est de décrire les procédures utilisées pour évaluer le danger potentiel qu’un produit chimique d’essai présente pour l’œil en se fondant sur sa capacité à provoquer une cytotoxicité sur un modèle tissulaire d’EChR, mesurée avec le test MTT (16) (voir paragraphe 21). La viabilité du tissu d’EChR après exposition à un produit chimique d’essai est déterminée par comparaison avec celle de tissus traités avec la substance servant de témoin négatif (% de viabilité) puis utilisée pour prédire le danger potentiel du produit chimique d’essai pour les yeux.
7. Des normes de performance (17) permettent de simplifier la validation d’essais in vitro nouveaux ou modifiés utilisant l’EChR et similaires au TIO EpiOcular™ et au TIO HCE SkinEthic™, conformément aux principes énoncés dans le Document d’orientation no34 (18), et de modifier rapidement la ligne directrice 492 pour y intégrer lesdits essais. L’acceptation mutuelle des données (AMD) conformément à l’accord de l’OCDE ne sera garantie pour les essais validés selon les normes de performance que si ces essais ont été examinés et incorporés dans la ligne directrice correspondante par l’OCDE.
DÉFINITIONS
8. Les définitions sont données à l’appendice 1.
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES
9. La présente méthode d’essai se base sur un modèle tissulaire tridimensionnel d’EChR disponible dans le commerce et produit à partir de kératinocytes primaires de l’épiderme humain (le modèle EpiOcular™ OCL-200), ou à partir de cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées (le TIO HCE/S SkinEthic™). Les modèles tissulaires d’EChR EpiOcular™ OCL-200 et HCE/S SkinEthic™ sont fidèles à la structure tridimensionnelle de l’épithélium cornéen in vivo et produits à partir de cellules de l’espèce cible (19)(20). En outre, ces essais mesurent directement la cytotoxicité due à la pénétration transcornéenne du produit chimique et la production de lésions cellulaires et tissulaires après exposition de l’œil à un produit chimique, ce qui permet d’évaluer la réponse globale d’irritation oculaire/de lésion oculaire grave in vivo. Les lésions cellulaires peuvent être causées par plusieurs mécanismes d’action (voir paragraphe 20), mais la cytotoxicité joue un rôle mécanique majeur, sinon le rôle principal, dans l’ampleur de la réponse globale de lésion oculaire grave/d’irritation oculaire après exposition à un produit chimique, réponse qui se manifeste in vivo principalement par l’opacité cornéenne, l’iritite, la rougeur et/ou le chémosis conjonctivaux, quels que soient les processus physico-chimiques sous-jacents des lésions tissulaires.
10. Un large éventail de produits chimiques, représentant de nombreux types et classes chimiques, poids moléculaires, LogP, structures chimiques, etc., a été testé dans l’étude de validation sur laquelle s’appuie la présente méthode d’essai. La base de données de validation du TIO EpiOcular™ comprenait un total de 113 produits chimiques, couvrant 95 groupes fonctionnels organiques différents d’après une analyse de l’OCDE effectuée à l’aide de la boîte à outils QSAR (8). La majorité de ces produits chimiques étaient des substances mono-constituant, mais plusieurs substances multi-constituants étaient aussi incluses dans l’étude (dont 3 homopolymères, 5 copolymères et 10 quasi-polymères). Concernant les états physiques et les catégories selon le SGH de l’ONU/le règlement CLP, les 113 produits chimiques d’essai étaient répartis comme suit: 13 liquides de catégorie 1, 15 solides de catégorie 1, 6 liquides de catégorie 2A, 10 solides de catégorie 2A, 7 liquides de catégorie 2B, 7 solides de catégorie 2B, 27 liquides sans catégorie et 28 solides sans catégorie (8). La base de données de validation du TIO HCE SkinEthic™ comprenait un total de 200 produits chimiques, couvrant 165 groupes fonctionnels organiques différents d’après une analyse de l’OCDE effectuée à l’aide de la boîte à outils QSAR (8)(10)(11). La majorité de ces produits chimiques étaient des substances mono-constituant, mais plusieurs substances multi-constituants étaient aussi incluses dans l’étude (dont 10 polymères). Concernant les états physiques et les catégories selon le SGH de l’ONU/le règlement CLP, les 200 produits chimiques d’essai étaient répartis comme suit: 27 liquides de catégorie 1, 24 solides de catégorie 1, 19 liquides de catégorie 2A, 10 solides de catégorie 2A, 9 liquides de catégorie 2B, 8 solides de catégorie 2B, 50 liquides sans catégorie et 53 solides sans catégorie (10)(11).
11. La présente méthode d’essai peut être utilisée pour tester des produits chimiques (substances et mélanges) solides, liquides, semi-solides et sous forme de cires. Les liquides peuvent être aqueux ou non; les solides peuvent être solubles ou insolubles dans l’eau. Si possible, les solides sont moulus finement avant application; aucun autre prétraitement de l’échantillon n’est nécessaire. Les gaz et aérosols n’ont pas fait l’objet d’une étude de validation. Bien qu’il soit envisageable de pouvoir tester des gaz et des aérosols en faisant appel à l’EChR, l’actuelle méthode d’essai ne permet pas de tester les produits de ce type.
12. Les produits chimiques d’essai qui absorbent la lumière à la même longueur d’onde que le formazan bleu (naturellement ou après traitement) et les produits chimiques d’essai pouvant directement réduire le colorant vital MTT (en formazan) peuvent interférer avec les mesures de la viabilité tissulaire et nécessitent l’utilisation de témoins adaptés pour corriger l’essai en fonction de ces interférences. Le type de témoins adaptés nécessaire dépendra du type d’interférence que présente le produit chimique d’essai et de la procédure employée pour mesurer quantitativement le formazan (voir paragraphes 36-42).
13. Les résultats issus des études de pré-validation (21)(22) et de validation complète (8)(10)(11) ont démontré que le TIO EpiOcular™ et le TIO HCE SkinEthic™ peuvent être menés par des laboratoires n’ayant jamais réalisé cet essai auparavant et qu’ils sont reproductibles au sein des laboratoires et entre laboratoires. D’après ces études, sur la base des données relatives à 113 produits chimiques, le taux de reproductibilité attendu pour le TIO EpiOcular™ en matière de concordance des prédictions est de l’ordre de 95 % au sein des laboratoires et de 93 % entre laboratoires. Sur la base de données relatives à 120 produits chimiques, le taux de reproductibilité attendu pour le TIO HCE SkinEthic™ en matière de concordance des prédictions est de l’ordre de 92 % au sein des laboratoires et de 95 % entre laboratoires.
14. Le TIO EpiOcular™ peut être employé pour identifier les produits chimiques ne relevant d’aucune classification pour l’irritation oculaire ou les lésions oculaires graves au titre du SGH de l’ONU et du règlement CLP. D’après les données obtenues dans l’étude de validation (8), le TIO EpiOcular™ présente une précision globale de 80 % (sur 112 produits chimiques), une sensibilité de 96 % (sur 57 produits chimiques), un taux de faux négatifs de 4 % (sur 57 produits chimiques), une spécificité de 63 % (sur 55 produits chimiques) et un taux de faux positifs de 37 % (sur 55 produits chimiques) par comparaison avec les données de référence obtenues avec le test in vivo sur œil de lapin (méthode d’essai B.5) (2)(14) et classées selon le SGH de l’ONU et le règlement CLP. Dans une étude testant 97 formulations liquides de produits agrochimiques, une performance similaire à celle démontrée dans l’étude de validation a été obtenue avec la méthode du TIO EpiOcular™ pour ce type de mélanges (23). Les 97 formulations étaient réparties comme suit: 21 en catégorie 1, 19 en catégorie 2A, 14 en catégorie 2B et 43 sans catégorie, selon le SGH de l’ONU (1) et sur la base des données de référence obtenues avec le test in vivo sur œil de lapin (méthode d’essai B.5) (2)(14). Une précision globale de 82 % (sur 97 formulations), une sensibilité de 91 % (sur 54 formulations), un taux de faux négatifs de 9 % (sur 54 formulations), une spécificité de 72 % (sur 43 formulations) et un taux de faux positifs de 28 % (sur 43 formulations) ont été obtenus (23).
15. Le TIO HCE SkinEthic™ peut être employé pour identifier les produits chimiques ne relevant d’aucune classification pour l’irritation oculaire ou les lésions oculaires graves au titre du SGH de l’ONU et du règlement CLP. D’après les données obtenues dans l’étude de validation (10)(11), le TIO HCE SkinEthic™ présente une précision globale de 84 % (sur 200 produits chimiques), une sensibilité de 95 % (sur 97 produits chimiques), un taux de faux négatifs de 5 % (sur 97 produits chimiques), une spécificité de 72 % (sur 103 produits chimiques) et un taux de faux positifs de 28 % (sur 103 produits chimiques) par comparaison avec les données de référence obtenues avec le test in vivo sur œil de lapin (méthode d’essai B.5) (2)(14) et classées selon le SGH de l’ONU et le règlement CLP.
16. Les taux de faux négatifs obtenus avec les deux essais sur EChR sont conformes à la probabilité globale qu’au moins 12 % des produits chimiques identifiés comme relevant de la catégorie 2 du SGH de l’ONU et du règlement CLP avec le test de Draize in vivo soient également classés «sans catégorie» selon le SGH de l’ONU et le règlement CLP lors de la répétition d’un essai, en raison de la variabilité inhérente de la méthode au cours de l’essai (24). Les taux de faux positifs obtenus avec les deux méthodes d’essai sur EChR pour les substances et les mélanges ne sont pas préoccupants dans le contexte de la présente méthode d’essai, étant donné que tous les produits chimiquesd’essai provoquant une viabilité tissulaire inférieure ou égale aux seuils définis (voir paragraphe 44) feront ensuite l’objet d’autres essais in vitro selon d’autres méthodes, ou en dernier recours d’essais chez le lapin, en fonction des exigences de la réglementation, selon une démarche expérimentale séquentielle fondée sur l’analyse du poids de la preuve. Ces méthodes d’essai peuvent être utilisées pour tous les types de produits chimiques, un résultat négatif pouvant être accepté pour ne pas classer un produit chimique pour l’irritation oculaire ou les lésions oculaires graves («sans catégorie» selon le SGH de l’ONU et le règlement CLP). Il y a lieu de consulter les autorités réglementaires compétentes avant de mettre en œuvre le TIO EpiOcular™ ou le TIO HCE SkinEthic™ dans un système de classification autre que le SGH de l’ONU/le règlement CLP.
17. Une limite de cette méthode d’essai est qu’elle ne permet pas de distinguer les produits chimiques produisant une irritation oculaire ou des effets réversibles sur l’œil (catégorie 2) de ceux entraînant des lésions oculaires graves ou des effets irréversibles sur l’œil (catégorie 1 du SGH de l’ONU et du CLP), ni les produits irritants pour l’œil (catégorie optionnelle 2A) de ceux modérément irritants pour l’œil (catégorie optionnelle 2B), tels que définis dans le SGH de l’ONU (1). Pour établir cette distinction, des essais supplémentaires avec d’autres méthodes d’essai in vitro sont nécessaires.
18. Dans la présente méthode d’essai, le terme «produit chimique d’essai» désigne ce qui est soumis à l’essai et ne fait pas référence à l’applicabilité de la méthode EChR pour les essais sur des substances et/ou mélanges.
PRINCIPE DE L’ESSAI
19. Le produit chimique d’essai est appliqué localement sur au moins deux modèles tridimensionnels d’EChR et la viabilité tissulaire est mesurée après l’exposition et une période d’incubation post-traitement. Les tissus d’épithélium cornéen humain sont reconstitués à partir de kératinocytes épidermiques humains primaires, ou à partir de cellules épithéliales cornéennes humaines immortalisées, cultivés pendant plusieurs jours jusqu’à la formation d’un épithélium stratifié, hautement différencié et morphologiquement semblable à l’épithélium cornéen humain. Le modèle tissulaire d’EChR EpiOcular™ est constitué d’au moins trois couches cellulaires viables et d’une surface non kératinisée présentant une structure similaire à celle de la cornée in vivo. Le modèle tissulaire d’EChR HCE SkinEthic™ est constitué d’au moins quatre couches cellulaires viables comprenant des cellules basales colonnaires, des cellules amplificatrices transitoires et des cellules superficielles squameuses et présentant une structure similaire à celle de l’épithélium cornéen humain normal (20)(26).
20. Les lésions oculaires graves ou l’irritation oculaire consécutives à l’application d’un produit chimique, qui se manifestent in vivo principalement par l’opacité cornéenne, l’iritite et la rougeur et/ou le chémosis conjonctivaux, résultent d’une cascade d’événements débutant par la pénétration du produit chimique à travers la cornée et/ou la conjonctive et la production de lésions cellulaires. Plusieurs mécanismes d’action peuvent provoquer des lésions cellulaires, parmi lesquels: la lyse de la membrane cellulaire (par des tensioactifs ou des solvants organiques, par exemple); la coagulation de macromolécules, notamment les protéines (par des tensioactifs, des solvants organiques, des alcalis et des acides, par exemple); la saponification des lipides (par des alcalis, par exemple); et l’alkylation ou d’autres interactions covalentes avec des macromolécules (par des agents de blanchiment, des peroxydes et des agents alkylants, par exemple) (15)(27)(28). Cependant, il a été démontré que la cytotoxicité joue un rôle mécanique important, sinon le rôle principal, dans l’ampleur de la réponse globale d’irritation oculaire/de lésion oculaire grave après exposition à un produit chimique, quels que soient les processus physico-chimiques sous-jacents des lésions tissulaires (29)(30). En outre, le pouvoir de lésion oculaire grave/d’irritation oculaire d’un produit chimique est déterminé principalement par l’ampleur de la lésion initiale (31), laquelle est corrélée avec l’étendue de la mort cellulaire (29) et à l’ampleur des effets et conséquences éventuelles qui en découlent (32). Par conséquent, les produits faiblement irritants n’ont en général d’effet que sur l’épithélium superficiel de la cornée, les produits modérément irritants affectent principalement l’épithélium et le stroma superficiel, et les produits gravement irritants provoquent des lésions de l’épithélium, du stroma profond et parfois de l’endothélium cornéen (30)(33). On mesure la viabilité du tissu d’EChR après exposition locale à un produit chimique d’essai afin de distinguer les produits chimiques ne nécessitant pas d’être classés pour les lésions oculaires graves/l’irritation oculaire («sans catégorie» selon le SGH de l’ONU et le règlement CLP) de ceux nécessitant d’être classés et étiquetés (catégories 1 et 2 selon le SGH de l’ONU et le règlement CLP) en partant du principe que tous les produits chimiques provoquant des lésions oculaires graves ou une irritation oculaire présentent un caractère cytotoxique pour l’épithélium cornéen et/ou la conjonctive.
21. La viabilité tissulaire de l’EChR est mesurée via la conversion enzymatique du colorant vital MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, bromure de tétrazolium; numéro CAS 298-93-1] par les cellules viables du tissu en un sel de formazan bleu mesuré quantitativement après son extraction des tissus (16). Les produits chimiques qui ne relèvent d’aucune classification dans le SGH de l’ONU et le règlement CLP («sans catégorie») sont ceux qui ne provoquent pas une diminution de la viabilité tissulaire en deçà d’un seuil défini (à savoir, viabilité tissulaire > 60 % avec le TIO EpiOcular™ et le TIOL HCE SkinEthic™, ou > 50 % avec le TIOS HCE SkinEthic™)(voir paragraphe 44).
DEMONSTRATION DES COMPÉTENCES
22. Avant d’appliquer en routine les essais sur EChR à des fins réglementaires, les laboratoires doivent démontrer leurs compétences techniques en classant correctement les quinze produits chimiques d’épreuve recommandés au tableau 1. Ces produits chimiques ont été sélectionnés parmi ceux utilisés lors de l’étude de validation des MRV (8)(10)(11). La sélection comprend, autant que possible, des produits chimiques qui: (i) couvrent plusieurs états physiques; (ii) couvrent la gamme complète des effets in vivo de lésion oculaire grave/d’irritation oculaire d’après les données de haute qualité obtenues avec le test de référence in vivo sur œil de lapin (méthode d’essai B.5) (2)(14) et selon le système de classification du SGH de l’ONU (catégories 1, 2A, 2B ou «sans catégorie») (1) et le système de classification du règlement CLP (catégories 1, 2 ou «sans catégorie»); (iii) couvrent les différents critères de classification in vivo (24)(25); (iv) sont représentatifs des classes chimiques utilisées dans l’étude de validation (8)(10)(11); (v) couvrent un large spectre de groupes fonctionnels organiques (8)(10)(11); (vi) ont une structure chimique bien définie (8)(10)(11); (vii) sont colorés et/ou sont des réducteurs directs du MTT; (viii) ont donné des résultats reproductibles lors de la validation des méthodes d’essai sur EChR; (ix) ont été classés correctement lors de la validation des méthodes d’essai sur EChR; (x) couvrent la gamme complète des réponses in vitro d’après des données de haute qualité issues des méthodes d’essai sur EChR (viabilité 0-100 %); (xi) sont disponibles dans le commerce; et (xii) ne sont pas excessivement coûteux à acquérir et/ou éliminer. Lorsque l’un des produits chimiques du tableau n’est pas disponible ou lorsque sa non-utilisation est justifiable, un autre produit chimique remplissant les conditions énoncées ci-avant peut être utilisé, par exemple un des produits chimiques utilisés pour la validation de la MRV. Ces changements doivent cependant être justifiés.
Tableau 1
Liste des produits chimiques d’épreuve de compétence
Abréviations:
No CAS = Numéro d’enregistrement dans le Chemical Abstracts Service; SGH de l’ONU = Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques des Nations Unies (1); MRV1 = Méthode de référence validée, à savoir le TIO EpiOcular™; MRV2 = Méthode de référence validée, à savoir le TIO HCE SkinEthic™; Interférence couleur = interférence de couleurs avec la mesure de l’absorbance (densité optique, DO) du formazan.
| Nom chimique | No CAS | Groupe fonctionnel organique | État physique | Viabilité MRV1 (%) | Viabilité MRV2 (%) | Prédiction MRV | Réducteur du MTT | Interférence couleur
In Vivo Categorie 1
| Méthylthioglycolate | 2365-48-2 | Ester d’acide carboxylique; thioalcoolol | L | 10,9±6,4 | 5,5±7,4 | Aucune prédiction possible | O (fort) | N
| Acrylate d’hydroxyétyle | 818-61-1 | Acrylate; alcool | L | 7,5±4,7 | 1,6±1,0 | Aucune prédiction possible | N | N
| 2,5-Diméthyl-2,5-hexanédiol | 110-03-2 | Acrylate; alcool | S | 2,3±0,2 | 0,2±0,1 | Aucune prédiction possible | N | N
| Oxalate de sodium | 62-76-0 | Acide oxocarboxylique | S | 29,0±1,2 | 5,3±4,1 | Aucune prédiction possible | N | N
In Vivo Catégorie 2A
| acide D-gluconique, composé avec N,N″-bis(4-chlorophényl)-3,12-diimino-2,4,11,13-tétraazatétradécanediamidine (2:1) (20 %, aqueux) | 18472-51-0 | Halogénure aromatique hétérocyclique; halogénure d’aryle; groupe dihydroxyle; guanidine | L | 4,0±1,1 | 1,3±0,6 | Aucune prédiction possible | N | O (faible)
| Benzoate de sodium | 532-32-1 | Aryle; acide carboxylique | S | 3,5±2,6 | 0,6±0,1 | Aucune prédiction possible | N | N
In Vivo Catégorie 2B
| Diéthyl-toluamide | 134-62-3 | Benzamide | L | 15,6±6,3 | 2,8±0,9 | Aucune prédiction possible | N | N
| 2,2-Diméthyl-3-méthylènebicyclo [2.2.1] heptane | 79-92-5 | Alcane, ramifié avec carbone tertiaire; alcène; bicycloheptane; composés carbocycliques pontés; cycloalcane | S | 4,7±1,5 | 15,8±1,1 | Aucune prédiction possible | N | N
In Vivo Sans Catégorie
| 1-Éthyl-3-méthylimidazolium éthylsulfate | 342573-75-5 | Alcoxyle; sel d’ammonium; aryle; imidazole; sulfate | L | 79,9±6,4 | 79,4±6,2 | Sans Cat | N | N
| Éther dicaprylyle | 629-82-3 | alcoxyle; éther | L | 97,8±4,3 | 95,2±3,0 | Sans Cat | N | N
| Butoxyde de pipéronyle | 51-03-6 | Alcoxyle; benzodioxole; benzyle; éther | L | 104,2±4,2 | 96,5±3,5 | Sans Cat | N | N
| Polyéthylène glycol (PEG-40) Huile de ricin hydrogénée | 61788-85-0 | Acylal; alcool; allyle; éther | Visqueux | 77,6±5,4 | 89,1±2,9 | Sans Cat | N | N
| 1-(4-Chlorophényl)-3-(3,4-dichlorophényl) urée Triclocarban | 101-20-2 | Halogénure aromatique hétérocyclique; halogénure d’aryle; dérivés de l’urée | S | 106,7±5,3 | 101,9±6,6 | Sans Cat | N | N
| 2,2′-méthylènebis(6-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phénol) | 103597-45-1 | Alcane ramifié avec carbone quaternaire; composé aromatique polycyclique; hétérocycles saturés polycycliques; précurseur de quinone; tert-butyle | S | 102,7±13,4 | 97,7±5,6 | Sans Cat | N | N
| Tétrafluoroborate de potassium | 14075-53-7 | Sels inorganiques | S | 88,6±3,3 | 92,9±5,1 | Sans Cat | N | N
23. Dans le cadre de la démonstration des compétences, il est recommandé aux utilisateurs de contrôler les propriétés de barrière des tissus dès réception, comme précisé par le producteur du modèle d’EChR (voir paragraphes 25, 27 et 30). Cette étape est particulièrement importante lorsque les tissus sont transportés sur de longues distances/durées. Lorsqu’unessai a été réalisé avec succès et que le laboratoire en maîtrise l’utilisation et a démontré cette maîtrise, il n’est plus nécessaire de procéder systématiquement à cette vérification. Toutefois, pour les essais utilisés en routine, il est recommandé de continuer à évaluer les propriétés de barrière à intervalles réguliers.
PROCÉDURE
24. Les essais actuellement couverts par la présente méthode d’essai sont les tests scientifiquement valides TIO EpiOcular™ et TIO HCE SkinEthic™ (9)(12)(13), désignés en tant que Méthodes de référence validées (MRV1 et MRV2, respectivement). Les modes opératoires de référence pour les méthodes EChR sont disponibles et doivent être suivis lors de la mise en œuvre et de l’emploi des méthodes d’essai en laboratoire (34)(35). Les paragraphes qui suivent et l’appendice 2 décrivent les principaux éléments et procédures des essais sur EChR.
ÉLÉMENTS DES MÉTHODES D’ESSAI EChR
Conditions générales
25. Des cellules dérivées de cellules humaines pertinentes sont utilisées pour reconstituer un modèle tridimensionnel de tissu épithélial cornéen, qui doit être composé de cellules progressivement stratifiées mais non cornifiées. Le modèle d’EChR est préparé dans des plaques de culture avec une membrane synthétique poreuse au travers de laquelle les nutriments peuvent atteindre les cellules. Le modèle d’épithélium cornéen reconstitué comporte plusieurs couches viables de cellules épithéliales non kératinisées. Le modèle d’EChR présente une surface épithéliale en contact direct avec l’air, de façon à permettre une application locale directe des produits chimiques d’essai similaire à une exposition in vivo de l’épithélium cornéen aux produits chimiques. Le modèle d’EChR forme une barrière fonctionnelle suffisamment robuste pour résister à la pénétration rapide des substances cytotoxiques étalons telles que le Triton X-100 ou le dodécylsulfate de sodium (SDS). La fonction de barrière devra être démontrée et peut être évaluée en déterminant soit la durée d’exposition nécessaire pour réduire la viabilité tissulaire de 50 % (TE50) après application de la substance étalon à une concentration fixe déterminée (100 μl de Triton X-100 à 0,3 % (v/v), par exemple), soit la concentration nécessaire pour réduire la viabilité tissulaire de 50 % (CI50) après application de la substance étalon pendant une durée d’exposition fixée (30 minutes de traitement avec 50 μl de SDS, par exemple) (voir paragraphe 30). Le modèle d’EChR présente des propriétés de confinement suffisantes pour éviter que le produit chimique d’essai puisse contourner le tissu viable, ce qui nuirait à la qualité de la modélisation de l’exposition de la cornée. Les cellules d’origine humaine utilisées dans le modèle d’EChR sont exemptes de toute contamination bactérienne, virale, mycoplasmique ou mycosique. Le fournisseur vérifie la stérilité du modèle tissulaire et l’absence de contamination mycosique ou bactérienne.
Conditions fonctionnelles
Viabilité
26. La viabilité est mesurée au moyen du test MTT (16). Dans les cellules viables du modèle d’EChR, le colorant vital MTT est réduit en un précipité bleu de formazan, qui est ensuite extrait du tissu avec de l’isopropanol (ou unsolvant semblable). Le formazan extrait peut être quantifié soit en mesurant l’absorbance (densité optique, DO), soit suivant une procédure d’analyse par CLHP/CLUP-spectrophotométrie (36). La DO du solvant d’extraction seul doit être suffisamment faible, c’est-à-dire < 0,1. Les utilisateurs du modèle d’EChR s’assurent que chaque lot de tissu EChR remplit les critères définis pour le témoin négatif. Les plages d’acceptabilité pour la DO du témoin négatif pour les MRV sont précisées au tableau 2. Les utilisateurs de la procédure CLHP/CLUP-spectrophotométrie utilisent la plage de DO du témoin négatif fournie au tableau 2 comme critère d’acceptabilité pour le témoin négatif. Il doit être prouvé que les tissus traités avec le témoin négatif sont stables en culture (c’est-à-dire qu’ils présentent des mesures de viabilité comparables) tout au long de la période d’exposition. Le producteur du tissu suit une procédure semblable dans le cadre du contrôle qualité des lots de tissu, mais dans ce cas les critères d’acceptabilité applicables sont différents de ceux spécifiés au tableau 2. Une plage d’acceptabilité (valeurs limites inférieure et supérieure) pour les valeurs de DO du témoin négatif (dans les conditions de la méthode d’essai du contrôle qualité) est établie par le développeur/fournisseur du modèle d’EChR.
Tableau 2
Plages d’acceptabilité pour la DO du témoin négatif (pour les utilisateurs de l’essai)
| Essai | Valeur limite inférieure d’acceptation | Valeur limite supérieure d’acceptation
| TIO EpiOcular™ (OCL-200) – MRV1 (protocoles pour les liquides et les solides) | > 0,8 | < 2,5
| TIO HCE SkinEthic™ (HCE/S) – MRV2 (protocoles pour les liquides et les solides) | > 1,0 | ≤ 2,5
Fonction de barrière
27. Le modèle d’EChR doit être suffisamment épais et résistant pour résister à la pénétration rapide de substances cytotoxiques étalons. Cette capacité est évaluée par la valeur TE50 (Triton X-100) ou par la CI50 (SDS), par exemple (tableau 3). La fonction de barrière de chaque lot de modèle d’EChR est démontrée par le développeur/fournisseur lors de la fourniture des tissus à l’utilisateur final (voir paragraphe 30).
Morphologie
28. L’examen histologique du modèle d’EChR doit mettre en évidence une structure semblable à celle de l’épithélium cornéen humain (comprenant au moins 3 couches de cellules épithéliales viables et une surface non kératinisée). Pour les MRV, une morphologie adéquate a été démontrée par le développeur/fournisseur et il n’est donc pas nécessaire de la démontrer à nouveau chaque fois qu’un utilisateur fait usage d’un lot.
Reproductibilité
29. La reproductibilité dans le temps des résultats obtenus à l’aide des témoins positifs et négatifs doit être démontrée.
Contrôle de qualité
30. Il est impératif que le développeur/fournisseur du modèle d’EChR garantisse et démontre que chaque lot utilisé répond à des critères de fabrication définis, dont les plus pertinents sont ceux relatifs à la viabilité (paragraphe 26) et à la fonction de barrière (paragraphe 27). Une plage d’acceptabilité (valeurs limites inférieure et supérieure) pour la fonction de barrière telle que mesurée avec le TE50 ou la CI50 (voir paragraphes 25 et 26) est établie par le développeur/fournisseur du modèle d’EChR. La plage d’acceptabilité pour les valeurs TE50 et CI50 retenues par le développeur/fournisseur des lots de tissu d’EChR (utilisés dans les MRV) lors du contrôle de qualité, est donnée au tableau 3. Le développeur/fournisseur des tissus d’EChR doit fournir les données démontrant le respect de tous les critères de fabrication aux utilisateurs de la méthode d’essai, afin qu’ils puissent présenter ces informations dans le rapport d’essai. Seuls les résultats obtenus avec des tissus remplissant tous les critères de fabrication définis peuvent être considérés comme des prédictions fiables pour les produits chimiques ne relevant d’aucune classification pour l’irritation oculaire ou les lésions oculaires graves selon le SGH de l’ONU/le règlement CLP.
Tableau 3
Critères de contrôle de qualité des lots
| Essai | Valeur limite inférieure d’acceptation | Valeur limite supérieure d’acceptation
| TIO EpiOcular™ (OCL-200) - MRV1 (100 μl de Triton X-100 à 0,3 % (v/v)) | ET50 = 12,2 min | ET50 = 37,5 min
| TIO HCE SkinEthic™ (HCE/S) – MRV2 (traitement de 30 min avec 50 μl de SDS) | IC50 = 1 mg/ml | IC50 = 3,2 mg/ml
Application des produits chimiques d’essai et témoins
31. Il convient d’utiliser au minimum deux réplicats de tissus par produit chimique d’essai et par substance témoin dans chaque épreuve. Deux protocoles de traitement différents sont employés pour les produits chimiques d’essai liquides et pour les produits chimiques d’essai solides (34)(35). Dans les deux méthodes et les deux protocoles, avant d’être exposée à un produit chimique d’essai, la surface des modèles tissulaires est pré-traitée avec du tampon phosphate salin de Dulbecco sans calcium et sans magnésium (DPBS sans Ca2+/Mg2+), pour reproduire le plus fidèlement possible les conditions d’humidité de l’œil humain. Les tissus sont traités avec le(s) produit(s) chimique(s) testé(s) ou avec les substances témoin. Dans les deux protocoles des deux MRV, il convient d’appliquer une quantité suffisante de produit chimique d’essai ou de substance témoin pour recouvrir uniformément la surface épithéliale sans pour autant utiliser une dose infinie (voir paragraphes 32 et 33) (appendice 2).
32. Les produits chimiques d’essai pouvant être appliqués à la pipette à 37 °C ou à des températures plus basses (au besoin, avec une pipette à piston) sont considérés comme des liquides dans les MRV. Dans le cas contraire, ils sont considérés comme des solides (voir paragraphe 33). Dans les MRV, le produit chimique d’essai liquide est appliqué uniformément sur la surface de tissu (soit une application d’au moins 60 μl/cm2) (voir appendice 2 (33)(34)). Il convient d’éviter autant que possible les effets de capillarité (effets de tension de surface) pouvant être observés en raison des faibles volumes appliqués sur les inserts (surface de tissu), ce afin de garantir un bon dosage sur le tissu. Les tissus traités avec les produits chimiques d’essai liquides sont incubés pendant 30 minutes dans les conditions de culture normalisées (37±2 °C, sous CO2 5±1 %, HR ≥ 95 %). À la fin de la période d’exposition, les produits chimiques d’essai et les substances témoin sont soigneusement éliminés de la surface de tissu par un rinçage abondant au DPBS sans Ca2+/Mg2+ à température ambiante. Cette étape de rinçage est suivie par une immersion post-traitement dans un milieu de culture frais à température ambiante (afin d’éliminer tout produit chimique d’essai absorbé par le tissu) pendant une durée prédéfinie qui varie en fonction de la MRV utilisée. Pour la MRV1 seulement, une incubation post-traitement est réalisée dans un milieu de culture frais dans les conditions de culture normalisées, avant d’effectuer le test MTT (voir appendice 2 (34)(35)).
33. Les produits chimiques d’essai ne pouvant pas être appliqués à la pipette à 37 °C ou à des températures plus basses sont considérés comme des solides dans les MRV. La quantité appliquée doit être suffisante pour recouvrir complètement la surface de tissu, à savoir une application d’au moins 60 mg/cm2 (appendice 2). Chaque fois que possible, il convient de tester les solides sous la forme d’une poudre fine. Les tissus traités avec les produits chimiques d’essai solides sont incubés pendant une durée prédéfinie (en fonction de la VRM utilisée) dans les conditions de culture normalisées (voir appendice 2 (34)(35)). À la fin de la période d’exposition, les produits chimiques d’essai et les substances témoin sont soigneusement éliminés de la surface de tissu par un rinçage abondant au DPBS sans Ca2+/Mg2+ à température ambiante. Cette étape de rinçage est suivie par une immersion post-traitement pendant une durée prédéfinie (qui varie en fonction de la VRM utilisée) dans un milieu de culture frais à température ambiante (afin d’éliminer tout produit chimique d’essai absorbé par le tissu) puis par une incubation post-traitement dans un milieu frais dans les conditions de culture normalisées, avant d’effectuer le test MTT (voir appendice 2, (34)(35)).
34. Des témoins négatifs et positifs sont utilisés simultanément dans chaque épreuve, afin de démontrer que la viabilité (dans le cas du témoin négatif) et la sensibilité (dans le cas du témoin positif) des tissus se situent dans une fourchette historique définie de valeurs acceptables. Le témoin négatif permet aussi de fixer la valeur de départ (viabilité à 100 %) à partir de laquelle est calculée la viabilité relative (en pourcentage) des tissus traités avec les produits chimiques d’essai (%viabilitétest). La substance recommandée pour le témoin positif dans les MRV est l’acétate de méthyle pur (N°CAS 79-20-9; Sigma-Aldrich, Cat# 45997; liquide). Les substances recommandées pour le témoin négatif dans la MRV1 et la MRV2 sont l’eau (H2O) extra-pure et le DPBS sans Ca2+/Mg2+, respectivement. Ces substances sont celles employées comme témoins dans les études de pré-validation et de validation des MRV, et celles pour lesquelles il existe le plus de données historiques. L’utilisation d’autres substances adéquates pour les témoins positifs et négatifs doit être dûment justifiée scientifiquement. Les témoins négatif et positif sont testés suivant les mêmes protocoles que ceux utilisés pour les produits chimiques d’essai dans l’épreuve (liquides et solides). Cette application est suivie d’une exposition au traitement, d’un rinçage, d’une immersion post-traitement et d’une incubation post-traitement le cas échéant, tel que décrit pour les témoins utilisés simultanément avec les produits chimiques liquides (voir paragraphe 32) ou pour les témoins utilisés simultanément avec les produits chimiques solides (voir paragraphe 33), avant d’effectuer le test MTT (voir paragraphe 35) (34)(35). Un seul témoin positif et un seul témoin négatif par épreuve suffisent pour tous les produits chimiques d’essai présentant le même état physique (liquide ou solide).
Mesure de la viabilité tissulaire
35. Le test MTT est une méthode quantitative normalisée (16) qu’il convient d’utiliser pour quantifier la viabilité des tissus dans la présente méthode d’essai. Elle est compatible avec une utilisation sur un modèle tissulaire tridimensionnel. Le test MTT est réalisé immédiatement après la période d’incubation post-traitement. Selon les MRV, l’échantillon de modèle d’EChR est immergé dans 0,3 ml de solution MTT à 1 mg/ml pendant 180±15 minutes dans les conditions de culture normalisées. Dans les cellules viables du modèle d’EChR, le colorant vital MTT est réduit en un précipité bleu de formazan. Le précipité bleu de formazan est ensuite extrait à l’aide d’un volume adéquat d’isopropanol (ou d’un solvant similaire)(34)(35). Pour les tissus exposés à des produits chimiques d’essai liquides, l’extraction est faite à partir des couches supérieure et inférieure des tissus, tandis que, pour les tissus exposés à des produits chimiques d’essai solides ou à des liquides colorés, l’extraction est faite à partir de la seule couche inférieure du tissu (afin de réduire au minimum tout risque de contamination de la solution d’isopropanol d’extraction avec un résidu de produit chimique d’essai présent dans les tissus). Pour les tissus exposés à des produits chimiques d’essai difficiles à rincer, l’extraction peut aussi être faite à partir de la seule couche inférieure du tissu. Les substances témoin positives et négatives testées en parallèle sont traitées de la même manière que les produits chimiques d’essai. Le formazan extrait est quantifié soit par mesure de l’absorbance (DO) à 570 nm et avec un filtre passe-bande d’une largeur maximale de ±30 nm, soit par CLHP/CLUP-spectrophotométrie (voir paragraphe 42) (11)(36).
36. Les propriétés optiques du produit chimique d’essai ou son action chimique sur le MTT sont susceptibles d’interférer avec le test MTT et de conduire à des estimations erronées de la viabilité des tissus. Les produits chimiques d’essai sont susceptibles d’interférer avec le test MTT par réduction directe du MTT en formazan bleu et/ou par interférence de couleurs si le produit chimique d’essai absorbe, naturellement ou sous l’effet des procédures du traitement, dans la même plage de DO que le formazan (c’est-à-dire autour de 570 nm). Des vérifications préliminaires sont effectuées avant le test, pour permettre de repérer les éventuels produits chimiques réducteurs directs du MTT et/ou provoquant une interférence de couleurs, et des témoins supplémentaires sont préparés pour détecter les interférences pouvant être causées par ces produits chimiques et corriger l’essai en conséquence (voir paragraphes 37-41). Cela est particulièrement important lorsque le produit chimique d’essai n’a pas été totalement éliminé du modèle d’EChR lors du rinçage, ou lorsqu’il pénètre dans le modèle d’épithélium cornéen et est donc présent dans le tissu d’EChR au moment où le test MTT est mené. Pour les produits chimiques d’essai qui absorbent la lumière dans la même plage que le formazan (naturellement ou après traitement), et qui sont incompatibles avec la mesure de l’absorbance (DO) du formazan à cause d’une interférence excessive (absorption élevée à 570±30 nm), une procédure d’analyse par CLHP/CLUP-spectrophotométrie peut être effectuée pour mesurer la présence de formazan (voir paragraphes 41 et 42) (11)(36). On trouvera dans les modes opératoires normalisés des MRV (34)(35) une description détaillée de la manière de détecter la réduction directe du MTT ou les interférences dues aux agents colorants et corriger l’essai en conséquence. Un organigramme présentant les étapes pour identifier et prendre en compte les produits chimiques réducteurs directs du MTT et/ou qui provoquent une interférence de couleurs dans les MRV1 et MRV2 est par ailleurs fourni dans les appendices 3 et 4, respectivement.
37. Pour repérer les interférences potentielles par des produits chimiques d’essai absorbant la lumière dans la même plage que le formazan (naturellement ou après traitement), et pour déterminer si des témoins supplémentaires sont nécessaires, le produit chimique d’essai est mélangé à de l’eau et/ou de l’isopropanol et incubé pendant une durée appropriée à température ambiante (voir appendice 2, (34)(35)). Si le produit chimique d’essai dans l’eau et/ou dans l’isopropanol absorbe assez la lumière à une longueur d’onde de 570±20 nm pour la MRV1 (voir appendice 3), ou si l’on obtient une solution colorée en mélangeant le produit chimique d’essai avec de l’eau pour la MRV2 (voir appendice 4), alors on considère que le produit chimique d’essai interfère avec la mesure de l’absorbance (DO) du formazan et des témoins colorés doivent être préparés, ou bien une procédure d’analyse par CLHP/CLUP-spectrophotométrie est employée et aucun témoin supplémentaire n’est nécessaire (voir paragraphes 41 et 42 et appendices 3 et 4)(34)(35). Lorsque les mesures d’absorbance (DO) sont effectuées, chaque produit chimique d’essai causant une interférence est appliqué sur au moins deux réplicats de tissus viables, et les deux réplicats sont soumis à la procédure d’essai complète, à la seule différence qu’ils sont incubés dans le milieu plutôt que dans la solution MTT lors de l’étape de l’incubation avec MTT, afin de générer un témoin de couleur non spécifique dans les tissus vivants (CNSvivants) (34)(35). Le témoin CNSvivants est testé en parallèle de l’essai avec le produit chimique d’essai coloré et, dans le cas d’un essai multiple, un témoin CNSvivants indépendant est effectué pour chaque essai (dans chaque épreuve) pour tenir compte de la variabilité biologique inhérente aux tissus vivants. La viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: le pourcentage de viabilité tissulaire obtenu pour les tissus vivants exposés au produit chimique causant une interférence et incubés avec la solution MTT (%viabilitétest) moins le pourcentage de couleur non spécifique obtenu pour les tissus vivants exposés au produit chimique causant une interférence et incubés dans du milieu sans MTT en parallèle de l’essai à corriger (%CNSvivants), soit Viabilité tissulaire réelle = [%viabilitétest] – [%CNSvivants].
38. Afin d’identifier les agents réducteurs directs du MTT, il convient d’ajouter chaque produit chimique d’essai à un milieu MTT fraîchement préparé. Une quantité adéquate de produit chimique d’essai est ajoutée à une solution MTT et le mélange est incubé pendant environ 3 heures dans les conditions de culture normalisées (voir appendices 3et 4)(34)(35). Si le mélange de MTT et de produit chimique d’essai (ou la suspension testée pour les produits chimiques d’essai insolubles) devient bleu/violet, on considère que le produit chimique d’essai est un réducteur direct du MTT et il convient alors de procéder à des vérifications fonctionnelles supplémentaires sur les modèles de tissus d’EChR non viables, indépendamment du choix de mesurer l’absorbance (OD) ou de procéder par analyse par CLHP/CLUP-spectrophotométrie. Cette vérification s’effectue sur des tissus tués qui ne présentent qu’une activité métabolique résiduelle, mais absorbent et retiennent le produit chimique d’essai dans des proportions similaires aux tissus viables. Dans la MRV1, les tissus tués sont préparés par exposition à des températures basses («tués par congélation»). Dans la MRV2, les tissus tués sont préparés par une incubation longue (au moins 24±1h, par exemple) dans l’eau suivie d’un stockage à basse température («tués dans l’eau»). Chaque produit chimique réducteur du MTT est appliqué sur au moins deux réplicats de tissus tués qui sont soumis à la procédure d’essai complète pour générer un témoin de réduction non spécifique du MTT (NSMTT) (34)(35). Un seul témoin NSMTT par produit chimique d’essai suffit, indépendamment du nombre d’épreuves indépendantes menées. La viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: le pourcentage de viabilité tissulaire obtenu pour les tissus vivants exposés au réducteur du MTT (%viabilitétest) moins le pourcentage de réduction non spécifique du MTT obtenu pour les tissus tués exposés au même réducteur du MTT et calculé en proportion du témoin négatif testé en parallèle de l’essai à corriger (%NSMTT), soit Viabilité tissulaire réelle = [%viabilitétest] - [%NSMTT].
39. Dans le cas des produits chimiques identifiés comme causant à la fois une interférence de couleurs (voir paragraphe 37) et une réduction directe du MTT (voir paragraphe 38), une troisième série de témoins est nécessaire lors de la mesure de l’absorbance (DO), en plus des témoins NSMTT et CNSvivants décrits aux paragraphes précédents. En général, ce cas se présente pour les produits chimiques d’essai foncés qui absorbent la lumière à une longueur d’onde de 570±30 nm (bleus, violets, noirs, par exemple), car leur couleur intrinsèque empêche l’évaluation de leur potentiel de réduction directe du MTT décrite au paragraphe 38. Cela rend la réalisation des témoins NSMTT et CNSvivants obligatoires par principe. Les produits chimiques d’essai nécessitant la réalisation des deux témoins NSMTT et CNSvivants sont susceptibles d’être absorbés et retenus à la fois par les tissus vivants et par les tissus tués. Par conséquent et dans ce cas, l’utilisation du témoin NSMTT peut permettre de corriger l’essai non seulement en fonction du potentiel de réduction directe du MTT du produit chimique d’essai, mais aussi de l’interférence de couleurs due à l’absorption et la rétention du produit chimique d’essai par les tissus tués. Cela signifie qu’une double correction pour tenir compte de l’interférence de couleurs peut devoir être effectuée, étant donné quele témoin CNSvivants permet déjà de tenir compte de l’interférence de couleurs due à l’absorption et à la rétention du produit chimique d’essai par les tissus vivants. Afin d’éviter cette double correction pour tenir compte de l’interférence de couleurs, un troisième témoin pour la couleur non spécifique dans les tissus tués (CNStués) doit être préparé (voir appendice 3 et 4)(34)(35). Dans ce témoin supplémentaire, le produit chimique d’essai est appliqué sur au moins deux réplicats de tissus tués qui sont soumis à la procédure d’essai complète mais qui sont incubés dans le milieu plutôt que dans la solution MTT lors de l’étape d’incubation avec MTT. Un seul témoin CNStués par produit chimique d’essai suffit, indépendamment du nombre d’épreuves, mais il doit être mené en parallèle du témoin NSMTT et sur le même lot de tissus. La viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: le pourcentage de viabilité tissulaire obtenu pour les tissus vivants exposés au produit chimique d’essai (%viabilitétest) moins %NSMTT moins %CNSvivants plus le pourcentage de couleur non spécifique obtenu pour les tissus tués exposés au produit chimique d’essai causant une interférence et incubés dans du milieu sans MTT, calculé en proportion du témoin négatif mené en parallèle de l’essai à corriger (%CNStués), soit Viabilité tissulaire réelle = [%viabilitétest] - [%NSMTT] - [%CNSvivants] + [%CNStués].
40. Il importe de noter qu’une réduction non spécifique du MTT et des interférences de couleurs non spécifiques peuvent porter l’absorbance (DO) de l’extrait tissulaire au-dessus de la plage de linéarité du spectrophotomètre (lors des mesures de densité optique), et qu’une réduction non spécifique du MTT peut aussi élargir la surface de pic de formazan de l’extrait tissulaire au-delà de la plage de linéarité du spectrophotomètre (lors des mesures par CLHP/CLUP-spectrophotométrie). Il est donc important que chaque laboratoire détermine la plage de linéarité de son spectrophotomètre (pour la DO/surface de pic), par exemple à l’aide de formazan (CAS # 57360-69-7), disponible dans le commerce auprès de l’entreprise Sigma-Aldrich (Cat# M2003), avant de tester les produits chimiques à des fins réglementaires.
41. La mesure standard de l’absorbance (DO) avec un spectrophotomètre est indiquée pour l’évaluation des produits chimiques d’essai réducteurs directs du MTT et causant une interférence de couleurs, lorsque l’interférence observée n’est pas trop forte par rapport à la mesure (c’est-à-dire lorsque les DO des extraits tissulaires obtenues pour le produit chimique d’essai sans correction pour tenir compte de la réduction directe du MTT et/ou de l’interférence de couleurs sont comprises dans la plage de linéarité du spectrophotomètre). Cependant, les résultats correspondant aux produits chimiques d’essai pour lesquels les valeurs %NSMTT et/ou %CNSvivants sont ≥ 60 % (MRV1, et MRV2 pour le protocole des liquides) ou 50 % (MRV2 pour le protocole des solides) du témoin négatif doivent être utilisés avec précaution, car il s’agit des seuils retenus dans les MRV pour faire la distinction entre les produits chimiques relevant d’une catégorie et ceux «sans catégorie» (voir paragraphe 44). A contrario, l’absorbance (DO) ne peut pas être mesurée lorsque l’interférence avec la mesure du formazan est trop forte (c’est-à-dire lorsque les DO non corrigées des extraits tissulaires testés sont situées en dehors de la plage de linéarité du spectrophotomètre). Les produits chimiques d’essai colorés ou ceux devenant colorés au contact de l’eau ou de l’isopropanol qui interfèrent trop fortement avec l’absorbance (DO) mesurée pour le formazan peuvent être évalués par une procédure de CLHP/CLUP-spectrophotométrie (voir appendices 3 et 4), car le système CLHP/CLUP permet de séparer le formazan du produit chimique avant la quantification (36). Pour cette raison, les témoins CNSvivants et CNStués ne sont pas nécessaires pour la procédure CLHP/CLUP-spectrophotométrie, quel que soit le produit chimique soumis à l’essai. Les témoins NSMTT sont néanmoins nécessaires si l’on s’attend à ce que le produit chimique d’essai soit un réducteur direct du MTT (en suivant la procédure décrite au paragraphe 38). Les témoins NSMTT sont aussi nécessaires pour les produits chimiques d’essai colorés (naturellement ou au contact de l’eau) dont la couleur empêche l’évaluation de leur potentiel de réduction directe du MTT, comme décrit au paragraphe 38. Lorsqu’une procédure par CLHP/CLUP-spectrophotométrie est employée pour quantifier le formazan, la viabilité tissulaire est calculée en pourcentage par comparaison de la surface de pic de formazan obtenue avec des tissus vivants exposés au produit chimique d’essai avec la surface de pic de formazan obtenue avec le témoin négatif parallèle. Pour les produits chimiques d’essai réducteurs directs du MTT, la viabilité tissulaire réelle est calculée comme suit: %viabilitétest moins %NSMTT, comme décrit à la dernière phrase du paragraphe 38. Pour finir, il convient de noter que les réducteurs directs du MTT ou les réducteurs directs du MTT causant aussi une interférence de couleurs, qui sont retenus dans les tissus après le traitement et dont la capacité de réduction du MTT est telle qu’elle conduit à des DO (pour la mesure de DO) ou à des surfaces de pic (pour la procédure CLHP/CLUP-spectrophotométrie) des extraits tissulaires testés situées en dehors de la plage de linéarité du spectrophotomètre, ne peuvent pas être évalués avec les méthodes d’essai sur EChR; ce cas ne se présente a priori que très rarement.
42. La procédure par CLHP/CLUP-spectrophotométrie est utilisable pour mesurer le formazan pour tous les types de produits chimiques (colorés ou non, réducteurs ou non réducteurs du MTT) (11)(36). Étant donné la diversité des équipements de CLHP/CLUP-spectrophotométrie, tous les utilisateurs ne pourront pas reproduire des conditions d’équipement identiques. Pour cette raison, preuve doit être faite de l’efficacité de l’équipement de CLHP/CLUP-spectrophotométrie avant que celui-ci ne soit utilisé pour quantifier le formazan des extraits tissulaires, en remplissant les critères d’acceptabilité pour un ensemble de paramètres normalisés de qualification inspirés des paramètres décrits dans les recommandations à l’industrie de la Food and Drug Administration des États-Unis sur la validation des méthodes de bio-analyse (36)(38). Ces paramètres fondamentaux et leurs critères d’acceptation sont fournis à l’appendice 5. Une fois que les critères d’acceptabilité définis à l’appendice 5 ont été remplis, l’équipement de CLHP/CLUP-spectrophotométrie est considéré comme ayant fait la preuve de son efficacité et prêt pour les mesures du formazan dans les conditions expérimentales décrites dans la présente méthode d’essai.
Critères d’acceptation
43. Pour chaque épreuve recourant à des lots de tissus d’EChR remplissant les critères du contrôle de qualité (voir paragraphe 30), les tissus traités avec le témoin négatif présentent une DO reflétant la qualité des tissus qui ont été transportés, réceptionnés et soumis à toutes les étapes du protocole et se situant dans les limites historiques décrites au tableau 2 (voir paragraphe 26). De même, les tissus traités avec le témoin positif, c’est-à-dire l’acétate de méthyle, présentent une viabilité cellulaire < 50 % par comparaison avec le témoin négatif pour la MRV1 soit avec le protocole des liquides, soit avec le protocole des solides, et une viabilité cellulaire ≤ 30 % (protocole pour des liquides) ou ≤ 20 % (protocole des solides) pour la MRV2. Ces valeurs reflètent la capacité des tissus à réagir à un produit chimique irritant dans les conditions de la méthode d’essai (34)(35). La variabilité entre les réplicats de tissus pour les produits chimiques d’essai et pour les substances témoin doit se situer dans la fourchette acceptable (différence de viabilité entre deux réplicats de tissus inférieure à 20 %, ou écart-type entre trois réplicats de tissus ne dépassant pas 18 %). Si l’un des témoins (négatif ou positif) réalisés dans une épreuve se situe en dehors de la fourchette acceptable, l’épreuve est considérée comme «non valable» et doit être refaite. Si la variabilité entre les réplicats de tissus pour un produit chimique d’essai se situe en dehors de la fourchette acceptable, l’essai est considéré comme «non valable» est le produit chimique doit être à nouveau soumis à l’essai.
Interprétation des résultats et modèle prédictif
44. Les valeurs de DO/surfaces de pic obtenues avec les réplicats d’extraits de tissus pour chaque produit chimique d’essai sont utilisées pour calculer le pourcentage moyen de viabilité tissulaire (moyenne entre les réplicats de tissus) par rapport à la viabilité du témoin négatif (fixée à 100 %). La valeur seuil du pourcentage de viabilité tissulaire, qui permet de distinguer les produits chimiques relevant d’une catégorie pour irritation oculaire ou lésions oculaires graves de ceux «sans catégorie» selon le SGH de l’ONU et le règlement CLP, est donnée au tableau 4. Les résultats sont donc interprétés comme suit:
— Le produit chimique d’essai est considéré comme ne relevant d’aucune catégorie selon le SGH de l’ONU et le règlement CLP («sans catégorie») si le pourcentage moyen de viabilité cellulaire après l’exposition et l’incubation post-traitement est supérieur (>) au seuil défini du pourcentage de viabilité tissulaire, conformément au tableau 4. Dans ce cas, aucun essai supplémentaire avec d’autres méthodes d’essai n’est nécessaire.
— Aucune prédiction n’est possible si le pourcentage moyen de viabilité cellulaire après l’exposition et l’incubation post-traitement est inférieur ou égal (≤) au seuil défini du pourcentage de viabilité tissulaire, conformément au tableau 4. Dans ce cas, il est nécessaire de mener des essais supplémentaires avec d’autres méthodes d’essai, car les méthodes d’essai sur EChR produisent un nombre non négligeable de faux positifs (voir paragraphes 14 et 15) et ne permettent pas de distinguer entre les catégories 1 et 2 du SGH de l’ONU et le règlement CLP (voir paragraphe 17).
Tableau 4
Modèles de prédiction d’après la classification du SGH de l’ONU et du règlement CLP
| MRV | Sans Categorie | Aucune prédiction possible
| MRV1 - TIO EpiOcular™ (pour les deux protocoles) | Viabilité tissulaire moyenne > 60 % | Viabilité tissulaire moyenne ≤ 60 %
| MRV2 - TIO HCE SkinEthic™ (pour le protocole des liquides)) | Viabilité tissulaire moyenne > 60 % | Viabilité tissulaire moyenne ≤ 60 %
| MRV2 - TIO HCE SkinEthic™ (pour le protocole des solides) | Viabilité tissulaire moyenne > 60 % | Viabilité tissulaire moyenne ≤ 60 %
45. Un seul essai réalisé à l’aide d’au moins deux réplicats de tissus devrait suffire pour tester un produit chimique dont les résultats sont sans équivoque. En revanche, dans le cas de résultats ambigus, tels que des mesures non concordantes pour les différents réplicats et/ou un pourcentage moyen de viabilité égal à 60±5 % (MRV1, et MRV2 pour le protocole des liquides) ou 50±5 % (MRV2 pour le protocole des solides), une seconde répétition est envisagée, voire une troisième en cas de résultats discordants entre les deux premières.
46. Il est envisageable d’utiliser des valeurs seuil de pourcentage de viabilité tissulaire différentes pour distinguer les produits chimiques relevant ou ne relevant pas d’une catégorie dans certains cas particuliers de mélanges, si nécessaire et justifiable, pour améliorer la performance générale de la méthode d’essai concernant ces types de mélanges (voir paragraphe 14). Les produits chimiques étalons peuvent s’avérer utiles pour évaluer le potentiel de lésions oculaires graves/d’irritation oculaire de produits chimiques ou de mélanges inconnus relevant de classes spécifiques de substances chimiques ou de produits, ou encore pour évaluer le potentiel relatif de toxicité oculaire d’un produit chimique classé dans une gamme spécifique de réactions d’irritation.
RÉSULTATS ET RAPPORT
Données
47. Les données de chaque réplicat de tissus dans une épreuve (valeurs DO/surfaces de pic de formazan, données calculées du pourcentage de viabilité tissulaire pour le produit chimique d’essai et pour le témoin, prédiction conclusive de la méthode d’essai sur EChR, par exemple) sont présentées dans un tableau pour chacun des produits chimiques d’essai, y compris les données des répétitions, le cas échéant. De plus, le pourcentage moyen de viabilité tissulaire et la différence (si n=2 réplicats de tissus) ou l’écart-type (si n ≥ 3 réplicats de tissus) pour chacun des produits chimiques d’essai et pour les témoins sont présentés. Toute interférence avec le test MTT observée pour un produit chimique d’essai à cause de la réduction directe du MTT et/ou d’une interférence de couleurs est indiquée pour chacun des produits chimiques soumis à essai.
Rapport d’essai
48. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Produit chimique d’essai
Substance mono-constituant
— identification chimique, telle que désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro(s) CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale et/ou autres identifiants;
— état physique, volatilité, pH, LogP, poids moléculaire, classe chimique et autres propriétés physico-chimiques pertinentes pour la conduite de l’essai, selon les données disponibles;
— pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.;
— traitement avant essai, s’il y a lieu (chauffage, broyage, par exemple);
— conditions de stockage et stabilité, selon les données disponibles.
Substance multi-constituants, UVCB ou mélange
— caractérisation, dans la mesure du possible, par exemple par l’identité chimique (voir ci-dessus), la pureté, les caractéristiques quantitatives et les propriétés physico-chimiques pertinentes (voir ci-dessus) des constituants, selon les données disponibles;
— état physique et autres propriétés physico-chimiques pertinentes pour la conduite de l’essai, selon les données disponibles;
— pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.;
— traitement avant essai, s’il y a lieu (chauffage, broyage, par exemple);
— conditions de stockage et stabilité, selon les données disponibles.
Témoins positifs et négatifs
— identification chimique telle que désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro(s) CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale et/ou autres identifiants;
— état physique, volatilité, pH, LogP, poids moléculaire, classe chimique et autres propriétés physico-chimiques pertinentes pour la conduite de l’essai, selon les données disponibles;
— pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.;
— traitement avant essai, s’il y a lieu (chauffage, broyage, par exemple);
— conditions de stockage et stabilité, selon les données disponibles;
— justification de l’utilisation d’un témoin négatif autre que l’eau (H2O) extra-pure ou que le DPBS sans Ca2+/Mg2+, le cas échéant;
— justification de l’utilisation d’un témoin positif autre que l’acétate de méthyle pur, le cas échéant;
— référence aux données historiques des témoins positifs et négatifs démontrant la conformité aux critères d’acceptabilité.
Renseignements relatifs au donneur d’ordre et à l’installation d’essai
— Nom et adresse du donneur d’ordre, de l’installation d’essai et du directeur de l’étude.
— Modèle d’EChR et protocole employés (explication des raisons du choix, le cas échéant)
Conditions de la méthode d’essai
— modèle tissulaire d’EChR employé, y compris le numéro de lot;
— longueur d’onde et largeur de bande (le cas échéant) employées pour quantifier le bleu de formazan, et plage de linéarité de l’appareil de mesure (par exemple spectrophotomètre);
— desscription de la méthode de quantification du bleu de formazan employée;
— description du système CLHP/CLUP-spectrophotomètre utilisé, le cas échéant;
— informations complètes sur le modèle spécifique d’EChR utilisé, notamment sur ses performances, à savoir (liste non limitative):
i) viabilité lors du contrôle qualité (fournisseur);
ii) viabilité dans les conditions de la méthode d’essai (utilisateur);
iii) fonction de barrière lors du contrôle qualité;
iv) morphologie, selon les informations disponibles;
v) reproductibilité et valeur prédictive;
vi) autre contrôle de qualité (CQ) des modèles tissulaires d’EChR, selon les informations disponibles;
— références aux données historiques du modèle tissulaire d’EChR, à savoir (liste non limitative): acceptabilité des données de CQ par rapport aux données historiques des lots;
— déclaration de démonstration de la compétence du laboratoire dans l’application de la méthode d’essai (en testant les substances d’épreuve) avant son application en routine.
Critères d’acceptabilité pour les épreuves et pour l’essai
— moyennes et fourchettes de valeur acceptables pour les témoins positifs et négatifs, sur la base des données historiques;
— variabilité acceptable entre les réplicats de tissus pour les témoins positifs et négatifs;
— variabilité acceptable entre les réplicats de tissus pour les produits chimiques d’essai;
Mode opératoire
— détails du protocole utilisé;
— doses employées pour le produit chimique d’essai et les substances témoin;
— durée et température des périodes d’exposition, d’immersion post-traitement et d’incubation post-traitement (le cas échéant);
— description de toute modification éventuelle du protocole;
— indication des témoins utilisés pour les agents réducteurs directs du MTT et/ou pour les produits chimiques d’essai colorés, le cas échéant;
— nombre de réplicats de tissus utilisés par produit chimique d’essai et substance témoin (témoin positif, témoin négatif, NSMTT, CNSvivants et CNStués, le cas échéant);
Résultats
— tableau de données pour chaque produit chimique d’essai et substance témoin pour chaque épreuve (et ses répétitions, le cas échéant) et pour les mesures de chaque réplicat, y compris la valeur de DO ou la surface de pic du formazan, le pourcentage de viabilité tissulaire, le pourcentage moyen de viabilité tissulaire, la différence ou l’écart-type entre les réplicats de tissus, et la prédiction finale;
— le cas échéant, résultats des témoins réalisés pour les réducteurs directs du MTT et/ou les produits chimiques colorés, y compris la valeur de DO ou la surface de pic du formazan, %NSMTT, %CNSvivants, %CNStués, différence ou écart-type entre les réplicats de tissus, pourcentage final corrigé de viabilité tissulaire, et prédiction finale;
— résultats obtenus pour le(s) produit(s) chimique(s) testé(s) et les substances témoin comparés aux critères d’acceptation pour les épreuves et pour l’essai;
— description des autres effets observés, par exemple, coloration des tissus par un produit chimique d’essai coloré;
Discussion des résultats
Conclusion
BIBLIOGRAPHIE
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(2) Chapitre B.5 de la présente annexe, Effet irritant/corrosif aigu sur les yeux.
(3) Chapitre B.47 de la présente annexe, Méthode d’essai d’opacité et de perméabilité de la cornée bovine pour l’identification des produits chimiques i) provoquant des lésions oculaires graves ou ii) ne relevant d’aucune classification pour irritation oculaire ou lésion oculaire.
(4) Chapitre B.48 de la présente annexe, méthode d’essai sur œil de poulet isolé pour l’identification des produits chimiques i) provoquant des lésions oculaires graves et ii) ne relevant d’aucune classification pour irritation oculaire ou lésion oculaire.
(5) Chapitre B.61 de la présente annexe, Méthode d’essai de diffusion de fluorescéine pour identifier les substances corrosives et fortement irritantes pour l’œil.
(6) Chapitre B.68 de la présente annexe, Méthode d’essai d’exposition de courte durée in vitro pour l’identification des produits chimiques i) provoquant des lésions oculaires graves ou ii) ne relevant d’aucune classification pour irritation oculaire ou lésion oculaire.
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B.70 ESSAIS IN VITRO FAISANT APPEL AU RÉCEPTEUR D’ŒSTROGÈNE RECOMBINANT HUMAIN (HRER) POUR LA DÉTECTION DES PRODUITS CHIMIQUES AYANT UNE AFFINITÉ DE LIAISON AVEC LES RÉCEPTEURS DES ŒSTROGÈNES
INTRODUCTION GÉNÉRALE
Ligne directrice d’essai de l’OCDE axée sur la performance
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 493 (2015) de l’OCDE. La ligne directrice 493 pour les essais de produits chimiques est axée sur la performance (LDAP) et décrit la méthodologie des essais in vitro faisant appel au récepteur d’œstrogène recombinant humain pour la détection des substances ayant une affinité de liaison avec les récepteurs des œstrogènes (essais de liaison au hrER). Elle comprend deux essais structurellement et fonctionnellement similaires pour détecter les ligands des récepteurs des œstrogènes (ERα), et doit faciliter l’élaboration de nouveaux essais similaires ou modifiés, conformément aux principes de validation exposés dans le document d’orientation de l’OCDE intitulé Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment (1). Les méthodes d’essai de référence totalement validées (appendices 2 et 3) qui sont à la base de la présente méthode d’essai axée sur la performance sont les suivantes:
— Essai de Freyberger-Wilson (FW): essai in vitro de liaison aux récepteurs des œstrogènes (ER) à l’aide d’un ERα humain intégral (2), et
— Essai du Chemical Evaluation and Research Institute (CERI): essai in vitro de liaison aux récepteurs des œstrogènes à l’aide du domaine de liaison du ligand d’un ER recombinant humain (2).
Des normes de performance (3) sont disponibles afin de faciliter l’élaboration et la validation d’essais similaires visant le même paramètre de sécurité, et elles permettent de modifier la ligne directrice 493 en temps utile par l’ajout de nouveaux essais similaires. L’ajout de tels nouveaux essais similaires n’est toutefois possible qu’après examen et vérification, par l’OCDE, du respect des normes de performance. Chacun des essais inclus dans la ligne directrice 493 peut être utilisé pour répondre aux exigences des pays membres de l’OCDE en matière d’essai de liaison aux ER, dans le cadre du système d’acceptation mutuelle de données de l’OCDE.
Contexte et principes des essais inclus dans la présente méthode d’essai
2. L’OCDE a lancé en 1998 une activité à caractère hautement prioritaire visant à réviser les lignes directrices existantes ou à établir de nouvelles lignes directrices pour la détection et les essais de substances susceptibles d’avoir des effets perturbateurs sur le système endocrinien. Le Cadre conceptuel de l’OCDE pour les essais et l’évaluation des perturbateurs endocriniens (CC) a été révisé en 2012. Les versions originale et révisée de ce CC figurent en tant qu’annexes dans le document d’orientation sur les lignes directrices normalisées pour évaluer l’effet perturbateur des produits chimiques sur le système endocrinien (4). Le CC comprend cinq niveaux, chacun d’entre eux correspondant à un degré différent de complexité biologique. Les essais de liaison aux ER décrits dans cette méthode d’essai correspondent au niveau 2, qui couvre «les essais in vitro fournissant des données sur certains mécanisme(s) et voie(s) d’activité endocrinienne». La présente méthode d’essai vise les essais in vitro de liaison aux récepteurs conçus pour détecter les ligands du récepteur des œstrogènes alpha (ERα) chez l’humain.
3. La pertinence de l’essai de liaison aux ER in vitro à l’égard des fonctions biologiques a été clairement démontrée. Les essais de liaison aux ER sont conçus pour détecter les produits chimiques susceptibles de perturber les voies d’activité liées à l’hormone œstrogène. Cela fait vingt ans qu’ils sont largement utilisés pour caractériser la distribution tissulaire des ER et pour déterminer les agonistes et les antagonistes de ces récepteurs. Ces essais reposent sur l’interaction ligand-récepteur, qui constitue la première étape de la voie de signalisation des œstrogènes, essentielle aux fonctions reproductives chez l’ensemble des vertébrés.
4. L’interaction des œstrogènes et des ER peut affecter la transcription des gènes régulés par les œstrogènes et avoir des conséquences au-delà du génome en entraînant l’induction ou l’inhibition de processus cellulaires, notamment les mécanismes nécessaires à la prolifération cellulaire, au développement normal du fœtus et aux fonctions reproductives (5) (6) (7). La perturbation des systèmes œstrogéniques normaux pourrait déclencher des troubles du développement (ontogenèse) et nuire à la santé génésique et à l’intégrité du système reproductif. Une mauvaise signalisation des ER peut notamment se traduire par un risque accru de cancer hormonodépendant, des troubles de la fertilité ainsi que des altérations de la croissance et du développement du fœtus (8).
5. Les essais de liaison in vitro reposent sur l’interaction directe entre une substance et le domaine de liaison du ligand spécifique d’un récepteur qui régule la transcription d’un gène. L’essai de liaison au récepteur des œstrogènes alpha recombinant humain (hrERα) consiste principalement à mesurer la capacité d’un ligand radiomarqué (le [3H]-17β-œstradiol) à se lier aux ER en présence de concentrations croissantes du produit chimique d’essai (appelé «compétiteur»). Les produits chimiques d’essai qui présentent une forte affinité de liaison avec les ER entrent en concurrence avec le ligand radiomarqué à une concentration plus faible que les composés ayant une affinité moindre vis-à-vis du récepteur. L’essai comporte deux grands éléments: une expérience de liaison à saturation pour établir les paramètres de l’interaction récepteur-ligand et documenter la spécificité des liaisons aux ER, puis une expérience de liaison compétitive visant à déterminer dans quelle mesure un produit chimique d’essai fait concurrence à un ligand radiomarqué pour se fixer aux ER.
6. Les études de validation des méthodes de liaison du CERI et de FW ont démontré la pertinence et la fiabilité de ces essais aux fins prévues (2).
7. Les définitions et abréviations utilisées dans cette méthode d’essai sont présentées à l’appendice 1.
Portée et limites des essais de liaison aux récepteurs
8. Ces essais sont proposés à des fins de détection et de priorisation, mais ils peuvent aussi livrer des informations sur l’événement d’initiation moléculaire (EIM) utiles dans le cadre d’une approche fondée sur le poids de la preuve. Ils s’appuient sur l’établissement d’une liaison chimique avec le domaine de liaison du ligand des ERα dans un système in vitro. Aussi les résultats obtenus ne doivent-ils pas être directement extrapolés aux mécanismes complexes de signalisation et de régulation qui caractérisent un système endocrinien intact in vivo.
9. La liaison du ligand naturel 17β-œstradiol aux ER est la première étape d’une série d’événements moléculaires qui activent la transcription des gènes cibles, et se traduisent in fine par un changement physiologique (9). Cet amarrage au domaine de liaison du ligand des ERα est donc considéré comme l’un des mécanismes clés de la perturbation endocrinienne (PE) médiée par les ER, bien que la PE puisse procéder par d’autres mécanismes, notamment: (i) des interactions avec des parties des ERα autres que le site de lianison du ligand, (ii) des interactions avec d’autres récepteurs jouant sur la signalisation des œstrogènes, les ERβ et les ER couplés aux protéines G ainsi que d’autres récepteurs et systèmes enzymatiques du système endocrinien, (iii) la synthèse hormonale, (iv) l’activation et/ou l’inactivation métaboliques des hormones, (v) la distribution des hormones dans les tissus cibles, et (vi) l’élimination des hormones de l’organisme. Aucun des essais visés par la présente méthode d’essai ne porte sur ces modes d’action.
10. La présente méthode d’essai repose sur la capacité de substances à se lier aux ERα humains, et n’opère pas de distinction entre les agonistes et les antagonistes des ERα. Ces essais n’abordent pas non plus les événements déclenchés par cette liaison, comme la transcription des gènes ou les changements physiologiques. Étant donné que l’étude de validation n’a porté que sur des substances mono-constituant, il n’existe aucune information quant à l’applicabilité de l’essai aux mélanges. Cela étant, ces essais demeurent théoriquement applicables à l’évaluation de mélanges ou de substances multi-constituants. Avant de mettre en œuvre la présente méthode d’essai sur un mélange afin de dégager des données à des fins réglementaires, il convient d’examiner si, et le cas échéant pourquoi, ladite méthode peut fournir des résultats adéquats aux fins visées. Ces questions ne se posent pas quand la réglementation exige de réaliser l’essai sur le mélange.
11. Les systèmes de récepteurs hors cellule n’ont intrinsèquement aucune compétence métabolique et n’ont pas été validés en combinaison avec des systèmes enzymatiques métaboliques. Il serait toutefois possible d’intégrer l’activité métabolique dans la conception de l’étude, sous réserve de nouveaux travaux de validation.
12. Concernant les produits chimiques susceptibles de dénaturer les protéines (telles que celles qui constituent le récepteur), comme les tensioactifs, ou les produits chimiques modifiant le pH de la solution d’essai tamponnée, l’essai peut ne pas convenir, ou bien à des concentrations d’essai auxquelles ces interactions n’apparaissent pas. Dans les autres cas, la fourchette de concentrations d’essai d’un produit chimique est plafonnée par sa solubilité dans la solution d’essai tamponnée.
13. À titre d’information, le tableau 1 fournit les résultats des essais des 24 substances testées avec les deux essais totalement validés décrits dans la présente méthode d’essai. Parmi ces substances, 17 sont classées comme ligands des ER et 6 comme non-ligands d’après les rapports publiés, notamment sur les essais in vitro d’activation transcriptionnelle et/ou les essais utérotrophiques (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). S’agissant des données résumées dans le tableau 1, les deux essais ont presque abouti aux mêmes conclusions pour l’ensemble des substances jusqu’à 10-4 M, et chaque composé a été classé correctement comme ligand ou non-ligand des ER. D’autres renseignements sur ce groupe de produits chimiques ainsi que sur les substances supplémentaires testées dans les essais de liaison aux ER dans le cadre des études de validation sont fournis dans les normes de performance pour les essais de liaison au hrER (3) à l’appendice 2 (tableaux 1, 2 et 3).
Tableau 1
Classification des substances comme ligand ou non-ligand des ER à l’issue d’essais de liaison au hrER d’après les méthodes de FW et du CERI, et comparaison avec la réponse attendue
| | Nom de la substance | No CAS | Réponse attendue | Essai FW | Essai CERI | Classe chimique dans le système MESH Classe | Classe du produit
| | Fourchette de concentrations (M) | Classification | Fourchette de concentrations (M) | Classification
| 1 | 17β-œstradiol (E2) | 50-28-2 | Ligand | 1 × 10-11 – 1 × 10-6 | Ligand | 1 × 10-11 – 1 × 10-6 | Ligand | Stéroïde | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 2 | Noréthynodrel | 68-23-5 | Ligand | 3 × 10-9 – 30 × 10-4 | Ligand | 3 × 10-9 – 30 × 10-4 | Ligand | Stéroïde | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 3 | Noréthindrone | 68-22-4 | Ligand | 3 × 10-9 – 30 × 10-4 | Ligand | 3 × 10-9 – 30 × 10-4 | Ligand | Stéroïde | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 4 | Phtalate de dibutyle | 84-74-2 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-4 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-4 | Non-ligand | Hydrocarbure (cyclique), ester | Plastifiant, intermédiaire chimique
| 5 | DES | 56-53-1 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Hydrocarbure (cyclique), phénol | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 6 | 17α-éthynylœstradiol | 57-63-6 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Stéroïde | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 7 | méso-hexestrol | 84-16-2 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Hydrocarbure (cyclique), phénol | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 8 | Génistéine | 446-72-0 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Hydrocarbure (hétérocyclique), flavonoïde | Produit naturel
| 9 | Équol | 531-95-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Métabolite des phytœstrogènes | Produit naturel
| 10 | Butylparabène (n-butyl-4-hydroxybenzoate) | 94-26-8 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Paraben | Conservateur
| 11 | Nonylphénol (mélange) | 84852-15-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Alkylphénol | Composé intermédiaire
| 12 | o,p’-DDT | 789-02-6 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Organochlorine | Insecticide
| 13 | Corticostérone | 50-22-6 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-4 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-4 | Non-ligand | Stéroïde | Produit naturel
| 14 | Zéaralénone | 17924-92-4 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Hydrocarbure (hétérocyclique), lactone | Produit naturel
| 15 | Tamoxifène | 10540-29-1 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Hydrocarbure (cyclique) | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 16 | 5α-dihydrotestostérone | 521-18-6 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Stéroïde, non phénolique | Produit naturel
| 17 | Bisphénol A | 80-05-7 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Phénol | Intermédiaire chimique
| 18 | 4-n-heptylphénol | 1987-50-4 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Équivoque | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Alkylphénol | Intermédiaire
| 19 | Képone (chlordécone) | 143-50-0 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Hydrocarbure (halogéné) | Pesticide
| 20 | Benz(a)anthracène | 56-55-3 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Non-ligand | Hydrocarbure aromatique | Intermédiaire
| 21 | Entérolactone | 78473-71-9 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Ligand | Phytœstrogène | Produit naturel
| 22 | Progestérone | 57-83-0 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-4 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-4 | Non-ligand | Stéroïde | Produit naturel
| 23 | Octyltriéthoxysilane | 2943-75-1 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-3 | Non-ligand | Silane | Modificateur de surface
| 24 | Atrazine | 1912-24-9 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-4 | Non-ligand | 1 × 10-10 – 1 × 10-4 | Non-ligand | Composé hétérocyclique | Herbicide
ÉLÉMENTS DE LESSAI DE LIAISON AU hrER
Éléments essentiels de l’essai
14. La présente méthode d’essai concerne les essais faisant appel à un récepteur des œstrogènes et à un ligand de ce récepteur qui présente une affinité de liaison suffisamment forte. Ce ligand doit servir de marqueur ou traceur de l’essai et être remplacé par le produit chimique d’essai quand la concentration de celui-ci augmente. Les essais de liaison se composent des deux grands éléments suivants: 1) liaison à saturation et 2) liaison compétitive. L’essai de liaison à saturation sert à confirmer la spécificité et l’activité des préparations de récepteurs, tandis que l’essai de liaison compétitive permet d’évaluer la capacité du produit chimique d’essai à se lier au hrER.
Témoins
15. Il convient de détailler pourquoi les témoins et la substance œstrogénique de référence concomitants ont été choisis. L’essai de liaison compétitive requiert, le cas échéant, un témoin avec solvant (véhicule), un témoin positif (ligand des ER; affinité forte et faible) et un témoin négatif (non-ligand). Ces témoins attestent du bon fonctionnement de l’essai dans les conditions de l’essai et fournissent des éléments de comparaison d’une expérience à l’autre; ils font généralement partie des critères d’acceptabilité d’une expérience donnée (1). Pour chaque essai, une même plaque sert à établir les courbes pour toutes les concentrations de la substance œstrogénique de référence et des témoins (ligand faible et non-ligand). Toutes les autres plaques doivent contenir: 1) une concentration élevée (remplaçant presque entièrement le ligand radiomarqué) et une concentration moyenne (correspondant environ à la CI50) d’E2 et du ligand faible, en triple exemplaire; 2) des témoins avec solvant et des ligands non spécifiques, chacun en triple exemplaire.
Procédures standard de contrôle de qualité
16. Il convient de suivre les procédures standard de contrôle de qualité décrites pour chaque essai afin de garantir que les récepteurs sont actifs, que les concentrations chimiques sont correctes, que l’intervalle de tolérance reste stable au fil des multiples réplications de l’essai, et que l’essai permet toujours d’établir les liaisons aux ER attendues au fil du temps.
Démonstration des compétences du laboratoire
17. Avant de soumettre des produits chimiques inconnus à l’un des essais relevant de la présente méthode d’essai, chaque laboratoire devra démontrer qu’il peut le mettre en œuvre en effectuant des essais à saturation pour confirmer la spécificité et l’activité de la préparation de récepteurs ainsi que des essais de liaison compétitive avec la substance œstrogénique de référence et les témoins (ligand faible et non-ligand). Chaque laboratoire doit ainsi créer une base de données compilant les résultats obtenus pour la substance œstrogénique de référence et les témoins à l’issue de 3 à 5 expériences indépendantes qui ne sont pas réalisées le même jour. Ces expériences constituent un fondement historique pour le laboratoire concernant les témoins et la substance œstrogénique de référence, et permettent d’évaluer partiellement l’acceptabilité des futurs essais.
18. La réactivité du système d’essai sera également confirmée en testant les substances d’épreuve de compétence énumérées dans le tableau 2. La liste des substances d’épreuve de compétence constitue une sous-catégorie des substances de référence indiquées dans les normes de performance des essais de liaison aux ER (3). Ces substances sont disponibles dans le commerce, représentent les classes de produits chimiques auxquelles on prête généralement une affinité de liaison aux ER, et manifestent une gamme d’activité correspondant aux affinités attendues des ligands des ER (de faible à forte) et des non-ligands des ER (négatifs). Pour chaque substance d’épreuve de compétence, les concentrations analysées doivent couvrir la fourchette indiquée dans le tableau 2. Il faut réaliser au moins trois expériences pour chaque substance, dont les résultats doivent correspondre à l’activité chimique attendue. Chaque expérience est réalisée indépendamment en utilisant de nouvelles dilutions du récepteur, des produits chimiques et du réactif, avec trois réplicats par concentration. La compétence est démontrée lorsque chaque substance d’épreuve de compétence est correctement classée (réponse positive/négative). L’épreuve de compétence est effectuée par chaque technicien dans le cadre de la formation aux essais.
Tableau 2
Liste des témoins et des substances d’épreuve de compétence pour les essais de liaison compétitive au hrER
| No | Nom de la substance | No CAS | Réponse attendue | Fourchette de concentrations de l’essai(M) | Classe chimique dans le système MeSH | Type de produit
| Controls (Reference estrogen, weak binder, non-binder)
| 1 | 17β-estradiol | 50-28-2 | Ligand | 1×10-11 – 1×10-6 | Stéroïde | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 2 | Noréthynodrel (or) Noréthindrone | 68-23-5 (or) 68-22-4 | Ligand | 3×10-9 – 30×10-6 | Stéroïde | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 3 | Octyltriéthoxysilane | 2943-75-1 | Non-ligand | 1×10-10 – 1×10-3 | Silane | Modificateur de surface
| Substances d’épreuve de compétence
| 4 | Diéthylstilbestrol | 56-53-1 | Ligand | 1×10-11 – 1×10-6 | Hydrocarbure (cyclique), phénol | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 5 | 17α-éthynylestradiol | 57-63-6 | Ligand | 1×10-11 – 1×10-6 | Stéroïde | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 6 | méso-Hexestrol | 84-16-2 | Ligand | 1×10-11 – 1×10-6 | Hydrocarbure (cyclique), phénol | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 7 | Tamoxifène | 10540-29-1 | Ligand | 1×10-11 – 1×10-6 | Hydrocarbure (cyclique) | Produit pharmaceutique et vétérinaire
| 8 | Génistéine | 446-72-0 | Ligand | 1×10-10 – 1×10-3 | Composé hétérocyclique, flavonoïde | Produit naturel
| 9 | Bisphénol A | 80-05-7 | Ligand | 1×10-10 – 1×10-3 | Phénol | Intermédiaire chimique
| 10 | Zéaralonone | 17924-92-4 | Ligand | 1×10-11 – 1×10-3 | Composé hétérocyclique, lactone | Produit naturel
| 11 | Butylparabène | 94-26-8 | Ligand | 1×10-11 – 1×10-3 | Acide carboxylique, phénol | Conservateur
| at | Atrazine | 1912-24-9 | Non-ligand | 1×10-11 – 1×10-6 | Composé hétérocyclique | Herbicide
| 13 | Phatalate de dibutyle (DBP) | 84-74-2 | Non-ligand | 1×10-10 – 1×10-4 | Hydrocarbure (cyclique), ester | Plastifiant, intermédiaire chimique
| 14 | Corticostérone | 50-22-6 | Non-ligand | 1×10-11 – 1×10-4 | Stéroïde | Produit naturel
Détermination de la solubilité et de l’ordre de grandeur des concentrations des produits chimiques d’essai
19. Un essai préliminaire est nécessaire pour déterminer la limite de solubilité de chaque produit chimique d’essai ainsi que la fourchette de concentrations qui convient pour l’essai. La limite de solubilité de chaque produit chimique d’essai doit d’abord être déterminée dans le solvant, puis confirmée dans les conditions de l’essai. La concentration finale utilisée dans l’essai ne doit pas dépasser 1 mM. L’essai de détermination de l’ordre de grandeur s’effectue à l’aide d’un témoin avec solvant et d’une série logarithmique de huit dilutions de la concentration maximale acceptable (p.ex. 1 mM ou moins, selon la limite de solubilité). On relèvera l’apparition d’un trouble ou d’un précipité, le cas échéant. Il faut ajuster les concentrations des deuxième et troisième expériences de façon à mieux caractériser la courbe concentration-réponse.
Critères d’acceptabilité de l’essai
20. L’acceptation ou le rejet d’un essai dépend de l’évaluation des résultats obtenus avec la substance œstrogénique de référence et les témoins utilisés pour chaque expérience. Il faut d’abord que pour la première plaque, les courbes concentration-réponse complètes obtenues pour les substances de référence de chaque expérience correspondent aux mesures de la performance fondées sur les paramètres d’ajustement des courbes (p.ex. CI50 et pente de Hill) découlant des résultats des méthodes d’essai du CERI et du FW, respectivement (appendices 2 et 3), et des données historiques concernant les témoins dont dispose le laboratoire qui réalise l’essai. Tous les témoins (substance œstrogénique de référence, ligand faible et non-ligand) doivent être classés correctement à l’issue de chaque expérience. Ensuite, les témoins de toutes les plaques suivantes doivent livrer des résultats concordants avec ceux de la première plaque. Il convient d’analyser une fourchette de concentrations du produit chimique d’essai suffisante pour définir clairement le sommet de la courbe de liaison compétitive. La variabilité entre les réplicats de chaque concentration du produit chimique d’essai et entre les trois essais indépendants doit rester raisonnable et défendable sur le plan scientifique. Un laboratoire prouve sa compétence à répéter l’ essai de manière homogène en établissant et en entretenant une base de données compilant les résultats historiques pour la substance œstrogénique de référence et les témoins. Les écarts-types (ET) ou coefficients de variation (CV) des moyennes des paramètres d’ajustement des courbes de la substance œstrogénique de référence et du ligand faible témoin obtenues après plusieurs expériences peuvent servir à mesurer la reproductibilité intra-laboratoire. Un avis professionnel s’impose pour analyser les résultats des témoins de la plaque pour chaque essai et pour chaque produit chimique d’essai.
De plus, on respectera les principes suivants eu égard aux critères d’acceptabilité:
— Les données doivent être suffisantes pour évaluer quantitativement la liaison aux ER
— Les concentrations testées doivent rester inférieures à la limite de solubilité du produit chimique d’essai.
Analyse des données
21. La procédure d’analyse définie pour les résultats des essais de liaison à saturation et de liaison compétitive doit être conforme aux principes fondamentaux de caractérisation des interactions ligand-récepteur. Les données de liaison à saturation sont généralement analysées en appliquant un modèle de régression non linéaire fondé sur les liaisons totale et non spécifique. Il peut s’avérer nécessaire d’effectuer une correction du fait de la perte de ligand (p.ex. Swillens, 1995(19)) pour déterminer la capacité maximale de liaison Bmax et la constante de liaison Kd. Dans les essais de liaison compétitive, les données sont typiquement transformées (p.ex. pourcentage de liaison spécifique, logarithme de la concentration de produit chimique d’essai). Les log(CI50) de chaque produit chimique d’essai sont estimés grâce à un logiciel d’ajustement des courbes par régression non linéaire approprié se fondant sur une équation de Hill à quatre paramètres. Après une première analyse, les paramètres d’ajustement des courbes sont déterminés, puis on vérifie visuellement si les données de liaison correspondent à la courbe de liaison compétitive obtenue. Une analyse supplémentaire est parfois nécessaire en vue d’obtenir un ajustement des courbes optimal, par exemple en resserrant le sommet et la base de la courbe ou en appliquant la règle des 10 % (voir appendice 4 et référence 2, Section III.A.2).
22. Le respect des critères d’acceptabilité (paragraphe 20) indique que le système d’essai fonctionne correctement, mais ne garantit pas que chaque essai lancé fournira des données exactes. La réplication des résultats corrects du premier essai constitue la meilleure indication que les valeurs obtenues sont exactes.
Critères généraux d’interprétation des données
23. Il n’existe actuellement aucune méthode d’interprétation des données d’essai de liaison aux ER universellement reconnue. Cependant, les évaluations qualitatives (p.ex. ligand ou non-ligand) et/ou quantitatives (p.ex. CI50, affinité de liaison relative [ALR]) de l’activité médiée par les hrER doivent s’appuyer sur des données empiriques et des raisonnements scientifiques solides.
Rapport d’essai
24. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Essai:
— Essai employé;
Témoins/substance de référence/produit chimique d’essai
— source, numéro de lot, date limite d’utilisation, si disponible
— stabilité du produit chimique d’essai lui-même, si elle est connue;
— solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant, si elles sont connues.
— mesures du pH, de l’osmolalité et du précipité apparu dans le milieu auquel le produit chimique d’essai est ajouté, le cas échéant.
Substance mono-constituant:
— apparence physique, solubilité dans l’eau et autres propriétés physicochimiques pertinentes;
— données d’identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.
Substance multi-constituants, UVBC et mélanges:
— caractérisée, autant que possible par p.ex. l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence quantitative et les propriétés physico-chimiques pertinentes des constituants.
Solvant/Véhicule:
— caractérisation (nature, fournisseur et lot);
— justification du choix du solvant/véhicule;
— solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant/véhicule, le cas échéant;
Récepteurs:
— source des récepteurs (fournisseur, numéro de référence, lot, type de récepteur, concentration de récepteurs actifs indiquée par le fournisseur, certification du fournisseur)
— caractérisation des récepteurs (y compris les résultats des essais de liaison à saturation): Kd, Bmax,
— stockage des récepteurs
— ligand radiomarqué:
— fournisseur, numéro de référence, lot, activité spécifique
Conditions de l’essai:
— limites de solubilité dans les conditions de l’essai;
— composition de la solution tamponnée de l’essai de liaison;
— concentration de récepteur;
— concentration de traceur (ligand radiomarqué);
— concentrations de produit chimique d’essai;
— pourcentage de véhicule dans l’essai final;
— température et durée d’incubation;
— méthode de séparation des ligands liés et libres;
— témoins et produits chimiques positifs et négatifs de référence;
— critères d’interprétation des résultats positif, négatif ou équivoque;
Vérification de l’acceptabilité:
— valeurs réelles des CI50 et pentes de Hill pour les témoins positifs et produits chimiques de référence inclus dans l’essai de liaison compétitive;
Résultats:
— données brutes, données sur les ligands liés ou libres;
— vérification de la dénaturation, s’il y a lieu;
— concentration minimale avec effet (CME), le cas échéant;
— ALR et/ou CI50, le cas échéant;
— relation concentration-réponse, si possible;
— analyses statistiques, le cas échéant, ainsi qu’une mesure de l’erreur et de la confiance (p.ex. erreur-type de la moyenne, écart-type, CV ou IC 95 %) et description de la façon dont ces données ont été obtenues;
Discussion des résultats:
— application de la règle des 10 %.
Conclusion
BIBLIOGRAPHIE
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(18) Santodonato, J. (1997). Review of the Estrogenic and Antiestrogenic Activity of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: Relationship to Carcinogenicity. Chemosphere, 34: 835-848.
(19) Swillens S (1995). Interpretation of Binding Curves Obtained with High Receptor Concentrations: Practical Aid for Computer Analysis, Mol Pharmacol 47(6):1197-1203.
B.71 ESSAIS DE SENSIBILISATION CUTANÉE IN VITRO PORTANT SUR L’ÉVÉNEMENT CLÉ RELATIF À L’ACTIVATION DES CELLULES DENDRITIQUES DANS LA VOIE TOXICOLOGIQUE IMPLIQUÉE DANS LES EFFETS INDÉSIRABLES (AOP) DE SENSIBILISATION CUTANÉE
INTRODUCTION GÉNÉRALE
Méthode d’essai fondée sur l’événement clé relatif à l’activation des cellules dendritiques
1. Un sensibilisant cutané est une substance qui provoque une réponse allergique suite à un contact avec la peau, selon la définition du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques des Nations unies (SGH) (1) et du règlement (CE) no 1272/2008 de l’Union européenne relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges (le «règlement CLP»). Les principales phases du processus biologique de sensibilisation cutanée font l’objet d’un consensus général. Dans le cadre du programme de l’OCDE sur les AOP (2), les connaissances dont on dispose sur les mécanismes chimiques et biologiques associés à la sensibilisation cutanée ont été résumées sous la forme d’un AOP (Adverse Outcome Pathway) ou voie toxicologique impliquée dans les effets indésirables, allant de l’événement moléculaire initiateur jusqu’aux effets indésirables sur la santé du type dermatite de contact allergique, en passant par les étapes intermédiaires. Dans le cas présent, l’événement moléculaire initiateur (le premier événement clé) est l’établissement d’une liaison covalente entre des substances chimiques électrophiles et les centres nucléophiles des protéines de la peau. Le deuxième événement clé sur cet AOP se déroule dans les kératinocytes et comprend des réponses inflammatoires et des changements d’expression génique, liés à des voies de signalisation cellulaire spécifiques telles que les voies dépendant de l’élément de réponse antioxydant/électrophile (ARE, Antioxidant Response Element). Le troisième événement clé est l’activation des cellules dendritiques (DC), habituellement évaluée d’après l’expression de marqueurs de surface spécifiques de la cellule, les chimiokines et les cytokines. Le quatrième événement clé est la prolifération et l’activation des lymphocytes T, évaluée indirectement par l’essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques (ELGL) chez la souris (3).
2. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice (LD) 442E (2017) de l’OCDE. Elle décrit les essais in vitro portant sur les mécanismes de l’événement clé relatif à l’activation des cellules dendritiques dans l’AOP de sensibilisation cutanée (2). La méthode d’essai comprend des essais utilisés pour aider à distinguer les sensibilisants des non-sensibilisants cutanés, selon le SGH de l’ONU et le règlement CLP.
Les essais décrits dans la présente méthode d’essai sont les suivants:
— test d’activation de la lignée cellulaire humaine (h-CLAT),
— test d’activation de la lignée cellulaire U937 (U-SENS™)
— essai par gène rapporteur de l’interleukine 8 (essai IL-8 Luc)
3. Les essais décrits dans la présente méthode d’essai et dans la ligne directrice correspondante de l’OCDE peuvent différer sur les plans de la procédure employée pour générer les données et des résultats mesurés, mais ils peuvent s’utiliser indifféremment pour répondre aux exigences des pays en matière de résultats d’essais portant sur l’événement clé relatif à l’activation des cellules dendritiques dans l’AOP de sensibilisation cutanée, tout en bénéficiant de l’acceptation mutuelle des données de l’OCDE.
Fondements et principes des essais inclus dans la méthode d’essai fondée sur les événements clés
4. Traditionnellement, l’évaluation de la sensibilisation cutanée a fait appel à l’expérimentation animale. Les méthodes classiques qui utilisent un cobaye – le test de maximisation chez le cobaye (GPMT) de Magnusson et Kligman et le test de Buehler, également chez le cobaye (méthode d’essai B.6) (4) – portent sur les phases d’induction et d’élicitation de la sensibilisation cutanée. Les essais chez la souris – l’ELGL (méthode d’essai B.42) (3) et ses deux variantes n’utilisant pas d’isotopes radioactifs, l’ELGL: DA (méthode d’essai B.50) (5) et l’ELGL: BrdU-ELISA (méthode d’essai B.51) (6) – portant tous trois sur la réponse à l’induction exclusivement, se sont également imposés, car ils présentent l’avantage, par rapport aux tests sur le cobaye, de préserver davantage le bien-être animal et de fournir une mesure objective de la phase d’induction de la sensibilisation cutanée.
5. Récemment, des méthodes d’essai de type mécanistique in chemico ou in vivo portant sur le premier événement clé de l’AOP de sensibilisation cutanée [méthode d’essai B.59: essai de liaison directe sur la réactivité peptifique (DPRA)] (7) ou sur le deuxième événement clé de l’AOP de sensibilisation cutanée (méthode d’essai B.60: essai ARE-Nrf2 luciférase) (8) ont été adoptées pour contribuer à l’évaluation du potentiel de sensibilisation des produits chimiques.
6. Les essais décrits dans la présente méthode d’essai permettent de quantifier, au choix, soit les variations d’expression de marqueurs de surface associés au processus d’activation des monocytes et des DC suite à l’exposition à un sensibilisant (CD54 et CD86, par exemple), soit les changements d’expression de l’IL-8, une cytokine associée à l’activation des DC. Il a été signalé que les sensibilisants cutanés induisent l’expression de marqueurs membranaires associés à l’activation des DC (2) tels que CD40, CD54, CD80, CD83 et CD86, induisent aussi des cytokines pro-inflammatoires telles que IL-1β et TNF-α, ainsi que plusieurs chimiokines parmi lesquelles IL-8 (CXCL8) et CCL3 (9) (10) (11) (12).
7. Cependant, l’activation des DC n’est qu’un des événements clés de l’AOP sensibilisation cutanée (2) (13), les informations fournies par les essais mesurant uniquement les marqueurs de l’activation des DC peuvent ne pas suffire à elles seules pour conclure à l’absence de pouvoir de sensibilisation cutanée des produits chimiques. Par conséquent, les données obtenues avec les essais décrits dans la présente LD peuvent apporter une aide à l’identification des sensibilisants cutanés (catégorie 1 du SGH de l’ONU/CLP) et des non-sensibilisants, dans le cadre d’une approche intégrée (IATA), en combinant ces données à d’autres informations complémentaires provenant par exemple d’essais in vitro portant sur d’autres phases de l’AOP sensibilisation cutanée, ainsi que de méthodes non expérimentales telles que la prévision à partir de données croisées (read-across) relatives à des produits chimiques similaires (13). On trouvera dans la littérature des exemples d’utilisation des données obtenues avec ces essais suivant des approches définies, c’est-à-dire des approches normalisées au regard des sources d’information et des procédures d’analyse des données à des fins de prédictions (13). Ces données peuvent constituer des éléments utiles dans le cadre d’une démarche IATA.
8. Les essais décrits dans cette méthode d’essai ne peuvent pas être utilisés seuls, ni pour le classement des sensibilisants cutanés dans les sous-catégories 1A et 1B du SGH de l’ONU/CLP par les autorités chargées d’appliquer ces deux sous-catégories optionnelles, ni pour prédire la puissance de sensibilisation dans le cadre d’évaluations de sécurité. Cependant, en fonction du cadre réglementaire applicable, des résultats positifs avec ces méthodes peuvent être considérés comme suffisants à eux seuls pour classer un produit chimique dans la catégorie 1 du SGH de l’ONU/CLP.
9. Dans la présente méthode d’essai, le terme «produit chimique d’essai» désigne ce qui est testé et ne fait pas référence à l’applicabilité des essais pour tester les substances mono-constituants, les substances multi-constituants ou les mélanges. On dispose actuellement d’informations limitées sur l’applicabilité des essais à des substances multi-constituants ou à des mélanges (14) (15). Les essais sont néanmoins techniquement applicables aux essais de substances multi-constituants et de mélanges. Toutefois, avant d’appliquer la présente méthode d’essai à un mélange pour obtenir des données à des fins réglementaires, il convient de vérifier si et, dans l’affirmative, pourquoi les résultats peuvent être acceptables dans le cadre réglementaire imposé. Cette vérification n’est pas nécessaire si l’essai du mélange répond à une exigence réglementaire. De plus, en cas d’essai portant sur des substances multi-constituants ou des mélanges, il convient de tenir compte de l’interférence possible de la cytotoxicité des constituants avec les réponses observées.
BIBLIOGRAPHIE
(1) Nations Unies (2015). Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH). Sixième édition révisée. New York & Genève: Publications des Nations unies. ISBN: 978-92-1-117087-0. Disponible à l’adresse suivante: https://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/06files_e.html.
(2) OCDE (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Série sur les essais et évaluations No 168. Disponible à l’adresse suivante: http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?cote=ENV/JM/MONO(2012)10/PART1&docLanguage=En.
(3) Chapitre B.42 de la présente annexe: essai de stimulation locale des ganglions lympathiques. Chapitre B.6 de la présente annexe: sensibilisation cutanée.
(4) Chapitre B.6 de la présente annexe: sensibilisation cutanée.
(5) Chapitre B.50 de la présente annexe: sensibilisation cutanée: essai de stimulation locale des ganglions lymphatique: DA.
(6) Chapitre B.51 de la présente annexe: essai de sensibilisation cutanée: essai de stimulation locale des ganglions lymphatiques: BrdU-ELISA.
(7) Chapitre B.59 de la présente annexe: sensibilisation cutanée in chemico: essai de liaison directe sur la réactivité peptidique (DPRA).
(8) Chapitre B.60 de la présente annexe: sensibilisation cutanée in vitro: méthode d’essai ARE-Nrf2 Luciferase.
(9) Steinman RM. (1991). The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu Rev Immunol 9:271-96.
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(13) OCDE (2016). Série sur les essais et évaluations No 256: Guidance Document On The Reporting Of Defined Approaches And Individual Information Sources To Be Used Within Integrated Approaches To Testing And Assessment (IATA) For Skin Sensitisation, Annex 1 and Annex 2. ENV/JM/HA(2016)29. Organisation de coopération et de développement économiques, Paris. Disponible à l’adresse suivante: https://community.oecd.org/community/iatass.
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(15) Piroird, C., Ovigne, J.M., Rousset, F., Martinozzi-Teissier, S., Gomes, C., Cotovio, J., Alépée, N. (2015). The Myeloid U937 Skin Sensitization Test (U-SENS) addresses the activation of dendritic cell event in the adverse outcome pathway for skin sensitization. Toxicol. In Vitro 29, 901-916.
»
(9) Dans la partie C, les chapitres suivants sont ajoutés:
«C.52 ÉTUDE ÉTENDUE DE TOXICITÉ POUR LA REPRODUCTION SUR UNE GÉNÉRATION CHEZ MÉDAKA (MEOGRT)
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice (LD) 240 (2015) de l’OCDE. L’étude étendue sur une génération chez médaka (Medaka Extended One Generation Test, MEOGRT) est un essai complet d’exposition sur plusieurs générations chez le poisson visant à obtenir des données pouvant servir à l’évaluation des dangers et des risques pour l’environnement liés aux produits chimiques, en particulier les produits suspectés d’être des perturbateurs endocriniens (PE). L’exposition dans l’essai MEOGRT est poursuivie jusqu’à l’éclosion (jusqu’à deux semaines post-fécondation, spf) dans la seconde génération (F2). Des investigations complémentaires seraient nécessaires pour justifier une extension éventuelle au-delà de l’éclosion à la génération F2; actuellement, les données disponibles ne fournissent pas d’éléments ou de critères justifiant une extension de la génération F2. Cependant, cette méthode d’essai pourra être mise à jour en fonction d’éventuelles informations ou données nouvelles. Il pourra ainsi être conseillé, dans certaines circonstances, d’étendre la génération F2 jusqu’à la reproduction (dans le cas de produits chimiques présentant un pouvoir élevé de bioconcentration, ou d’indications relatives à des effets transgénérationnels dans d’autres taxons). Cette méthode d’essai peut être utilisée pour l’évaluation des effets chroniques potentiels des produits chimiques, notamment ceux susceptibles d’avoir des effets perturbateurs sur le système endocrinien, chez le poisson. La méthode décrite vise principalement à mettre en évidence des effets potentiels pertinents au niveau d’une population (à savoir des impacts indésirables sur la survie, le développement, la croissance et la reproduction) afin de calculer une concentration sans effet observé (CSEO) ou une concentration efficace à × % (CEx); il convient cependant de noter que les approches de type CEx sont rarement adaptées aux études de grande ampleur de ce type, où l’augmentation du nombre de concentrations d’essai en vue de déterminer la CEx souhaitée peut être impraticable et peut aussi poser des problèmes en termes de bien-être animal, compte tenu du grand nombre d’animaux utilisés. Pour les produits chimiques ne nécessitant pas une évaluation multigénérationnelle ou ne constituant pas des perturbateurs endocriniens potentiels, d’autres essais peuvent être plus adaptés (1). Le médaka japonais est l’espèce à utiliser pour cette méthode d’essai en raison de la brièveté de son cycle de vie et de la possibilité de déterminer son sexe génétique (2), qui est un élément clé pour cette méthode. Les méthodes et effets observés spécifiques décrits dans la présente méthode d’essai s’appliquent exclusivement au médaka japonais. D’autres espèces de petits poissons (le poisson-zèbre, par exemple) peuvent être adaptées à un protocole d’essai similaire.
2. Plusieurs effets biologiques sont mesurés dans la présente méthode d’essai. Il s’agit en premier lieu de mettre en évidence les effets indésirables potentiels sur des paramètres pertinents en termes de population, tels que la survie, le développement macroscopique, la croissance et la reproduction. En second lieu, afin de disposer d’informations mécanistiques et de pouvoir établir des liens entre les résultats d’autres types d’études de terrain ou de laboratoire établissant a posteriori une activité potentielle de perturbation du système endocrinien (activité androgénique ou œstrogénique dans d’autres tests et essais, par exemple), on obtient d’autres informations utiles en mesurant l’ARNm de la vitellogénine (vtg) (ou la protéine vitellogénine, VTG) et des caractères sexuels secondaires (CSS) phénotypiques liés au sexe génétique, et en procédant à une évaluation histopathologique. Il convient de noter que si un produit chimique d’essai ou ses métabolites ne sont pas suspectés d’être des PE, il est possible de se dispenser de mesurer ces effets secondaires, des études nécessitant moins de ressources et d’animaux étant alors plus appropriées (1). Les définitions utilisées dans cette méthode d’essai sont données à l’appendice 1.
REMARQUES PRELIMINAIRES ET LIMITES
3. Étant donné le nombre limité de produits chimiques d’essais et le nombre limité de laboratoires impliqués dans l’étude de validation de cette méthode d’essai complexe, on peut s’attendre à ce que la méthode d’essai soit réexaminée et si nécessaire mise à jour à la lumière de l’expérience acquise. Ces données peuvent être utilisées au niveau 5 du Cadre conceptuel de l’OCDE pour les essais et l’évaluation des perturbateurs endocriniens (3). La méthode d’essai commence par l’exposition de poissons adultes (génération F0) au produit chimique d’essai durant la phase de reproduction. L’exposition se poursuit durant les phases de développement et de reproduction à la génération F1 et la phase d’éclosion à la génération F2; l’essai permet donc d’évaluer les voies endocriniennes tant sur le plan structurel que sur celui de l’activation. Une approche fondée sur l’analyse du poids de la preuve peut être mise en œuvre dans l’interprétation des effets mesurés au niveau endocrinien.
4. Cet essai doit porter sur un nombre d’individus permettant de garantir une puissance suffisante à l’évaluation des effets relatifs à la reproduction (voir appendice 3), ce nombre ne dépassant pas toutefois le minimum requis eu égard au bien-être animal. Compte tenu du grand nombre d’animaux utilisés, il importe de considérer avec attention la nécessité de l’essai, en fonction des données existantes qui pourraient déjà comporter des informations pertinentes sur bon nombre des effets mesurés dans l’essai MEOGRT. Le document de l’OCDE Fish Toxicity Testing Framework (Série sur les essais et évaluations, no 171) peut apporter une aide à cet égard (1).
5. La méthode d’essai a été conçue pour permettre la mise en évidence des effets d’une seule substance. Cependant, si un essai doit être réalisé sur un mélange, il convient de vérifier si les résultats seront acceptables dans le cadre réglementaire imposé.
6. Avant d’entamer l’essai, il est important de disposer d’informations sur les propriétés physico-chimiques du produit chimique d’essai, afin notamment de s’assurer de la stabilité des solutions de ce produit. Il est aussi nécessaire de maîtriser une méthode analytique suffisamment sensible permettant de vérifier les concentrations du produit chimique d’essai.
PRINCIPE DE L’ESSAI
7. L’essai commence par l’exposition de mâles et de femelles sexuellement matures (au minimum 12 spf) par couples reproducteurs pendant 3 semaines, au cours desquelles le produit chimique d’essai est distribué dans l’organisme de la génération parentale (F0) selon le comportement toxicocinétique du produit. Le plus près possible du premier jour de la quatrième semaine, les œufs sont récoltés en vue d’obtenir la génération F1. Au cours de l’élevage de la génération F1 (15 semaines au total), le taux d’éclosion et la survie sont évalués. De plus, des poissons sont prélevés à 9-10 spf pour la mesure des effets sur le développement, et la ponte est évaluée sur trois semaines, de 12 à 14 spf. Une génération F2 est obtenue après la troisième semaine d’évaluation de la reproduction, et élevée jusqu’à la fin de l’éclosion.
CRITÈRES DE VALIDITÉ DE L’ESSAI
8. Les critères de validité de l’essai sont les suivants:
— La concentration d’oxygène dissous est ≥ 60 % de la valeur de saturation en air pendant tout l’essai;
— La température moyenne de l’eau pendant toute la durée de l’étude est comprise entre 24 et 26 °C. De brefs écarts par rapport à la moyenne dans certains aquariums n’excèdent pas 2 °C;
— La fécondité moyenne des témoins dans chaque génération (F0 et F1) est supérieure à 20 œufs par couple et par jour. La fertilité de tous les œufs produits durant l’évaluation est supérieure à 80 %. De plus, 16 des 24 couples reproducteurs témoins recommandés (soit plus de 65 % d’entre eux) produisent plus de 20 œufs par couple et par jour;
— Le taux d’éclosion des œufs est ≥ 80 % (en moyenne) chez les témoins (dans chacune des générations F1 et F2);
— La survie après éclosion jusqu’à 3 spf et de 3 spf jusqu’à l’euthanasie pour la génération F1 (soit 15 spf) est ≥ 80 % (en moyenne) et ≥ 90 % (en moyenne) respectivement chez les témoins (F1);
— Les données disponibles démontrent que la concentration du produit chimique d’essai en solution a été correctement maintenue dans un intervalle de ± 20 % autour des valeurs moyennes mesurées.
En ce qui concerne la température de l’eau, bien que cela ne soit pas un critère de validité, les réplicats au sein d’un traitement ne doivent pas être statistiquement différents les uns des autres, et les groupes traités au sein d’un essai ne doivent pas être statistiquement différents les uns des autres (sur la base des températures mesurées quotidiennement, et en excluant les écarts de courte durée).
9. Bien qu’une baisse de la reproduction puisse être observée dans les groupes exposés aux concentrations les plus élevées, la reproduction devrait être suffisante, au moins dans le troisième groupe le plus exposé et tous les groupes les moins exposés de la génération F0, pour remplir les incubateurs éclosoirs. De plus, la survie embryonnaire dans le troisième groupe le plus exposé et les groupes les moins exposés de la génération F1 doit être de nature à permettre l’évaluation des effets mesurés lors du prélèvement subadulte (voir les paragraphes 36 et 38 et l’appendice 9). En outre, on doit observer au moins une survie post-éclosion minimale (~20 %) dans le second groupe le plus exposé de F1. Ces points ne sont pas des critères de validité, mais des recommandations visant à permettre le calcul des CSEO sur des bases solides.
10. Si un écart par rapport aux critères de validité de l’essai est observé, les conséquences doivent être appréciées au regard de la fiabilité des résultats de l’essai et ces écarts et leur appréciation doit être consignée dans le rapport d’essai.
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Appareillage
11. On utilise du matériel courant de laboratoire et en particulier:
(a) oxygénomètre et pH-mètre;
(b) instrument permettant de mesurer la dureté et l’alcalinité de l’eau;
(c) dispositif adéquat de régulation de la température avec, de préférence, une surveillance en continu;
(d) cuves en matériau chimiquement inerte et de capacité adaptée à la charge et à la densité de peuplement recommandées (voir appendice 3);
(e) balance suffisamment précise (précision de ± 0,5 mg).
Eau
12. On utilise une eau dans laquelle l’espèce soumise à l’essai présente des taux adéquats de croissance et de survie à long terme. Cette eau doit être de qualité constante pendant la durée de l’essai. Pour s’assurer que l’eau de dilution ne puisse pas influer sur le résultat de l’essai (par complexation du produit chimique d’essai, par exemple) ou avoir des effets néfastes sur la performance des poissons géniteurs, on prélèvera des échantillons à différents intervalles pour analyse. Le dosage des métaux lourds (Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni, par exemple), des principaux anions et cations (Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO42-, par exemple), des pesticides, du carbone organique total et des solides en suspension doit être effectué tous les six mois, par exemple, pour une eau de dilution connue pour être de qualité relativement constante. Certaines caractéristiques chimiques pour une eau de dilution acceptable sont énumérées à l’appendice 2. Le pH de l’eau doit se situer entre 6,5 et 8,5 et ne pas varier de au-delà de 0,5 unité au cours de l’essai.
Système d’exposition
13. La conception et les matériels utilisés pour le système d’exposition ne sont pas spécifiés. On utilisera pour la construction du système d’exposition du verre, de l’acier inoxydable ou d’autres matériaux chimiquement inertes qui n’auront pas été contaminés par de précédents essais. Pour cet essai, un système dynamique constituera par exemple un système d’exposition adapté (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13).
Solutions d’essai
14. Une solution mère du produit chimique d’essai est introduite dans le système d’exposition à l’aide d’une pompe appropriée. Le débit de la solution mère doit être calibré d’après les données analytiques relatives aux solutions d’essai établies avant le début de l’exposition, et faire l’objet d’un contrôle volumétrique périodique au cours de l’essai. La solution d’essai est renouvelée dans chaque enceinte selon les besoins (minimum de 5 renouvellements en volume/jour, par exemple, et jusqu’à 16 renouvellements en volume/jour, soit un débit pouvant aller jusqu’à 20 m/min), selon la stabilité du produit chimique d’essai et la qualité de l’eau.
15. Des solutions d’essai sont ajustées à la concentration voulue par dilution d’une solution mère. La solution mère est, de préférence, préparée par simple mélange ou agitation du produit chimique d’essai dans l’eau de dilution par des moyens mécaniques (agitation et/ou ultrasons, par exemple). Des colonnes/systèmes de saturation ou des méthodes de dosage passif (14) peuvent être utilisés pour l’obtention d’une solution mère à la concentration voulue. On s’efforcera dans toute la mesure du possible d’éviter l’emploi de solvants et autres véhicules car: (1) certains solvants peuvent avoir eux-mêmes des effets toxiques et/ou induire des réponses indésirables ou inattendues, (2) l’essai de produits chimiques à une concentration supérieure à leur solubilité dans l’eau (ce qui arrive fréquemment si des solvants sont utilisés) peut fausser la détermination des concentrations efficaces, (3) le recours aux solvants dans les essais à long terme peut se traduire par la formation importante de biofilms associés à une activité microbienne, ce qui peut avoir un impact sur les conditions environnementales et sur la capacité de maintenir les concentrations d’exposition, et (4) en l’absence de données historiques démontrant que le solvant n’influe pas sur les résultats de l’étude, l’usage de solvants nécessite le traitement d’un groupe témoin avec solvant, ce qui a des effets significatifs en termes de bien-être animal, des animaux supplémentaires étant alors nécessaires pour la conduite de l’essai. Pour les produits chimiques difficiles à tester, un solvant peut être employé en dernier ressort, et l’on consultera alors le Document d’orientation de l’OCDE no 23 sur les essais de toxicité aquatique des substances et mélanges «difficiles» (15) afin de déterminer la meilleure méthode à employer. Le solvant sera choisi en fonction des propriétés chimiques du produit chimique d’essai et de la disponibilité de données historiques sur l’utilisation du solvant. En cas de recours à un solvant comme véhicule, des témoins appropriés pour le solvant seront analysés en plus des témoins (négatifs) sans solvant (eau de dilution seule). Si le recours à un solvant est inévitable et si une activité microbienne (formation de biofilms) se produit, il est recommandé de noter/consigner dans le rapport la présence de biofilm dans chaque cuve (au moins une fois par semaine) pendant toute la durée de l’essai. Idéalement, la concentration de solvant devra être maintenue constante dans le témoin avec solvant et tous les groupes traités. Si la concentration de solvant n’est pas maintenue constante, c’est la concentration de solvant la plus forte dans le traitement d’essai qui sera utilisée chez le témoin avec solvant. Si un solvant est utilisé comme véhicule, les concentrations maximales de solvant ne devront pas dépasser 100 μl/l ou 100 mg/l (15), et il est recommandé de maintenir la concentration de solvant aussi bas que possible (< 20 μl/l, par exemple), pour éviter que le solvant puisse avoir une incidence sur les effets mesurés (16).
Animaux d’essai
Sélection et stabulation des poissons
16. L’espèce soumise aux essais est le médaka japonais Oryzias latipes, en raison de la brièveté de son cycle de vie et de la possibilité de déterminer son sexe génétique. Bien que d’autres espèces de petits poissons puissent convenir pour un protocole d’essai similaire, les méthodes et observations spécifiques décrites dans cette méthode d’essai s’appliquent exclusivement au médaka japonais (voir le paragraphe 1). Le médaka se prête bien à la reproduction en captivité; des méthodes ont été publiées pour sa culture (17) (18) (19), et l’on dispose de données d’essais sur la létalité à court terme, les premiers stades de la vie et le cycle de vie complet (5) (6) (8) (9) (20). Tous les poissons sont soumis à une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité. Ils sont nourris avec des artémies vivantes, Artemia spp., nauplii qui peuvent être complétés par de la nourriture en flocons du commerce, si nécessaire. Des analyses pratiquées régulièrement sur les aliments en flocons doivent permettre de s’assurer qu’ils ne sont pas contaminés.
17. Dans la mesure où des méthodes d’élevage appropriées sont suivies, il n’est pas nécessaire d’appliquer un protocole de culture spécifique. Le médaka peut par exemple être élevé en cuves de 2 l avec 240 larves par cuve jusqu’à 4 spf, puis en cuves de 2 l avec 10 poissons par cuve jusqu’à 8 spf, après quoi les couples reproducteurs sont transférés dans des cuves de 2 l.
Acclimatation et sélection des poissons
18. Les poissons d’essai sont sélectionnés parmi une population de laboratoire issue d’une même lignée, qui aura été acclimatée pendant au moins deux semaines avant l’essai dans des conditions de qualité de l’eau et d’éclairage semblables à celles de l’essai (nota: cette période d’acclimatation n’est pas une période de pré-exposition in situ). Il est recommandé que les poissons d’essai soient obtenus par culture en interne, le transport des poissons adultes étant stressant et pouvant interférer avec une ponte fiable. Les poissons doivent être nourris de nauplii d’artémies deux fois par jour pendant toute la période d’élevage et la phase d’exposition, complétés si nécessaire par des aliments en flocons du commerce. Un minimum de 42 couples reproducteurs (54 couples si un témoin avec solvant est requis en raison, notamment, de l’absence de données historiques à l’appui de l’utilisation du seul témoin sans solvant) sont considérés comme nécessaires pour démarrer cet essai de façon à garantir la réplication adéquate. En outre, il convient de vérifier pour chaque couple reproducteur de la génération F0 qu’il s’agit bien d’un couple XX-XY (présentant pour chaque sexe la configuration normale de chromosomes sexuels), afin d’éviter l’inclusion possible de mâles spontanés XX (voir le paragraphe 39).
19. Durant la phase d’acclimatation, la mortalité chez les poissons de culture doit être consignée, et les critères suivants s’appliquent après une période d’adaptation de 48 h:
— mortalité supérieure à 10 % de la population en culture dans les sept jours précédant le transfert vers le système d’essai: rejet du lot complet;
— mortalité comprise entre 5 % et 10 % de la population dans les sept jours précédant le transfert vers le système d’essai: acclimatation pendant sept jours en plus de la période d’acclimatation de 2 semaines; si la mortalité est supérieure à 5 % durant la seconde période de sept jours, rejet du lot complet;
— mortalité inférieure à 5 % de la population dans les sept jours précédant le transfert vers le système d’essai: acceptation du lot.
20. Les poissons ne doivent pas recevoir de traitement contre une maladie durant la période d’acclimatation de deux semaines précédant l’essai et durant la période d’exposition, et tout traitement doit être complètement évité si possible. Les poissons présentant des signes cliniques de maladies ne doivent pas être utilisés dans l’étude. Un relevé d’observations et de tout traitement prophylactique ou thérapeutique pendant la période de culture précédant l’essai doit être assuré.
21. La phase d’exposition débute avec des adultes sexuellement dimorphiques, génétiquement sexués, issus d’une population de laboratoire d’animaux sexuellement matures élevés à 25 ± 2 °C. Les poissons doivent être identifiés comme des reproducteurs avérés (ayant produit une descendance viable) dans la semaine précédant l’exposition. Pour tout le groupe de poissons utilisés lors de l’essai, la plage des poids individuels par sexe au début de l’essai ne doit pas sortir d’un intervalle de ± 20 % autour de la moyenne arithmétique des poids pour le même sexe. Un sous-échantillon de poissons sera pesé avant l’essai afin d’estimer le poids moyen. Les poissons sélectionnés doivent être au moins à 12 spf, et avoir un poids ≥ 300 mg pour les femelles et ≥ 250 mg pour les mâles.
CONCEPTION DE L’ESSAI
Concentrations d’essai
22. Il est recommandé d’utiliser cinq concentrations d’essai, en plus du/des témoin(s). Toutes les sources d’information doivent être prises en compte lors du choix de la gamme de concentrations d’essai, y compris les relations quantitatives structure-activité (QSAR), les données établies par la méthode des références croisées, les résultats d’essais sur les poissons tels que les essais de toxicité aiguë (chapitre C.1 de la présente annexe), l’essai de reproduction à court terme chez les poissons (chapitre C.48 de la présente annexe) et d’autres méthodes d’essai , comme les chapitres C.15, C.37, C.41, C.47 ou C.49 de la présente annexe (21) (22) (23) (24) (25) (26) si ces données sont disponibles ou, si nécessaire, les résultats d’un essai visant à déterminer la gamme des concentrations et couvrant éventuellement une phase de reproduction. Si un essai de détermination de la gamme des concentrations est nécessaire, il peut être conduit dans des conditions (qualité de l’eau, système d’essai, charge animale) similaires à celles de l’essai définitif. Si l’usage d’un solvant est nécessaire et qu’aucune donnée historique n’est disponible, l’essai de détermination de la gamme de concentrations peut être utilisé pour s’assurer de l’adéquation du solvant. La concentration d’essai la plus élevée ne doit pas dépasser la solubilité dans l’eau, 10 mg/l ou 1/10e de la CL50 à 96 h (27). La concentration la plus basse doit être de 10 à 100 fois plus faible que la concentration la plus élevée. L’utilisation de cinq concentrations dans cet essai permet non seulement de mesurer les relations dose-réponse, mais fournit en outre la concentration minimale avec effet observé (CMEO) et la CSEO requises pour l’évaluation des risques dans certains programmes à visée réglementaire ou contextes juridiques. En règle générale, le facteur d’espacement des concentrations nominales de produit chimique d’essai entre niveaux de traitement adjacents est ≤ 3,2.
Réplicats au sein des groupes traités et des témoins
23. Il convient d’utiliser un minimum de six enceintes réplicats par concentration d’essai (voir appendice 7). Pendant la phase de reproduction (excepté pour la génération F0), la structure de réplication est doublée pour l’évaluation de la fécondité et chaque réplicat comporte un seul couple reproducteur (voir paragraphe 42).
24. Outre la série de concentrations du produit chimique d’essai, on utilisera une enceinte témoin contenant de l’eau de dilution uniquement et, si nécessaire, une autre contenant uniquement le solvant dans l’eau. Le nombre d’enceintes réplicats doit être doublé pour les témoins, afin de garantir la puissance statistique requise (au moins douze réplicats devront être utilisés pour les témoins). Durant la phase de reproduction, le nombre de réplicats est doublé chez les témoins (soit 24 réplicats au minimum, chaque réplicat ne comportant qu’un seul couple reproducteur). Après la reproduction, les réplicats témoins ne doivent pas contenir plus de 20 embryons (poissons).
PROCÉDURE
Début de l’essai
25. Les poissons adultes sexuellement actifs utilisés pour démarrer la génération F0 de l’essai sont sélectionnés sur deux critères: âge (le plus souvent plus de 12 spf mais de préférence pas plus de 16 spf) et poids (à savoir femelles ≥ 300 mg et mâles ≥ 250 mg).
26. Les couples mâle-femelle répondant aux spécifications ci-dessus sont placés par couples individuels dans les cuves destinées à recevoir les réplicats, soit douze réplicats chez les témoins et six réplicats dans les groupes traités par le produit chimique au début de l’essai. Ces cuves sont assignées de façon aléatoire à un traitement (par exemple T1-T5 et témoin) et un réplicat (par exemple A-L témoins et A-F traités), puis placées dans le système d’exposition avec le débit approprié pour chaque cuve.
Conditions d’exposition
27. On trouvera à l’appendice 3 un récapitulatif complet des paramètres et conditions d’essai. Le respect de ces spécifications devrait se traduire chez les témoins par des valeurs mesurées similaires à celles indiquées à l’annexe4.
28. Au cours de l’essai, l’oxygène dissous, le pH et la température doivent être mesurés dans au moins un récipient d’essai pour chaque groupe traité et le groupe témoin. Ces mesures, à l’exception des mesures de température, doivent être réalisées au moins une fois par semaine pendant la période d’exposition. La température moyenne de l’eau pendant toute la durée de l’étude doit se situer entre 24 et 26 °C. La température doit être mesurée chaque jour pendant la période d’exposition. Le pH de l’eau doit se situer entre 6,5 et 8,5 et ne pas varier de au-delà de 0,5 unité au cours de l’essai. Les réplicats au sein d’un traitement ne doivent pas différer statistiquement les uns des autres, et les groupes traités au sein de l’essai ne doivent pas différer statistiquement les uns des autres (sur la base des mesures quotidiennes de température, et en excluant de brefs écarts).
Durée d’exposition
29. L’essai expose des poissons sexuellement aptes à la reproduction en commençant par la génération F0, exposée pendant trois semaines. A la semaine 4, approximativement au 24e jour d’essai, la génération F1 est mise en place, les couples reproducteurs F0 sont euthanasiés et leur poids et leur longueur sont consignés (voir paragraphe 34). La génération F1 est ensuite exposée pendant plus de 14 semaines (15 semaines au total pour F1) et la génération F2 est exposée pendant deux semaines jusqu’à l’éclosion. La durée totale de l’essai est en principe de 19 semaines (jusqu’à l’éclosion de F2). Le déroulement chronologique de l’essai est représenté au tableau 2 et expliqué en détail à l’appendice 9.
Régime alimentaire
30. Les poissons peuvent être nourris ad libitum d’artémies (Artemia spp., nauplii âgés de 24 heures), complétées si nécessaire par des aliments en flocons du commerce. Il convient d’analyser régulièrement les aliments en flocons pour s’assurer qu’ils ne sont pas contaminés par des pesticides organochlorés, des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) ou des polychlorobiphényles (PCB). Les aliments présentant un niveau élevé de substances agissant sur le système endocrinien (c’est-à-dire de phyto-œstrogènes) qui pourraient compromettre la réponse à l’essai sont à éviter. Les aliments non consommés et les matières fécales doivent être retirés des récipients d’essai par des méthodes appropriées, par exemple par un nettoyage soigneux du fond de chaque cuve au moyen d’un siphon. Les côtés et le fond de chaque cuve doivent également être nettoyés une ou deux fois par semaine (par grattage avec une spatule, par exemple). On trouvera à l’appendice 5 un exemple de régime alimentaire. Les doses distribuées sont fonction du nombre de poissons par réplicat. Elles sont donc réduites en cas de mortalité dans un réplicat.
Dosages analytiques et mesures
31. Avant le début de la période d’exposition, il convient de vérifier le bon fonctionnement du système de distribution du produit chimique. Toutes les méthodes analytiques nécessaires doivent être établies, et il faut disposer d’une connaissance suffisante de la stabilité du produit chimique dans le système d’essai. Durant l’essai, les concentrations de produit chimique d’essai sont déterminées à des intervalles appropriés, de préférence une fois par semaine sur un réplicat pour chaque groupe traité, en changeant chaque semaine de réplicat dans un même groupe.
32. Au cours de l’essai, les débits de diluant et de solution mère doivent être vérifiés à intervalles réguliers (au minimum trois fois par semaine, par exemple). Il est recommandé de fonder les résultats sur les concentrations mesurées. Cependant, si la concentration du produit chimique d’essai en solution a été correctement maintenue tout au long de l’essai dans un intervalle de ± 20 % autour des valeurs moyennes mesurées, les résultats pourront être calculés à partir des valeurs nominales ou mesurées. Dans le cas de produits chimiques présentant une accumulation marquée chez le poisson, les concentrations d’essai pourront décroître au fur et à mesure de la croissance des poissons. En pareil cas, il est recommandé d’adapter le taux de renouvellement de la solution d’essai dans chaque cuve afin que les concentrations d’essai restent aussi constantes que possible.
Observations et effets mesurés
33. Les effets mesurés sont la fécondité, la fertilité, l’éclosion, la croissance et la survie, l’objectif étant d’évaluer les effets possibles au niveau de la population. Des observations du comportement doivent également être réalisées chaque jour, et tout comportement inhabituel doit être consigné. Les autres effets mesurés, d’ordre mécanistique, sont les niveaux hépatiques d’ARN messager de la vitellogénine (ARNm vtg) ou de protéine VTG établis par immuno-essai ((28), par exemple), les marqueurs sexuels phénotypiques tels que les papilles de la nageoire anale caractéristiques du mâle, l’évaluation histologique du sexe gonadique et l’évaluation histopathologique des reins, du foie et des gonades (voir la liste des effets mesurés au tableau 1). Tous ces effets spécifiques sont évalués dans le contexte de la détermination du sexe génétique de l’individu, basée sur la présence ou l’absence du gène dmy déterminant le sexe masculin chez médaka (voir le paragraphe 41). Le délai de ponte est également évalué. En outre, un sex-ratio phénotypique simple peut être établi sur la base des informations fournies par le comptage des papilles de la nageoire anale, permettant de définir les individus comme mâle ou femelle du point de vue phénotypique. La présente méthode d’essai ne saurait détecter des déviations modérées par rapport au sex-ratio attendu, car le nombre relativement faible de poissons par réplicat n’apporte pas une puissance statistique suffisante. Aussi, lors de l’évaluation histopathologique, les gonades sont évaluées et des analyses beaucoup plus puissantes sont réalisées pour la détermination du phénotype gonadique dans le contexte du sexe génétique.
34. L’objectif premier de cette méthode d’essai est d’évaluer les effets potentiels au niveau d’une population d’un produit chimique d’essai. Les effets mécanistiques mesurés (VTG, CSS et certains effets histopathologiques touchant les gonades) peuvent également aider à déterminer s’il existe un effet médié par une activité endocrinienne. Cependant, ces effets d’ordre mécanistique peuvent aussi être influencés par une toxicité systémique ou autre. On pourra donc aussi évaluer plus précisément l’histopathologie hépatique et rénale dans le but de mieux comprendre les éventuelles réponses au niveau des effets mécanistiques mesurés. Toutefois, si ces évaluations précises ne sont pas réalisées, les anomalies macroscopiques observées incidemment lors de l’évaluation histopathologique devront néanmoins être relevées et consignées dans le rapport.
Euthanasie des poissons
35. A la fin de l’exposition des générations F0 et F1 et lorsqu’un sous-échantillon de poissons subadultes est prélevé, les poissons sont euthanasiés à l’aide de quantités appropriées de solution anesthésique (par exemple tricaïne méthanesulfonate, MS-222 (CAS.886-86-2), 100-500 mg/l) tamponnés avec 300 mg/l de NaHCO3 (bicarbonate de sodium, CAS.144-55-8)) destinées à réduire l’irritation de la membrane muqueuse. Si les poissons montrent des signes de souffrance considérable (i.e. sévères et que leur mort est prévisible) et que leur état est moribond, les animaux doivent être anesthésiés puis euthanasiés, et traités comme des cas de mortalité lors de l’analyse des données. Quand un poisson est euthanasié dans ce cas sévère, il faut le consigner dans le rapport d’essai. En fonction du moment de l’essai ou le poisson est euthanasié, il peut être retenu pour une analyse histopathologique, en fixant le spécimen préalablement à une analyse future.
Manipulation des œufs et des larves
Récolte des œufs des couples reproducteurs en vue de la reproduction de la génération suivante
36. Les œufs sont récoltés le premier jour (ou les deux premiers jours, si nécessaire) de la semaine d’essai 4 entre F0 et F1 et de la semaine d’essai 18 entre F1 et F2. La semaine d’essai 18 correspond à des poissons adultes F1 de 15 spf (semaines post-fécondation). Il importe que tous les œufs soient retirés de chaque cuve la veille de la récolte des œufs, afin que tous les œufs récoltés pour un couple reproducteur proviennent d’une seule et même ponte. Après la ponte, la femelle médaka transporte parfois ses œufs près de l’orifice anal en attendant de pouvoir les déposer sur un substrat. En l’absence de substrat dans la cuve, les œufs peuvent se trouver soient attachés à la femelle soit au fond de la cuve. Selon leur emplacement, ils seront prélevés avec précaution sur la femelle ou siphonnés depuis le fond de la cuve à la semaine d’essai 4 de F0 et la semaine d’essai 18 de F1. Tous les œufs récoltés au sein d’un traitement sont réunis avant d’être répartis dans les chambres d’incubation.
37. Les filaments qui maintiennent ensemble les œufs pondus doivent être retirés. Les œufs fécondés (jusqu’à 20 œufs) sont récoltés pour chaque couple reproducteur (1 couple par réplicat), regroupés par traitement et répartis de façon systématique dans les chambres d’incubation appropriées (appendices 6 et 7). Un bon microscope à dissection permet d’observer les marques du début de la fertilisation/du développement, telles que le gonflement de la membrane de fertilisation (chorion), la progression de la division cellulaire ou la formation de la blastula. Les chambres d’incubation peuvent être placées dans des «aquariums incubateurs» distincts pour chaque traitement (dans lesquels il faut alors mesurer les paramètres de qualité de l’eau et les concentrations de produit chimique d’essai) ou dans l’aquarium de réplicats qui contiendra les larves écloses (éleuthéroembryons, par exemple). Si un deuxième jour de récolte est nécessaire (23e jour d’essai), tous les œufs des deux jours doivent être réunis et répartis systématiquement entre les réplicats de traitement.
Élevage des œufs jusqu’à l’éclosion
38. Les œufs fécondés sont agités continuellement, par exemple par des bulles d’air dans l’incubateur, ou par agitation verticale de l’incubateur. Les décès d’œufs fécondés (embryons) sont observés et consignés quotidiennement. Les œufs morts sont retirés des incubateurs (appendice 9). Au 7e jour post-fécondation (jpf), l’agitation est stoppée ou réduite de telle sorte que les œufs fécondés se déposent au fond de l’incubateur. Cela favorise l’éclosion, généralement le jour ou les deux jours suivants. Pour chaque traitement et témoin, on compte les alevins (jeunes larves; éleuthéroembryons) (en regroupant les réplicats). Les œufs fécondés qui n’ont pas éclos au terme de deux fois le jour médian de l’éclosion chez les témoins (généralement à 16 ou 18 jpf) sont considérés comme non viables et écartés.
39. Douze alevins sont transférés dans chaque cuve de réplicat. Les alevins des chambres d’incubation sont réunis et répartis de façon systématique dans les cuves de réplicats (appendice 7). On peut à cet effet sélectionner de façon aléatoire un alevin du lot traité et ajouter séquentiellement un alevin par tirage en aveugle dans un aquarium pour réplicat. Chacune des cuves doit contenir un nombre égal (n=12) de larves écloses (au maximum 20 larves dans chaque cuve). S’il n’y a pas suffisamment d’alevins pour remplir tous les réplicats de traitements, il est recommandé de veiller à ce que le plus grand nombre de réplicats possible comportent 12 alevins. Les alevins peuvent être manipulés en toute sécurité au moyen de pipettes en verre de grand diamètre. Les alevins en surnombre sont euthanasiés au moyen d’un anesthésique. Durant les quelques semaines précédant la constitution des couples reproducteurs, le jour où est observée la première ponte doit être consigné pour chaque réplicat.
Constitution des couples reproducteurs
Prélèvement tissulaire et détermination du sexe génotypique
40. La détermination du sexe génotypique par prélèvement tissulaire au niveau d’une nageoire est réalisée à la spf 9-10 (c’est-à-dire la semaine d’essai 12-13 pour la génération F1). Tous les poissons d’une cuve sont anesthésiés (par des méthodes approuvées, IACUC, par exemple) et un petit échantillon de tissu est prélevé à l’extrémité dorsale ou ventrale de la nageoire caudale de chaque poisson, afin de déterminer le sexe génotypique de l’individu (29). Les poissons d’un réplicat peuvent être placés dans de petites cages, si possible avec un poisson par cage, dans la cuve réplicat. Il est également possible de placer deux poissons par cage s’ils présentent des signes distinctifs. On peut à cet effet pratiquer des coupes différentes lors du prélèvement au niveau de la nageoire caudale (l’une à l’extrémité dorsale et l’autre à l’extrémité ventrale, par exemple).
41. Le sexe génotypique du médaka est déterminé par un gène identifié et séquencé (dmy) situé sur le chromosome Y. La présence de dmy indique un individu XY, quel que soit le phénotype, et l’absence de dmy indique un individu XX, quel que soit le phénotype (30) (31). De l’acide désoxyribonucléique (ADN) est extrait de chaque prélèvement et la présence ou l’absence de dmy est établie par réaction en chaîne par polymérase (PCR) (voir l’appendice 9 du chapitre C.41 de la présente annexe ou les appendices 3 et 4 dans (29)).
Mise en place des couples reproducteurs
42. Les informations sur le sexe génotypique sont utilisées pour établir des couples reproducteurs XX-XY, indépendamment du phénotype externe, qui peut être altéré par l’exposition à un produit chimique d’essai. Le lendemain de la détermination du sexe génotypique de chaque poisson, deux poissons XX et deux poissons XY de chaque réplicat sont sélectionnés de façon aléatoire et deux couples XX-XY sont mis en place. Si un réplicat ne comporte pas deux poissons XX ou deux XY, il convient de trouver des poissons appropriés dans d’autres réplicats au sein du traitement. La priorité est d’avoir le nombre recommandé de réplicats de couples reproducteurs pour chaque traitement (12) et chez les témoins (24). Les poissons présentant des anomalies apparentes (problèmes de vessie natatoire, malformations spinales, tailles extrêmes, etc.) sont à écarter lors de la mise en place des couples reproducteurs. Lors de la phase de reproduction à la génération F1, chaque cuve réplicat doit contenir un seul couple reproducteur.
Prélèvement de subadultes et évaluation des effets mesurés
Prélèvement de couples non reproducteurs
43. Après la constitution des couples reproducteurs, les poissons non sélectionnés pour la reproduction sont euthanasiés, afin de mesurer les effets à la semaine d’essai 12-13 (F1). Il est extrêmement important de manipuler les poissons de telle sorte que le sexe génotypique déterminé pour la sélection des couples reproducteurs puisse encore être tracé pour chaque poisson. Toutes les données recueillies sont analysées dans le contexte du sexe génotypique de chaque individu. Chaque poisson est utilisé pour une série de mesures incluant: la détermination du taux de surviedes poissons juvéniles/subadultes (semaines d’essai 7-12/13 (F1)), la croissance en longueur (il est possible de mesurer la taille standard si la nageoire caudale a été raccourcie lors du prélèvement tissulaire visant à déterminer le sexe génétique; on mesurera la longueur totale si le prélèvement n’a porté que sur la partie dorsale ou ventrale de la nageoire caudale) et la masse corporelle (à savoir le poids frais, à sec), l’ARNm vtg (ou la VTG) hépatique et les papilles de la nageoire anale (voir les tableaux 1 et 2). Il faut noter que le poids et la longueur des couples reproducteurs sont également requis pour le calcul de la croissance moyenne au sein d’un groupe traité.
Prélèvement tissulaire et mesure de la vitellogénine
44. Le foie est extrait par dissection et stocké à ≤ -70 °C jusqu’à la mesure de l’ARNm vtg (ou de la VTG). La queue du poisson, y compris la nageoire anale, est conservée dans un fixateur approprié (de Davidson, par exemple) ou photographiée de telle sorte qu’il soit possible de compter plus tard les papilles de la nageoire anale. On peut si on le souhaite prélever également d’autres tissus (gonade, par exemple) et les conserver. La concentration de VTG hépatique doit être quantifiée par une technique ELISA homologue (voir les procédures recommandées pour médaka à l’appendice 6 du chapitre C.48 de la présente annexe). Une autre solution consiste à quantifier l’ARNm vtg, par extraction de l’ARNm du gène vtg I d’un prélèvement hépatique et quantification du nombre de copies du gène vtg I (par ng d’ARNm total), par PCR quantitative, selon les méthodes établies par l’U.S. EPA (29). Au lieu de déterminer le nombre de copies du gène vtg dans les groupes témoins et les groupes traités, une méthode plus économique en ressources et moins difficile du point de vue technique consiste à déterminer le changement relatif (facteur multiplicatif), dans l’expression du gène vtg I, entre groupe témoin et groupes traités.
Caractères sexuels secondaires
45. Dans des circonstances normales, seul le médaka mâle sexuellement mature présente des papilles, qui se développent sur les plaques de jonction de certains rayons de la nageoire anale et constituent un caractère sexuel secondaire pouvant servir de biomarqueur pour les effets perturbateurs endocriniens. La méthode de comptage des papilles de la nageoire anale (nombre de plaques de jonction présentant des papilles) est décrite à l’appendice 8. Le nombre de papilles de la nageoire anale par individu est en outre utilisé pour classer les individus comme phénotype externe mâle ou femelle et établir ainsi un sex-ratio simple pour chaque réplicat. Tout médaka présentant un nombre de papilles supérieur à 0 est défini comme mâle tout médaka présentant 0 papille au niveau de la nageoire anale est défini comme femelle.
Évaluation de la fécondité et de la fertilité
46. La fécondité et la fertilité sont évaluées lors des semaines 1 à 3 à la génération F0 et des semaines 15 à 17 à la génération F1. Les œufs de chaque couple reproducteur sont récoltés chaque jour pendant 21 jours consécutifs. Ils sont retirés avec précaution de sous le ventre des femelles (placées dans un filet) et/ou siphonnés du fond de l’aquarium tous les matins. La fécondité et la fertilité sont consignées chaque jour pour chaque couple réplicat. La fécondité est définie comme le nombre d’œufs pondus, et la fertilité est définie fonctionnellement comme le nombre d’œufs fécondés et viables au moment du comptage. Le comptage doit intervenir dès que possible après la récolte.
47. La fécondité des réplicats est consignée chaque jour, c’est le nombre d’œufs par couple reproducteur; l’analyse par les procédures statistiques recommandées porte sur les moyennes des réplicats. La fertilité des réplicats est la somme des nombres d’œufs fertiles produits par un couple reproducteur divisée par la somme des nombres d’œufs produits par ce couple. Statistiquement, la fertilité est analysée comme un taux par réplicat. Le taux d’éclosion des réplicats correspond au nombre d’alevins divisé par le nombre d’embryons chargés (20 généralement). Statistiquement, le taux d’éclosion est analysé comme un taux par réplicat.
Prélèvement d’adultes et évaluation des effets mesurés
Prélèvement de couples reproducteurs
48. Après la semaine d’essai 17 (c’est-à-dire après le démarrage réussi de la génération F2), les adultes F1 sont euthanasiés et divers effets sont évalués (voir tableaux 1 et 2). La nageoire anale est examinée pour évaluer les papilles (voir appendice 8), et/ou la queue est retirée au niveau immédiatement postérieur à l’orifice anal et fixée pour un comptage ultérieur des papilles. Une partie de la nageoire caudale peut être prélevée et archivée à ce moment-là pour vérification du sexe génétique (dmy), si on le souhaite. Il est possible de pratiquer si nécessaire un prélèvement tissulaire pour répéter la recherche du dmy et vérifier le sexe génétique de certains poissons. La cavité corporelle est ouverte pour qu’il soit possible de pratiquer une perfusion avec des fixateurs appropriés (de Davidson, par exemple) avant immersion du corps entier dans le fixateur. Cependant, si une étape de perméabilisation appropriée est réalisée avant la fixation, il n’est pas nécessaire d’ouvrir la cavité corporelle.
Histopathologie
49. Chaque poisson fait l’objet d’une évaluation histopathologique à la recherche de pathologies du tissu gonadique (29) (30). Comme on l’a vu au paragraphe 33, des effets mécanistiques évalués dans cet essai (VTG, CSS et certains effets histopathologiques gonadiques) peuvent être influencés par une toxicité systémique ou autre. L’évaluation histopathologique détaillée du foie et des reins peut donc aider à comprendre les réponses au niveau des effets mécanistiques mesurés. Cependant, si ces évaluations détaillées ne sont pas réalisées, les anomalies macroscopiques observées incidemment lors de l’évaluation histopathologique doivent être relevées et consignées dans le rapport. Une «lecture descendante», depuis le groupe le plus exposé (par rapport aux témoins) jusqu’au traitement sans effet, peut être envisagée; il est cependant recommandé de se reporter au document d’orientation sur l’histopathologie de l’EPA (29). En règle générale, les coupes histologiques de tous les prélèvements sont préparées avant d’être lues par le pathologiste. Si l’on utilise une «lecture descendante», il est noté que la procédure Rao-Scott Cochrane-Armitage by Slices (RSCABS) est fondée sur l’anticipation d’une augmentation de l’impact biologique (de la pathologie) lorsque les niveaux de dose augmentent. On perd donc de la puissance si l’on considère uniquement une dose élevée, sans aucune dose intermédiaire. Si une analyse statistique n’est pas nécessaire pour déterminer que la dose élevée est sans effet, cette approche peut être acceptable. Le phénotype gonadique découle également de cette évaluation.
Autres observations
50. L’essai MEOGRT fournit des données utilisables (par exemple dans une approche fondée sur l’analyse du poids de la preuve) pour évaluer simultanément au moins deux grands types de voies intervenant dans les effets indésirables (adverse outcome pathways, AOP) qui aboutissent à des effets sur la reproduction: (a) des voies à médiation endocrine impliquant une perturbation de l’axe endocrinien hypothalamo-hypophyso-gonadique (HHG); et (b) des voies se traduisant par une réduction de la survie, de la croissance (longueur et poids) et de la reproduction du fait d’une toxicité à médiation non endocrine. Des effets classiquement mesurés dans les essais de toxicité chronique tels que l’essai sur le cycle de vie complet et l’essai sur les premiers stades de la vie sont également inclus dans cet essai et peuvent être utilisés pour évaluer les dangers présentés à la fois par les modes d’action toxique à médiation non endocrine et les voies à médiation endocrine. Au cours de l’essai, il convient d’observer quotidiennement les comportements, et tout comportement inhabituel doit être noté. De plus, toute mortalité doit être notée et on calculera la survie jusqu’à la sélection des poissons (semaine d’essai 6/7), la survie après la sélection jusqu’au prélèvement subadulte (9-10 spf) et la survie depuis la constitution des couples jusqu’au prélèvement de poissons adultes.
Tableau 1
Effets mesurés dans l’essai MEOGRT
| Stade de la vie | Effet mesuré | Génération
| Embryon (2 spf) | Éclosion (% et délai d’éclosion) | F1, F2
| Juvénile (4 spf) | Survie | F1
| Subadulte (9 or10 spf) | Survie | F1
| Croissance (longueur et poids)
| Vitellogénine (ARNm ou protéine)
| Caractères sexuels secondaires (papilles de la nageoire anale)
| Sex-ratio externe
| Délai jusqu’à la 1re ponte
| Adulte (12-14 spf) | Reproduction (fécondité et fertilité) | F0, F1
| Adulte (15 spf) | Survie | F1
| Croissance (longueur et poids)
| Caractères sexuels secondaires (papilles de la nageoire anale)
| Histopathologie (gonade, foie, rein)
DÉROULEMENT CHRONOLOGIQUE
51. Le tableau 2 illustre le déroulement chronologique de l’essai. L’essai MEOGRT comprend 4 semaines d’exposition des adultes F0 et 15 semaines d’exposition de la génération F1, ainsi qu’une période d’exposition de la seconde génération (F2) jusqu’à l’éclosion (2 spf). L’appendice 9 récapitule les différentes étapes du début à la fin de l’essai MEOGRT.
Tableau 2
Chronologie de l’exposition et des effets mesurés au cours de l’essai MEOGRT
RÉSULATS ET RAPPORT
Analyse statistique
52. Le sexe génotypique étant déterminé pour tous les poissons de l’essai, les données doivent être analysées séparément pour chaque sexe génotypique (mâles XY et femelles XX). Le non-respect de cette exigence réduirait grandement la puissance statistique de l’analyse. Il est préférable d’effectuer ces analyses statistiques en suivant les procédures décrites dans le document de l’OCDE sur les méthodes actuelles d’analyse statistique des données d’écotoxicité (Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application (32). L’appendice 10 fournit des orientations pour l’analyse statistique.
53. La conception de l’essai et le choix des tests statistiques doivent assurer la puissance requise pour permettre de déceler les changements d’importance biologique concernant les effets pour lesquels une CSEO doit être établie (32). La consignation dans le rapport des concentrations et paramètres ayant un effet significatif peut dépendre du cadre réglementaire. Il convient d’identifier pour chaque effet mesuré quel pourcentage de changement il importe de détecter ou d’estimer. Le plan expérimental doit être adapté en conséquence. Il est peu probable que la même variation en pourcentage s’applique à tous les effets mesurés, et que l’on puisse concevoir une expérience réalisable qui remplisse ces critères pour tous les effets mesurés, aussi importe-t-il, lors de la conception de l’expérience, de se concentrer sur les effets qui sont importants pour cette dernière. On trouvera à l’appendice 10 un ordinogramme d’analyse statistique et des orientations destinés à faciliter le traitement des données et le choix des tests ou modèles statistiques les plus appropriés. D’autres méthodes statistiques peuvent être utilisées si elles sont scientifiquement fondées.
54. Il sera nécessaire d’analyser les variations au sein de chaque ensemble de réplicats en utilisant l’analyse de la variance ou des méthodes avec tableau de contingence, ainsi que des méthodes d’analyse statistique suffisantes et adaptées fondées sur cette analyse. Pour opérer des comparaisons multiples entre les résultats obtenus pour chaque concentration et ceux obtenus avec les témoins, une procédure descendante (test de Jonckheere-Terpstra, par exemple) est recommandée en cas de réponses continues. Si les données ne sont pas compatibles avec une relation concentration-réponse monotone, le test de Dunnett ou le test de Dunn sera utilisé (après transformation adéquate des données, si nécessaire).
55. Pour la fécondité, le décompte des œufs a lieu chaque jour, mais peut être analysé dans sa globalité ou comme une mesure répétée. L’appendice 10 précise comment analyser ces données. Pour les données histopathologiques exprimées sous la forme d’indices de gravité, un nouveau test statistique, le Rao-Scott Chochran-Armitage by Slices (RSCABS) a été développé (33).
56. Tout effet mesuré dans les groupes traités par le produit chimique qui diffère de façon significative de témoins appropriés doit être consigné dans le rapport.
Considérations relatives à l’analyse des données
Niveaux de traitement compromis
57. Plusieurs facteurs entrent en jeu pour déterminer si un réplicat ou l’intégralité d’un traitement présentent des signes d’une toxicité manifeste et s’il convient alors de les exclure de l’analyse. Une toxicité manifeste se caractérise par une mortalité supérieure à quatre individus dans un réplicat entre 3 spf et 9 spf, mortalité qui ne saurait être imputable à une erreur technique. Les autres signes de toxicité manifeste sont notamment les hémorragies, les comportements anormaux, les nages anormales, l’anorexie ainsi que tout autre signe clinique de maladie. Pour les signes sub-létaux de toxicité, des évaluations qualitatives peuvent être nécessaires et devraient toujours être réalisées en référence au groupe témoin pour l’eau de dilution (eau pure). Si une toxicité manifeste apparaît dans le(s) groupe(s) le(s) plus exposé(s), il est recommandé d’écarter ces traitements de l’analyse.
Témoins avec solvant
58. L’utilisation d’un solvant ne doit être envisagée qu’en dernier ressort, après avoir considéré toutes les autres options pour l’administration du produit chimique. Si un solvant est utilisé, il est impératif de mettre en place conjointement un témoin pour l’eau de dilution. A la clôture de l’essai, les effets potentiels du solvant font l’objet d’une comparaison. Pour cela, les résultats correspondant au groupe témoin avec solvant sont comparés à ceux du groupe témoin avec eau de dilution. Les relevés d’observation les plus pertinents dans ce cadre concernent les déterminants de la croissance (poids), qui peuvent être affectés en cas d’effets toxiques généralisés. Si des différences statistiquement significatives sont décelées pour ces paramètres entre le groupe témoin avec eau de dilution et le groupe témoin avec solvant, un avis d’expert doit permettre de déterminer si la validité de l’essai est compromise. Si les deux témoins diffèrent, les groupes exposés au produit chimique doivent être comparés au témoin avec solvant, sauf si l’on sait qu’il est préférable de les comparer au témoin avec eau de dilution. S’il n’existe pas de différence statistiquement significative entre les deux groupes témoins, il est recommandé de comparer les groupes exposés au produit chimique d’essai avec l’ensemble des deux groupes (témoin solvant et témoin eau de dilution), sauf si l’on sait qu’il est préférable de les comparer soit au groupe témoin avec eau de dilution soit au témoin avec solvant.
Rapport d’essai
59. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Produit chimique d’essai: nature physique et propriétés physico-chimiques pertinentes;
— Données d’identification chimique.
Substance mono-constituant:
— apparence physique, hydro-solubilité et autres propriétés physico-chimiques pertinentes;
— identification chimique, telle que désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc. (y compris la teneur en carbone organique, si cela se justifie).
Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:
— caractérisés autant que possible par l’identité chimique (voir ci-dessus), la teneur et les propriétés physico-chimiques pertinentes des constituants.
Espèce soumise à l’essai:
— Nom scientifique, souche (si possible), origine et méthode de collecte des œufs fécondés et de manipulation ultérieure.
Conditions d’essai:
— Photopériode(s);
— Conception de l’essai: dimensions des enceintes, matériel et volume d’eau, nombre d’enceintes d’essai et de réplicats, nombre d’alevins par réplicat, etc.;
— Méthode de préparation des solutions mère et fréquence de renouvellement (l’agent solubilisant et sa concentration doivent être indiqués le cas échéant);
— Méthode de dosage du produit chimique d’essai: pompes doseuses, systèmes de dilution, etc.;
— Efficacité de récupération de la méthode et concentrations d’essai nominales, limite de quantification, moyennes des valeurs mesurées avec leurs écarts-types dans les récipients d’essai, méthode analytique utilisée et données montrant que les mesures se réfèrent aux concentrations du produit chimique d’essai en solution vraie;
— Caractéristiques de l’eau de dilution: pH, dureté, température, concentration d’oxygène dissous, taux de chlore résiduel (si mesuré), carbone organique total (si mesuré), solides en suspension (si mesurés), salinité du milieu d’essai (si mesurée) et toute autre mesure effectuée;
— Concentrations d’essai nominales, moyennes des valeurs mesurées avec leurs écarts-types;
— Qualité de l’eau dans les récipients d’essai: pH, température (quotidiennement) et concentration d’oxygène dissous;
— Informations détaillées sur l’alimentation: types d’aliments, provenance, quantité distribuée et fréquence, etc.
Résultats:
— Données attestant que les témoins répondent à l’ensemble des critères de validité;
— Données relatives au groupe témoin (plus témoin avec solvant le cas échéant) et aux groupes traités: éclosion (taux et délai d’éclosion) pour F1 et F2, survie après éclosion pour F1, croissance (longueur et poids corporel) pour F1, sexe génotypique et différenciation sexuelle (par exemple caractères sexuels secondaires d’après les papilles de la nageoire anale et l’histologie gonadique) pour F1, sexe phénotypique pour F1, caractères sexuels secondaires (papilles de la nageoire anale) pour F1, ARNm de la vtg (ou protéine VTG) pour F1, évaluation histopathologique (gonade, foie et rein) pour F1 et reproduction (fécondité et fertilité) pour F0, F1; (voir les tableaux 1 et 2).
— Méthodes d’analyse statistique (analyse de régression ou analyse de la variance) et de traitement des données (tests et modèles statistiques utilisés);
— Concentration sans effet observé (CSEO) pour chacune des réponses évaluées;
— Concentration minimale avec effet observé (CMEO) pour chacune des réponses évaluées (à p=0.05); CEx pour chacune des réponses évaluées, le cas échéant, et intervalles de confiance (à 90 % ou 95 %), graphique du modèle ajusté utilisé pour calculer la CEx, pente de la courbe concentration-réponse, formule du modèle de régression, estimation des paramètres du modèle et de leurs erreurs-types
— Tout écart par rapport à la présente méthode d’essai et aux critères d’acceptation, et considérations relatives aux conséquences susceptibles d’en découler pour les résultats de l’essai.
60. En ce qui concerne les résultats de la mesure des effets, on présentera les valeurs moyennes et leurs écarts-types (par réplicat et par concentration, si possible).
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C.53 ESSAI DE CROISSANCE ET DE DÉVELOPPEMENT DE LARVES D’AMPHIBIENS (LAGDA)
INTRODUCTION
1. La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice (LD) 241 (2015) de l’OCDE. Le développement et la validation d’un essai capable de détecter et de caractériser les conséquences néfastes de l’exposition à des produits chimiques toxiques chez les amphibiens sont devenus nécessaires du fait des inquiétudes relatives à la présence dans l’environnement de produits chimiques dans des teneurs susceptibles de provoquer des effets néfastes sur les humains et la faune. La ligne directrice de l’OCDE pour l’essai de croissance et de développement de larves d’amphibiens (LAGDA) décrit un essai de toxicité mené sur une espèce d’amphibiens; cet essai (d’une durée de 16 semaines, en général) consiste à étudier la croissance et le développement des amphibiens depuis la fécondation jusqu’à la période juvénile précoce. Il permet d’évaluer le développement initial, la métamorphose, la survie, la croissance et la maturation partielle du système reproducteur. Il permet également de mesurer une série d’autres effets observés en vue d’une évaluation diagnostique des produits chimiques suspectés d’être des perturbateurs endocriniens, ou d’autres types de substances ayant des effets toxiques sur le développement et la reproduction. La méthode décrite ici est inspirée des travaux de validation menés sur le xénope lisse (Xenopus laevis) par l’Agence pour la protection de l’environnement des États-Unis (U.S. EPA) avec l’aide du Japon (1). D’autres espèces d’amphibiens peuvent convenir à un protocole d’essai sur la croissance et le développement à même de déterminer si le sexe génétique est un élément important, mais les méthodes et effets observés spécifiques décrits dans la présente méthode d’essai s’appliquent exclusivement à Xenopus laevis.
2. Le LAGDA est utilisé comme essai de niveau supérieur sur amphibien pour recueillir des informations plus complètes sur les relations concentration-réponse induisant des effets néfastes, informations qui servent ensuite pour l’identification et la caractérisation des dangers ainsi que pour l’évaluation du risque écologique. Le présent essai se positionne au niveau 4 du Cadre conceptuel de l’OCDE pour les essais et l’évaluation des perturbateurs endocriniens, sachant que les essais in vivo fournissent également des données sur les effets néfastes basées sur les effets mesurés pertinents du système endocrinien (2). Le plan expérimental général comprend l’exposition d’embryons de X. laevis au stade de développement 8-10 d’après Nieuwkoop et Faber (NF) (3) à un minimum de quatre concentrations différentes du produit chimique d’essai (généralement espacées par des intervalles définis selon une progression semi-logarithmique) et un/des témoin(s) jusqu’à 10 semaines après le délai médian jusqu’au stade NF62 dans le témoin, avec un sous-échantillon provisoire au stade NF62 (≤ 45 jours post-fécondation; habituellement autour de 45 jpf). Chaque concentration d’essai est testée sur quatre réplicats, avec huit réplicats pour le témoin. Les effets observés évalués au cours de l’exposition (dans le sous-échantillon provisoire et l’échantillon final à l’achèvement de l’essai) sont ceux qui constituent des indicateurs de toxicité générale, à savoir mortalité, comportement anormal et déterminants de la croissance (longueur et poids), ainsi que ceux conçus pour caractériser les mécanismes d’action des perturbateurs endocriniens ciblant les processus physiologiques faisant intervenir les œstrogènes, les androgènes et la thyroïde. La méthode décrite vise principalement à mettre en évidence des effets potentiels pertinents au niveau d’une population (à savoir des impacts indésirables sur la survie, le développement, la croissance et le développement du système reproducteur) afin de calculer une concentration sans effet observé (CSEO) ou une concentration efficace à × % (CEx) sur l’effet observé. Il convient de noter que les approches de type CEx sont rarement adaptées aux études de grande ampleur de ce type, où l’augmentation du nombre de concentrations d’essai en vue de déterminer la CEx souhaitée peut être impraticable. Il convient également de noter que cette méthode ne couvre pas la phase de reproduction proprement dite. Les définitions utilisées dans cette méthode d’essai sont données à l’appendice 1.
REMARQUES PRÉLIMINAIRES ET LIMITES
3. Étant donné le nombre limité de produits chimiques testés et le nombre limité de laboratoires impliqués dans l’étude de validation de cette méthode d’essai complexe, on peut s’attendre à ce que la ligne directrice 241 de l’OCDE soit réexaminée et si nécessaire mise à jour à la lumière de l’expérience acquise, et quand un nombre suffisant d’études sera disponible pour s’assurer de l’impact de cette méthode d’essai. Le LAGDA est un essai important qui permet d’étudier les facteurs pouvant contribuer à un déclin de la population d’amphibiens en évaluant les effets de l’exposition à des produits chimiques durant le stade larvaire, où les effets sur la survie et le développement, y compris le développement normal des organes reproducteurs, peuvent avoir des répercussions dommageables sur les populations.
4. Le test est conçu pour détecter des effets apicaux résultant de mécanismes endocriniens et non endocriniens, et comprend des paramètres diagnostiques mesurés qui sont, en partie, spécifiques aux principaux mécanismes endocriniens. Il convient de noter que, jusqu’à ce que le LAGDA soit développé, il n’existait aucun essai validé remplissant cette fonction pour les amphibiens.
5. Avant de commencer l’essai, il est important de disposer d’informations sur les propriétés physico-chimiques du produit chimique d’essai, notamment pour pouvoir produire des solutions chimiques stables. Il est également nécessaire de disposer une méthode d’analyse suffisamment sensible pour pouvoir vérifier les concentrations du produit chimique d’essai. L’essai dure 16 semaines environ et nécessite au total 480 animaux, à savoir des embryons de X. laevis, (ou 640 embryons en cas d’utilisation d’un témoin avec solvant) afin que l’essai soit suffisamment puissant pour évaluer les effets observés au niveau de la population (croissance, développement et maturation du système reproducteur, par exemple).
6. Avant d’utiliser la méthode d’essai pour tester un mélange à des fins réglementaires, il convient de vérifier si les résultats seront acceptables dans le cadre réglementaire imposé. En outre, cet essai n’évalue pas directement la fécondité, de sorte qu’il peut ne pas être applicable pour une utilisation à un stade plus avancé que le niveau 4 du Cadre conceptuel de l’OCDE pour les essais et l’évaluation des perturbateurs endocriniens.
FONDEMENT SCIENTIFIQUE DE LA MÉTHODE D’ESSAI
7. Une grande partie des connaissances dont nous disposons sur la biologie des amphibiens ont été obtenues à l’aide de l’espèce de laboratoire modèle X. laevis. Cette espèce peut être cultivée en routine au laboratoire, l’ovulation peut être induite par l’emploi de gonadotrophine chorionique humaine (hCG), et il est possible de se procurer facilement des animaux auprès des fournisseurs commerciaux.
8. Comme chez tous les vertébrés, la reproduction des amphibiens est contrôlée par l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HHG) (4). Les œstrogènes et les androgènes sont des médiateurs de ce système endocrinien; ils contrôlent le développement et la physiologie des tissus sexuellement dimorphiques. Le cycle de vie des amphibiens se décompose en trois phases successives durant lesquelles cet axe est particulièrement actif: (1) la différenciation gonadique pendant le développement larvaire, (2) le développement des caractères sexuels secondaires et la maturation des gonades pendant la phase juvénile et (3) la reproduction fonctionnelle des adultes. À chacune de ces trois phases de développement, le système endocrinien est susceptible d’être perturbé par certains produits chimiques (œstrogènes et androgènes, par exemple), ce qui finira par entraîner une diminution de la capacité de reproduction des organismes.
9. Les gonades commencent à se développer au stade NF 43 d’après Nieuwkoop et Faber, au moment de la formation de la crête génitale bipotentielle. La différenciation des gonades commence au stade NF 52 lorsque les cellules germinales primordiales migrent vers le tissu médullaire (mâles) ou bien restent dans la région corticale (femelles) des gonades en développement (3). Ce processus de différenciation sexuelle des gonades a été signalé pour la première fois comme sensible à l’action des produits chimiques chez Xenopus laevis dans les années 1950 (5) (6). L’exposition de têtards à l’œstradiol durant cette période de différenciation gonadique provoque un changement de sexe chez les mâles, qui deviennent des femelles pleinement fonctionnelles une fois parvenus à l’âge adulte (7) (8). L’inversion fonctionnelle du sexe des femelles en mâles est également possible et a été rapportée après l’implantation de tissu testiculaire sur des têtards (9). Cependant, si l’exposition à un inhibiteur de l’aromatase entraîne égalementun changement de sexe fonctionnel chez X. tropicalis (10), cet effet n’a pas été constaté chez X. laevis. Historiquement, les effets de produits toxiques sur la différenciation gonadique étaient évalués par l’examen histologique des gonades au moment de la métamorphose, et le changement de sexe ne pouvait être déterminé que par l’analyse des sex-ratios génotypiques/phénotypiques. Jusqu’à une date récente, il n’existait aucun moyen de déterminer directement le sexe génétique de Xenopus. Cependant, la création récente de marqueurs sexuels chez X. laevis permet de déterminer le sexe génétique et d’identifier directement les animaux dont le sexe a changé (11).
10. Les mâles juvéniles se développent au fur et à mesure de l’augmentation des taux sanguins de testostérone correspondant au développement des caractères sexuels secondaires et des testicules. Chez les femelles, l’œstradiol est produit par les ovaires, ce qui entraîne l’apparition de vitellogénine (VTG) dans le plasma et d’ovocytes vitellogéniques dans l’ovaire, ainsi que le développement des oviductes (12). Les oviductes sont des caractères sexuels secondaires féminins qui interviennent dans la maturation des ovocytes pendant la reproduction. Les ovocytes s’entourent d’une gangue gélatineuse lorsqu’ils transitent par l’oviducte et s’accumulent dans l’ovisac, prêts à être fécondés. Le développement de l’oviducte semble être régulé par les œstrogènes, puisqu’il est corrélé aux taux sanguins d’œstradiol chez X. laevis (13) et X. tropicalis (12). Le développement d’oviductes chez les mâles exposés à des biphényles polychlorés (14) et au 4-tert-octylphénol (15) a été signalé.
PRINCIPE DE L’ESSAI
11. La conception de l’essai implique d’exposer par voie aquatique des embryons de X. laevis au stade NF 8-10 à quatre concentrations différentes du produit chimique d’essai et un/des témoin(s) jusqu’à 10 semaines après le délai médian jusqu’au stade NF62 dans le témoin, avec un sous-échantillon intermédiaire au stade NF62. S’il est aussi envisageable d’administrer des produits chimiques hautement hydrophobes via l’alimentation, cette voie d’exposition n’a guère été explorée dans cet essai jusqu’à présent. Chaque concentration d’essai est testée sur quatre réplicats, avec huit réplicats pour chaque témoin. Les effets observés évalués au cours de l’exposition sont ceux qui constituent des indicateurs de toxicité générale (mortalité, comportement anormal et déterminants de la croissance (longueur et poids)) ainsi que ceux conçus pour caractériser les mécanismes d’action des perturbateurs endocriniens ciblant les processus physiologiques faisant intervenir les œstrogènes, les androgènes et la thyroïde (histopathologie de la thyroïde, histopathologie des gonades et du conduit gonadique, développement anormal, vitellogénine plasmatique (optionnel) et sex-ratios génotypiques/phénotypiques).
CRITÈRES DE VALIDITÉ DE L’ESSAI
12. Les critères suivants s’appliquent pour la validité de l’essai:
— La concentration d’oxygène dissous est ≥ 40 % de la valeur de saturation en air tout au long de l’essai;
— La température de l’eau est de 21 ± 1 °C et les différentiels inter-réplicat et inter-traitement n’excèdent pas 1,0 °C;
— Le pH de la solution d’essai demeure entre 6,5 et 8,5, et les différentiels inter-réplicat et inter-traitement n’excèdent pas 0,5;
— Les données disponibles démontrent que la concentration du produit chimique d’essai en solution a été correctement maintenue dans un intervalle de ± 20 % autour des valeurs moyennes mesurées;
— La mortalité au cours de la période d’exposition est ≤ 20 % dans chaque réplicat en ce qui concerne les témoins;
— La viabilité est ≥ 70 % dans le frai choisi pour commencer l’étude;
— Le délai médian jusqu’au stade NF62 dans le témoin est ≤ 45 jours;
— Le poids moyen des organismes d’essai au stade NF62 et à la fin de l’essai dans les témoins et les témoins avec solvant (si un solvant est utilisé) atteint 1,0 ± 0,2 et 11,5 ± 3 g, respectivement.
13. Bien qu’il ne s’agisse pas d’un critère de validité, il est recommandé de disposer pour l’analyse d’au moins trois niveaux de traitement avec trois réplicats non compromis. Une mortalité excessive, ce qui compromet un traitement, est définie comme plus de 4 décès (> 20 %) ne pouvant pas s’expliquer par une erreur technique dans au moins deux réplicats. Au moins trois niveaux de traitement exempts de toxicité manifeste sont nécessaires pour effectuer les analyses. Les signes de toxicité manifeste peuvent comprendre, sans s’y limiter, des animaux flottant à la surface, immobiles au fond du vivier, une nage inversée ou irrégulière, un manque d’activité à la surface et l’absence de réponse au stimulus, des anomalies morphologiques (difformité des membres, par exemple), des lésions hémorragiques et des œdèmes abdominaux.
14. Si un écart par rapport aux critères de validité de l’essai est observé, les conséquences doivent être appréciées au regard de la fiabilité des résultats de l’essai et ces écarts et leur appréciation doivent être consignés dans le rapport d’essai.
DESCRIPTION DE LA MÉTHODE
Appareillage
15. On utilise du matériel courant de laboratoire et en particulier:
(a) appareil de contrôle de la température (dispositifs de chauffage et de refroidissement réglables à 21 ± 1 °C, par exemple);
(b) thermomètre;
(c) microscope binoculaire à dissection et instruments de dissection;
(d) caméra numérique dotée d’une résolution minimale de 4 mégapixels et d’une fonction micro (si nécessaire);
(e) balance analytique d’une précision de 0,001 mg ou 1 μg;
(f) appareil de mesure de l’oxygène dissous et pH-mètre;
(g) appareil de mesure de l’intensité lumineuse capable de fournir des résultats en lux.
Eau
Source et qualité
16. Toute eau de dilution disponible localement ( eau de source ou eau du robinet filtrée sur charbon, par exemple) et permettant la croissance et le développement normaux de X. laevis peut être employée, et des informations concrètes attestant de cette capacité doivent être disponibles. Dans la mesure où la qualité de l’eau est susceptible de varier de façon importante d’une zone à l’autre, elle est évaluée, en particulier en l’absence de données historiques concernant l’usage de cette eau pour élever des larves d’amphibiens. Le dosage des métaux lourds (Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni, par exemple), des principaux anions et cations (Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO42-, par exemple), des pesticides, du carbone organique total et des solides en suspension doit être effectué avant le lancement de l’essai et/ou tous les six mois, par exemple, pour une eau de dilution connue pour être de qualité relativement constante. Certaines caractéristiques chimiques pour une eau de dilution acceptable sont énumérées à l’appendice 2.
Concentration d’iode dans l’eau employée pour l’essai
17. Pour que la glande thyroïde puisse synthétiser les hormones qui favoriseront une métamorphose normale, les larves doivent disposer de quantités suffisantes d’iode, provenant d’une combinaison de sources aqueuses et alimentaires. Il n’existe aujourd’hui aucune recommandation d’origine empirique concernant les concentrations d’iode minimales dans la nourriture ou l’eau nécessaires pour assurer un bon développement. Cependant, la disponibilité de l’iode est susceptible d’affecter la capacité de réponse du système thyroïdien aux agents actifs sur la thyroïde, un facteur par ailleurs connu pour influencer l’activité basale de cette glande: ce point mérite d’être pris en compte lors de l’interprétation des résultats d’histopathologie de la thyroïde. D’après des travaux précédents, la réussite de l’essai a été démontrée lorsque les concentrations d’iode dans l’eau de dilution (I-) sont comprises entre 0,5 et 10 μg/l. Idéalement, la concentration minimale d’iode dans l’eau de dilution au cours de l’essai doit être de 0,5 μg/l (ajouté sous forme de sodium ou de sel de potassium). Lorsque l’essai est mené avec de l’eau désionisée, un supplément d’iode est nécessaire afin d’atteindre cette concentration minimale de 0,5 μg/l. Les concentrations mesurées d’iode dans l’eau de l’essai (eau de dilution) et l’ajout d’iode ou d’autres sels (en cas d’utilisation) à l’eau de l’essai sont notifiés dans le rapport. La teneur en iode peut aussi être mesurée dans la nourriture, en plus de l’eau de l’essai.
Système d’exposition
18. L’essai a été développé en utilisant un système de dilution dynamique est employé pour cet essai. Les composants du système sont constitués d’un matériau adapté au contact avec l’eau, comme le verre, l’acier inoxydable ou d’autres matériaux chimiquement inertes. Les viviers d’exposition sont constitués d’aquariums de verre ou d’acier inoxydable, le volume utilisable étant compris entre 4,0 et 10,0 l (profondeur minimum de l’eau de 10 à 15 cm). Le système doit être capable de prendre en charge l’ensemble des concentrations d’exposition, un témoin seul et un témoin avec solvant, si nécessaire, chaque concentration d’essai étant testée sur quatre réplicats, avec huit réplicats pour les témoins. La vitesse d’écoulement de chaque récipient est constante afin de garantir la stabilité des conditions biologiques et de l’exposition chimique. Il est recommandé de maintenir dans les viviers un débit approprié (minimum cinq renouvellements par jour, par exemple) afin d’éviter une baisse de la concentration de produit chimique du fait du métabolisme des organismes d’essai et des microorganismes aquatiques présents dans les aquariums, des voies de dégradation abiotiques (hydrolyse, photolyse) ou de la dissipation (volatilisation, sorption). Les viviers sont disposés de manière aléatoire au sein du système d’exposition, de manière à amoindrir les effets éventuellement liés à la position, notamment de légères variations de température, d’intensité lumineuse, etc. On trouvera des informations complémentaires concernant la mise en place de systèmes d’exposition dynamiques dans le guide de l’ASTM intitulé Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians (16).
Introduction des produits chimiques: préparation des solutions d’essai
19. Pour préparer les solutions d’essai dans le système d’exposition, il convient d’introduire dans le système une solution-mère du produit chimique d’essai à l’aide d’une pompe appropriée ou d’un autre appareil. Le débit de la solution-mère doit être calibré d’après les données analytiques relatives aux solutions d’essai établies avant le début de l’exposition, et faire l’objet d’un contrôle volumétrique périodique au cours de l’essai. La solution d’essai de chaque vivier doit être renouvelée à raison de cinq renouvellements en volume/jour au minimum.
20. La méthode employée pour introduire le produit chimique d’essai dans le système varie en fonction des propriétés physico-chimiques du produit concerné. Par conséquent, avant la mise en œuvre de ce protocole, il convient de collecter les informations de référence sur le produit chimique en question pour déterminer sa testabilité. En ce qui concerne les propriétés du produit chimique d’essai, les informations suivantes sont utiles: formule structurale, poids moléculaire, pureté, stabilité dans l’eau et à la lumière, pKa et Ko/e, hydrosolubilité (de préférence dans le milieu d’essai) et pression de vapeur, ainsi que résultats d’un essai de biodégradabilité facile [méthode d’essai C.4 (17) ou C.29 (18)]. On peut utiliser la solubilité et la pression de vapeur pour calculer la constante de Henry, qui indique les risques de perte par évaporation du produit chimique d’essai. La conduite de cet essai sans les informations énumérées ci-dessus doit être envisagée avec prudence sachant que la conception de l’essai sera fonction des propriétés physico-chimiques du produit chimique d’essai et que, sans ces données, les résultats de l’essai peuvent se révéler difficiles à interpréter voire dénués de sens. Pour déterminer la concentration du produit chimique d’essai dans les solutions d’essai, il convient d’appliquer une méthode d’analyse fiable, dont la précision et la limite de détection sont connues et mentionnées dans le rapport. Les composés hydrosolubles peuvent être mis en solution en aliquotes dans l’eau utilisée pour l’essai à des concentrations aboutissant à la teneur voulue dans le cadre d’une introduction au moyen d’un système dynamique. Les produits chimiques qui sont liquides ou solides à température ambiante et modérément hydrosolubles peuvent nécessiter des saturateurs liquide: liquide ou liquide:solide (colonne de laine de verre, par exemple) (19). Même s’il est également possible d’administrer des substances d’essai très hydrophobes par le biais de l’alimentation, cette voie d’exposition n’a guère été explorée jusqu’à présent dans cet essai.
21. Les solutions testées de concentrations choisies sont préparées par dilution d’une solution mère. La solution mère est préparée de préférence en mélangeant simplement ou en agitant le produit chimique d’essai dans de l’eau de dilution par des moyens mécaniques (e.g. par agitation ou par ultrasons). Des colonnes ou des systèmes de saturation ou des méthodes de dosage passif (20) peuvent être utilisées pour obtenir une solution mère suffisamment concentrée. Les systèmes dépourvus de véhicules sont préférables; cependant les différents produits chimiques testés possèdent des propriétés physico-chimiques variables, qui réclament des approches diverses pour la préparation des solutions aqueuses servant à l’exposition chimique. On s’efforcera dans toute la mesure du possible d’éviter l’emploi de solvants et autres véhicules car: (1) certains solvants peuvent avoir eux-mêmes des effets toxiques et/ou induire des réponses indésirables ou inattendues, (2) l’essai de produits chimiques à une concentration supérieure à leur solubilité dans l’eau (ce qui arrive fréquemment si des solvants sont utilisés) peut fausser la détermination des concentrations efficaces, (3) le recours aux solvants dans les essais à long terme peut se traduire par la formation importante de biofilms associés à une activité microbienne, ce qui peut influer sur les conditions environnementales et sur la capacité de maintenir les concentrations d’exposition, (4) en l’absence de données historiques démontrant que le solvant n’influe pas sur les résultats de l’étude, l’usage de solvants nécessite le traitement d’un groupe témoin avec solvant, ce qui a des effets significatifs en termes de bien-être animal, des animaux supplémentaires étant alors nécessaires pour la conduite de l’essai. Pour les produits chimiques difficiles à tester, un solvant peut être employé en dernier ressort, et l’on consultera alors le document d’orientation de l’OCDE sur les essais de toxicité aquatique des substances et mélanges «difficiles» (21) afin de déterminer la meilleure méthode à employer. Le solvant sera choisi en fonction des propriétés chimiques du produit chimique d’essai et de la disponibilité de données des témoins historiques sur le solvant. En l’absence de données historiques, il est nécessaire de déterminer la pertinence du solvant avant de procéder à l’étude définitive. Si le recours à un solvant est inévitable et si une activité microbienne (formation de biofilms) se produit, il est recommandé de noter/consigner dans le rapport la présence de biofilms dans chaque vivier (au moins une fois par semaine) pendant toute la durée de l’essai. Idéalement, la concentration de solvant devra être maintenue constante dans le témoin avec solvant et tous les groupes traités. Si la concentration de solvant n’est pas maintenue constante, c’est la plus forte concentration de solvant dans le traitement d’essai qui sera utilisée dans le témoin avec solvant. Si un solvant est utilisé comme véhicule, les concentrations maximales de solvant ne devront pas dépasser 100 μl/l ou 100 mg/l (21), et il est recommandé de maintenir la concentration de solvant aussi bas que possible (20 μl/l, par exemple) pour éviter que le solvant puisse avoir une incidence sur les effets mesurés (22).
Animaux d’essai
Espèces d’essai
22. L’espèce d’essai X. laevis est utilisée, car il s’agit d’une espèce: (1) élevée couramment dans les laboratoires du monde entier, (2) aisément accessible auprès de fournisseurs commerciaux et (3) dont le sexe génétique peut être déterminé.
Soin et reproduction des adultes
23. Les méthodes de soin et de reproduction adaptées à X. laevis sont décrites dans un guide de l’ASTM (23). Les conditions d’encagement de X. laevis et les méthodes de soin adaptées à cette espèce sont également décrites par Read (24). Pour provoquer la reproduction, entre trois et cinq paires d’adultes mâles et femelles reçoivent uneinjection intrapéritonéale de gonadotropine chorionique humaine (hCG). La dose injectée aux femelles et aux mâles s’élève respectivement à environ 800 UI – 1 000 UI et 500 UI – 800 UI de hCG dissous dans une solution saline à 0,6 – 0,9 % (ou une solution de Ringer isotonique saline applicable aux amphibiens). Les volumes injectés sont équivalents à environ 10 μl/g de poids corporel (~1 000 μl). Ensuite, les couples de reproducteurs sont placés dans de grands viviers, à l’abri des perturbations et dans des conditions statiques, en vue de stimuler l’amplexus. Chaque vivier de reproduction est équipé d’une grille en acier inoxydable en guise de faux plancher (ouvertures de 1,25 cm, par exemple), permettant aux amas d’œufs de tomber dans un double fond. Si les grenouilles reçoivent une injection de hCG en fin d’après-midi, elles déposent habituellement la majorité de leurs œufs vers le milieu de la matinée suivante. Lorsqu’une quantité suffisante d’œufs ont été libérés et fécondés, il convient de retirer les adultes des viviers de reproduction. Les œufs sont alors collectés, et la gangue gélatineuse est éliminée par traitement à la L-cystéine (23). Une solution de L-cystéine à 2 % est préparée, et le pH est ajusté à 8.1 avec du NaOH 1 M. Cette solution à 21 °C est versée dans un flacon Erlenmeyer de 500 ml contenant les œufs d’un seul frai, brassée délicatement pendant une à deux minutes, puis rincée soigneusement 6 à 8 fois avec de l’eau de culture à 21 °C. Les œufs sont ensuite transférés dans un cristallisoir, et leur viabilité est déterminée: elle doit être > 70 % et les embryons en phase de division cellulaire doivent présenter des anomalies minimes.
CONCEPTION DE L’ESSAI
Concentrations d’essai
24. Il est recommandé d’utiliser un minimum de quatre concentrations du produit chimique d’essai et des témoins appropriés (comprenant, si nécessaire, des témoins avec solvant). En règle générale, il est recommandé d’espacer les concentrations d’un facteur ne dépassant pas 3.2.
25. Pour les besoins de cet essai, on s’appuiera autant que possible sur les résultats d’études existantes sur les amphibiens pour déterminer la concentration d’essai la plus élevée, de manière à éviter des concentrations manifestement toxiques. Les informations fournies, par exemple, par les relations quantitatives structure-activité, les références croisées et les données d’études existantes sur les amphibiens telles que l’essai de métamorphose des amphibiens, la méthode d’essai C.38 (25) et le guide de l’ASTM Frog Embryo Teratogenesis Assay - Xenopus (23) et/ou les résultats d’essais sur les poissons [méthodes d’essai C.48, C.41 et C.49] (26) (27) (28) peuvent contribuer à la définition de cette concentration. Avant le lancement du LAGDA, une expérience préliminaire de détermination des gammes de concentration pourra être menée. Il est recommandé de commencer cette expérience dans les 24 heures qui suivent la fécondation et de maintenir l’exposition pendant 7-14 jours (ou plus, si nécessaire), ainsi que de fixer les concentrations d’essai de telle sorte qu’elles soient espacées par un facteur de 10. La gamme de concentrations ainsi obtenue servira à fixer la concentration d’essai maximale dans le LAGDA. On notera que si un solvant doit être utilisé, la pertinence de celui-ci (la question étant de savoir si ce solvant peut influer sur le résultat de l’étude) pourra être déterminée dans le cadre de la détermination de la gamme de concentrations.
Réplicats au sein des groupes traités et des témoins
26. Un minimum de quatre réplicats par concentration d’essai et un minimum de huit réplicats pour les témoins (et le témoin avec solvant, si nécessaire) sont utilisés (ce qui signifie que le nombre de réplicats dans le témoin et l’éventuel témoin avec solvant doit être deux fois supérieur au nombre de réplicats dans chaque groupe traité, pour que l’essai ait une puissance statistique appropriée). Chaque réplicat doit contenir au maximum 20 animaux. Au minimum 15 animaux sont traités (cinq pour le sous-échantillon au stade NF62 et 10 juvéniles). Toutefois, des animaux supplémentaires seront ajoutés dans chaque réplicat pour maintenir le nombre critique de 15 en cas de décès.
PROCÉDURE
Synthèse de l’essai
27. L’essai commence avec des embryons nouvellement frayés (stade NF 8-10) et se poursuit jusqu’au développement des juvéniles. Les animaux sont examinés chaque jour afin de constater d’éventuels décès ou signes de comportement anormal. Au stade NF62, un sous-échantillon de larves (jusqu’à cinq animaux par réplicat) est collecté et la présence de divers effets est recherchée (tableau 1). Une fois que tous les animaux ont atteint le stade NF 66, c’est-à-dire à la fin de leur métamorphose (ou 70 jours après le début de l’essai, selon la première éventualité), une sélection est effectuée au hasard (mais sans sous-échantillonnage) afin de réduire le nombre d’animaux (10 par vivier) (voir paragraphe 43) et l’exposition des animaux restants se poursuit jusqu’à 10 semaines après le délai médian jusqu’au stade NF62 dans le témoin. À la fin de l’essai, les échantillons de juvéniles font l’objet de mesures supplémentaires (tableau 1).
Conditions d’exposition
28. Un résumé complet des paramètres d’essai est présenté à l’appendice 3. Au cours de la période d’exposition, l’oxygène dissous, la température et le pH des solutions d’essai sont mesurés quotidiennement. La conductivité, l’alcalinité et la dureté sont mesurées une fois par mois. En ce qui concerne la température de l’eau des solutions d’essai, les différentiels inter-réplicat et inter-traitement (sur une journée) ne doivent pas dépasser 1,0 °C. De même, en ce qui concerne le pH des solutions d’essai, les différentiels inter-réplicat et inter-traitement ne doivent pas dépasser 0,5.
29. On pourra siphonner quotidiennement les cuves d’exposition pour éliminer les aliments non consommés et des déchets, en veillant à éviter la contamination croisée des cuves. Il convient d’être attentif à stresser et perturber le moins possible les animaux, en particulier pendant les déplacements, le nettoyage des aquariums et la manipulation. Toute activité ou condition stressante devra être évitée, notamment les bruits forts et/ou constants, les vibrations et les coups au niveau des aquariums.
Durée d’exposition au produit chimique d’essai
30. L’exposition commence avec des embryons nouvellement frayés (stade NF 8-10) et se poursuit jusqu’à dix semaines après le délai médian jusqu’au stade NF62 (≤ 45 jours après le lancement de l’essai) dans le groupe témoin. En règle générale, la durée du LAGDA est de 16 semaines (17 semaines maximum).
Lancement de l’essai
31. On aura démontré précédemment que les parents utilisés pour le lancement de l’essai peuvent avoir une descendance génétiquement sexuée (appendice 5). Après le frai des adultes, les embryons sont collectés, traités à la cystéine pour éliminer la gangue gélatineuse et sélectionnés en fonction de leur viabilité (23). Le traitement à la cystéine permet de manipuler les embryons sans que ces derniers collent aux surfaces. La sélection se fait sous un microscope à dissection, en utilisant un compte-gouttes de taille appropriée pour éliminer les embryons non viables. Il est préférable d’utiliser pour l’essai un seul frai donnant une viabilité supérieure à 70 %. Les embryons au stade NF 8-10 sont répartis de façon aléatoire dans les cuves de traitement contenant un volume approprié d’eau de dilution jusqu’à ce que chaque cuve contienne 20 embryons. Il convient de manipuler les embryons avec précaution durant le transfert afin de minimiser leur stress et d’éviter de les blesser. Quatre-vingt-seize (96) heures après la fécondation, les têtards doivent être remontés le long de la colonne d’eau et avoir commencé à s’accrocher aux parois de la cuve.
Régime alimentaire
32. Le régime et la fréquence d’alimentation évoluent en fonction des stades de développement de X. laevis et représentent un aspect très important du protocole LAGDA. Ainsi, une alimentation excessive au cours de la phase larvaire se traduit généralement par une augmentation des cas de scoliose et de leur gravité (appendice 8) et doit donc être évitée. À l’inverse, une alimentation insuffisante au cours de la phase larvaire se traduit par des rythmes de développement très variables parmi les témoins, ce qui risque de compromettre la puissance statistique de l’essai ou d’induire des facteurs de confusion pouvant affecter les résultats de l’essai. L’appendice 4 présente le régime alimentaire recommandé pour les larves et les juvéniles de X. laevis dans des conditions d’essai dynamique, mais d’autres solutions sont autorisées tant que les organismes d’essai grandissent et se développent de manière satisfaisante. Il importe de noter que s’il s’agit de mesurer les effets sur le système endocrinien, les aliments doivent être exempts de substances actives sur le système endocrinien comme la farine de soja.
Alimentation des larves
33. Le régime alimentaire recommandé pour les larves est constitué de nourriture de départ pour truites, de disques de spiruline et de flocons pour poissons rouges (flocons TetraFin®, Tetra, Allemagne, par exemple) mélangés ensemble dans l’eau de culture (ou de dilution). Ce mélange est administré trois fois par jour en semaine et une fois par jour le week-end. Les têtards sont également nourris avec des nauplii de 24 heures d’artémies vivantes, (Artemia spp.), deux fois par jour en semaine et une fois par jour le week-end à compter du huitième jour post-fécondation. L’alimentation des larves, qui doit être conforme dans chaque cuve d’essai, doit permettre la croissance et le développement appropriés des animaux d’essai afin d’assurer la reproductibilité et la transférabilité des résultats d’analyse: (1) le délai médian jusqu’au stade NF62 dans les témoins doit être ≤ 45 jours et (2) un poids moyen de 1,0 ± 0,2 g au stade NF62 dans les témoins est recommandé.
Alimentation des juvéniles
34. Une fois la métamorphose achevée, le régime alimentaire se compose de nourriture de premier choix pour amphibiens de type 3/32 pouces (Xenopus Express, FL, États-Unis) (appendice 4). Pour les jeunes grenouilles (juvéniles précoces), broyer brièvement les granulés dans un moulin à café ou un mixeur ou bien écrasés dans un mortier avec un pilon afin de réduire leur taille. Une fois que les juvéniles sont assez grands pour consommer des granulés entiers, le broyage / l’écrasement ne sont plus nécessaires. Les animaux sont nourris une fois par jour. L’alimentation des juvéniles doit permettre la croissance et le développement appropriés des organismes: un poids moyen de 11,5 ± 3 g dans les témoins à la fin de l’essai est recommandé.
Analyse chimique
35. Avant le lancement de l’essai, la stabilité du produit chimique d’essai (sa solubilité, sa dégradabilité et sa volatilité, par exemple) et toutes les méthodes analytiques nécessaires sont établies d’après les données et connaissances existantes, par exemple. En cas d’administration des doses via l’eau de dilution, il est également conseillé d’analyser les solutions d’essai provenant de chaque cuve de réplicat afin de vérifier les performances du système, avant de lancer l’essai. Pendant l’essai, le dosage des concentrations du produit chimique d’essai est effectué à intervalles réguliers, de préférence chaque semaine pour au moins un réplicat au sein de chaque groupe traité, avec une rotation des réplicats au sein du même groupe traité chaque semaine. Il est recommandé de baser les résultats sur les concentrations mesurées. Toutefois, si la concentration du produit chimique d’essai en solution a été correctement maintenue tout au long de l’essai dans un intervalle de ± 20 % autour de la concentration nominale, les résultats peuvent être calculés à partir des valeurs nominales ou mesurées. De même, le coefficient de variation (CV) des concentrations tout au long de l’essai dans un traitement doit être maintenu à 20 % maximum pour chaque concentration. Lorsque les concentrations mesurées ne sont pas maintenues dans un intervalle de 80-120 % de la concentration nominale (si l’essai porte sur des produits chimiques facilement biodégradables ou hautement adsorbants, par exemple), les concentrations avec effet doivent être dosées et exprimées par rapport à la moyenne arithmétique des concentrations dans le cas des essais dynamiques.
36. Les débits d’eau de dilution et de solution-mère sont vérifiés à intervalles adéquats (trois fois par semaine, par exemple) pendant toute la durée de l’exposition. Si les produits chimiques se révèlent indétectables à certaines, voire toutes les concentrations nominales, (en raison de leur dégradation rapide ou de leur adsorption dans les cuves d’essai, ou bien d’une accumulation importante de produit chimique dans l’organisme des animaux exposés, par exemple), il est recommandé d’adapter le taux de renouvellement de la solution d’essai dans chaque cuve afin que les concentrations d’essai restent aussi constantes que possible.
Observations et effets mesurés
37. Les effets mesurés au cours de l’exposition correspondent aux indicateurs de toxicité suivants: mortalité, comportement anormal et notamment signes cliniques de maladie et/ou de toxicité générale, et déterminants de la croissance (longueur et poids), ainsi qu’effets pathologiques dus à la fois à une toxicité générale et à des mécanismes d’action des perturbateurs endocriniens ciblant les processus physiologiques faisant intervenir les œstrogènes, les androgènes et la thyroïde. En outre, la concentration plasmatique de VTG peut être mesurée à la fin de l’essai (optionnel). Le dosage de la VTG peut être utile pour comprendre les résultats de l’étude relatifs aux mécanismes endocriniens des produits chimiques suspectés d’être des perturbateurs endocriniens. Les effets mesurés et le calendrier des mesures sont résumés au tableau 1.
Tableau 1
Vue d’ensemble des effets mesurés lors du LAGDA
| Effets mesurés | Quotidiennement | Échantillons intermédiaires (échantillons larvaires) | Fin de l’essai (échantillons de juvéniles)
| Mortalité et comportement anormal | X | |
| Délai jusqu’au stade NF62 | | X |
| Histo(patho)logie (glande thyroïde) | | X |
| Morphométrie (augmentation du poids et de la longueur) | | X | X
| Indice hépato-somatique (IHS) | | | X
| Sex-ratios génotypiques/phénotypiques | | | X
| Histopathologie (gonades, conduits reproducteurs, rein et foie) | | | X
| Vitellogénine (VTG) (optionnel) | | | X
Mortalité et observations quotidiennes
38. L’ensemble des viviers est vérifié quotidiennement pour détecter les animaux morts, et les décès survenus dans chaque vivier sont notés dans le rapport. Les animaux morts sont retirés du vivier d’essai dès qu’ils sont identifiés. Leur stade de développement doit être classé comme soit antérieur au stade NF 58 (avant l’apparition des membres antérieurs), soit entre les stades NF 58 et NF 62, soient entre les stades NF 63 et NF 66 (entre le stade NF62 et l’absorption totale de la queue) soit postérieur au stade NF 66 (post-larvaire). Les taux de mortalité supérieurs à 20 % sont des indicateurs potentiels de conditions d’essai mal adaptées, ou d’effets toxiques manifestes du produit chimique d’essai. Les animaux ont tendance à être plus sensibles à des épisodes de mortalité non induite par des produits chimiques au cours des premiers jours de développement qui suivent le frai et pendant le paroxysme métamorphique. Cette mortalité peut apparaître dans les données issues des témoins.
39. En outre, les éventuelles observations de comportement anormal, de malformations visibles (scoliose, par exemple) ou de lésions doivent être notées dans le rapport. Les scolioses observées sont dénombrées (incidence) et classées en fonction de leur indice de gravité (non remarquable – NR, minime – 1, modérée – 2, grave – 3, par exemple; voir appendice 8). On s’efforcera de limiter la prévalence des scolioses modérées et graves (en deçà de 10 % dans les témoins, par exemple) tout au long de l’essai, même si une prévalence accrue d’anomalies dans les témoins n’est pas nécessairement une raison pour arrêter l’essai. Un comportement normal se caractérise par la suspension des larves dans la colonne d’eau, la queue élevée au-dessus de la tête, un battement léger de la queue sur un rythme régulier, des remontées périodiques à la surface, un opercule mobile et la réponse aux stimuli. Inversement, un comportement anormal implique notamment des animaux flottant à la surface, immobiles au fond du vivier, une nage inversée ou irrégulière, un manque d’activité à la surface et l’absence de réponse aux stimuli. En ce qui concerne les animaux postmétamorphiques, outre les comportements anormaux évoqués, les différences de consommation de nourriture entre les groupes traités sont consignées lorsqu’elles sont importantes. Les malformations apparentes et les lésions se manifestent éventuellement par des anomalies morphologiques (difformité des membres, par exemple), des lésions hémorragiques, des œdèmes abdominaux et des infections bactériennes ou fongiques, entre autres. L’apparition de lésions sur la tête des juvéniles, juste derrière les narines, peut être l’indication de taux d’humidité insuffisants. Ces déterminations sont d’ordre qualitatif, et sont considérées comme analogues aux signes cliniques de maladies/stress, et toujours effectuées en comparaison avec les animaux témoins. Un taux d’occurrence supérieur dans les viviers exposés par rapport au groupe témoin constitue la preuve d’une toxicité manifeste.
Sous-échantillons de larves
Description générale de la préparation des sous-échantillons de larves:
40. Les têtards qui ont atteint le stade NF62 sont retirés des viviers puis soit prélevés soit déplacés dans un nouveau vivier pour la suite de l’exposition, ou bien séparés physiquement des têtards restants dans le même vivier avec un diviseur. Les têtards sont vérifiés quotidiennement, et le jour où un individu atteint le stade NF62 est consigné. La caractéristique déterminante dans le cadre de cette évaluation est la forme de la tête. Une fois que la taille de la tête a diminué au point de sembler à peu près de la même largeur que le tronc du têtard et que les membres antérieurs ont atteint le niveau du milieu du cœur, l’individu considéré est consigné comme ayant atteint le stade NF62.
41. L’objectif est de prélever au total cinq têtards au stade NF62 par réplicat. La procédure employée est aléatoire, mais elle est décidée en amont. La figure 1 illustre un exemple hypothétique de réplicat. Si 20 têtards survivants sont dénombrés dans un vivier particulier lorsque le premier individu atteint le stade NF62, cinq numéros entre 1 et 20 sont choisis au hasard. Le têtard #1 est le premier individu à atteindre le stade NF62 et le têtard #20 est le dernier individu à atteindre le stade NF62 dans le vivier. De même, si 18 larves survivantes sont dénombrées dans un vivier, cinq numéros entre 1 et 18 sont choisis au hasard. La même procédure est suivie pour chaque réplicat lorsque le premier individu atteint le stade NF62. Si des décès sont constatés lors de l’échantillonnage au stade 62, la procédure aléatoire est appliquée de nouveau aux échantillons restants en fonction du nombre de larves restantes n’ayant pas atteint le stade NF62 et du nombre d’échantillons supplémentaires nécessaires pour atteindre un total de cinq échantillons à partir de ce réplicat. Le jour où un têtard atteint le stade NF62, on consulte le diagramme d’échantillonnage préparé pour déterminer si cet individu doit être prélevé ou être physiquement séparé des têtards restants pour continuer d’être exposé. Dans l’exemple ci-dessous (figure 1), le premier individu à atteindre le stade NF62 (cf. case #1) est physiquement séparé des autres larves, continue d’être exposé, et le jour de l’étude où cet individu a atteint le stade NF62 est noté dans le rapport. Par la suite, les individus #2 et #3 sont traités de la même manière que l’individu #1, puis l’individu #4 est prélevé afin d’observer les déterminants de la croissance et de procéder à un examen histologique de la thyroïde (dans cet exemple). Cette procédure se poursuit jusqu’à ce que le 20e individu rejoigne les individus restants ayant dépassé le stade NF62 ou soit prélevé. La procédure aléatoire employée garantit une même probabilité d’être sélectionné à tous les individus. Pour cela, toute méthode de choix aléatoire est valable, mais chaque têtard doit être comptabilisé à un moment au cours de la période de sous-échantillonnage avant d’atteindre le stade NF62.
Figure 1
Exemple hypothétique d’échantillonnage au stade NF62 dans un réplicat unique
42. Les effets observés sur les sous-échantillons de larves sont les suivants: (1) délai jusqu’au stade NF62 (à savoir, le nombre de jours écoulés entre la fécondation et le stade NF62), (2) anomalies externes, (3) morphométrie (poids et longueur, par exemple) et (4) histologie de la thyroïde.
Euthanasie des têtards
43. Le sous-échantillon de têtards au stade NF62 (cinq individus par réplicat) est euthanasié par immersion pendant 30 minutes dans des quantités appropriées (500 ml, par exemple) de solution anesthésique (solution à 0,3 % de MS-222, méthanesulfonate de tricaïne, CAS.886-86-2, par exemple). La solution de MS-222 doit être tamponnée au bicarbonate de sodium (pH 7,0 environ), car une solution de MS-222 non tamponnée est acide et irritante pour la peau des grenouilles, ce qui entraîne une mauvaise absorption et un stress supplémentaire inutile pour les organismes.
44. Le têtard est retiré de la cuve expérimentale avec une épuisette à filet puis transporté (déposé) dans la solution euthanasique. Après avoir été euthanasié correctement, l’animal est prêt pour la nécropsie lorsqu’il ne réagit plus à des stimuli extérieurs tels que le pincement de la patte arrière avec une paire de forceps.
Morphométrie (poids et longueur)
45. Le poids humide (au mg près) et la longueur museau-cloaque (LMC) (à 0,1 mm près) de chaque têtard sont mesurés dès que le têtard ne répond plus aux stimuli sous l’effet de l’anesthésie (figure 2a). Il est possible d’utiliser un logiciel d’analyse d’images pour mesurer la LMC à partir d’une photographie. Les têtards sont séchés par tamponnage avant la pesée afin d’éliminer l’eau adhérente en excès. Après le mesurage du poids et de la LMC, les anomalies morphologiques manifestes et/ou signes cliniques de toxicité manifeste tels qu’une scoliose (voir l’appendice 8), les pétéchies (petites hémorragies rouges ou violacées au niveau des capillaires sous-cutanés) et les hémorragies sont consignées, et il est recommandé d’employer une méthode numérique d’identification des anomalies.
Collecte et fixation des tissus
46. Les glandes thyroïdes du sous-échantillon de larves sont évaluées en vue de l’histologie. La partie inférieure du torse située à l’arrière des membres antérieurs est retirée et jetée. La carcasse découpée est fixée dans du fixateur de Davidson. Le volume de fixateur dans le conteneur doit être supérieur ou égal à 10 fois le volume approximatif des tissus. Le fixateur est agité ou diffusé de manière appropriée pour fixer convenablement les tissus considérés. Tous les tissus restent dans le fixateur de Davidson pendant au moins 48 heures, mais pas plus de 96 heures, après quoi ils sont rincés à l’eau désionisée et stockés dans du formol à 10 % neutre tamponné (1) (29).
Histologie de la thyroïde
47. Chaque sous-échantillon de larves (tissus fixés) fait l’objet d’une évaluation histologique de la glande thyroïde permettant de poser un diagnostic et d’évaluer l’indice de gravité (29) (30).
Figure 2: Repères pour le mesurage de la longueur museau-cloaque dans le LAGDA au stade NF 62 (a) et chez les juvéniles (b). Les caractéristiques définissant le stade NF 62 sont que la tête a la même largeur que le tronc, la longueur du nerf olfactif est plus courte que le diamètre du bulbe olfactif (vue dorsale), et les membres antérieurs sont au même niveau que le cœur (vue ventrale). Les images sont adaptées de Nieuwkoop et Faber (1994)
Fin de l’exposition larvaire
48. Compte tenu du nombre initial de têtards, il est probable qu’un faible pourcentage d’individus ne se développeront pas normalement et n’accompliront pas une métamorphose complète (stade NF66) dans un laps de temps raisonnable. La partie larvaire de l’exposition ne devrait pas excéder 70 jours. Les têtards restants à l’issue de cette période sont euthanasiés (voir paragraphe 43), leur poids humide et leur LMC sont mesurés, leur stade de développement est déterminé d’après Nieuwkoop et Faber (1994) et les éventuelles anomalies du développement sont notées.
Sélection après le stade NF66
49. Dix individus par vivier sont conservés à partir du stade NF66 (résorption totale de la queue) jusqu’à la fin de l’exposition. Par conséquent, une fois que tous les animaux ont atteint le stade NF66 ou à l’expiration d’un délai de 70 jours (selon la première éventualité), une sélection est effectuée. Les animaux ayant atteint le stade NF66 mais qui ne seront pas conservés jusqu’à la fin de l’exposition sont choisis au hasard.
50. Les animaux non sélectionnés pour être conservés jusqu’à la fin de l’exposition sont euthanasiés (voir paragraphe 43). Le stade de développement, le poids humide et la LMC (figure 2b) sont mesurés et chaque animal fait l’objet d’une nécropsie macroscopique. Le sexe phénotypique (basé sur la morphologie des gonades) est noté comme étant féminin, masculin ou indéterminé.
Échantillons de juvéniles
Description générale de la préparation des échantillons de juvéniles
51. Les animaux restants continuent d’être exposés jusqu’à 10 semaines après le délai médian jusqu’au stade NF62 dans le témoin contenant l’eau de dilution (et/ou le témoin avec solvant, le cas échéant). À la fin de la période d’exposition, les animaux restants (maximum 10 grenouilles par réplicat) sont euthanasiés, et les divers effets observés sont mesurés ou évalués et consignés: (1) morphométrie (poids et longueur), (2) sex-ratios génotypiques/phénotypiques, (3) poids du foie (indice hépato-somatique), (4) histopathologie (gonades, conduits reproducteurs, foie et reins) et éventuellement (5) VTG plasmatique.
Euthanasie des grenouilles
52. Les échantillons de juvéniles (grenouilles post-métamorphiques) sont euthanasiés par injection intrapéritonéale d’un anesthésique (MS-222 à 10 % dans une solution tamponnée de phosphate appropriée, par exemple). Les grenouilles peuvent être prélevées une fois devenues insensibles (habituellement deux minutes environ après l’injection, en cas d’utilisation de MS-222 à 10 % à raison de 0,01 ml par g de grenouille). Les jeunes grenouilles pourraient être immergées dans un anesthésique plus concentré (MS-222), mais l’expérience a montré qu’une anesthésie selon cette méthode prend plus de temps et que cette durée ne convient peut-être pas pour l’échantillonnage. L’injection permet d’euthanasier les animaux de manière rapide et efficace avant l’échantillonnage. Ce dernier ne doit pas démarrer avant confirmation que les grenouilles sont insensibles, le but étant de s’assurer que les animaux sont bien morts. Si les têtards montrent des signes de souffrance considérable (i.e. sévères et que leur mort est prévisible) et que leur état est moribond, les animaux doivent être anesthésiés puis euthanasiés, et traités comme des cas de mortalité lors de l’analyse des données. Quand un têtard est euthanasié dans ce cas sévère, il faut le consigner dans le rapport d’essai. En fonction du moment de l’essai ou le têtard est euthanasié, il peut être retenu pour une analyse histopathologique, en fixant le spécimen préalablement à une analyse future.
Morphométrie (poids et longueur)
53. La caractérisation du poids humide et de la LMC (figure 2b) est identique à celle décrite pour les sous-échantillons de larves.
VTG plasmatique (optionnel)
54. La VTG est un biomarqueur largement accepté résultant de l’exposition à des produits chimiques œstrogéniques. En ce qui concerne le LADGA, la VTG plasmatique peut éventuellement être mesurée dans des échantillons de juvéniles (ce qui peut être particulièrement utile si le produit chimique d’essai est présumé être un œstrogène).
55. Les membres postérieurs des juvéniles euthanasiés sont sectionnés et le sang est prélevé au moyen d’un tube capillaire hépariné (bien que d’autres méthodes de prélèvement de sang, comme la ponction cardiaque, puissent convenir). Le sang est expulsé dans un tube de microcentrifugation (de 1,5 ml de volume, par exemple) et centrifugé pour obtenir le plasma. Les échantillons de plasma sont conservés à une température inférieure ou égale à -70 °C jusqu’à la détermination de la VTG. La VTG plasmatique peut être dosée par la méthode ELISA (appendice 6) ou par une autre méthode telle que la spectrométrie de masse (31). Les anticorps spécifiques de l’espèce sont préférables en raison de leur plus grande sensibilité.
Détermination du sexe génétique
56. Le sexe génétique de chaque grenouille juvénile est évalué d’après les marqueurs développés par Yoshimoto et al. (11). Pour déterminer le sexe génétique, une partie (ou la totalité) d’un membre postérieur (ou de tout autre tissu) retiré au moment de la dissection est prélevée et stockée dans un tube de microcentrifugation (des échantillons de tissus de grenouilles peuvent être obtenus à partir de n’importe quel tissu). Les tissus peuvent être conservés à une température inférieure ou égale à -20 °C jusqu’à l’isolement de l’acide désoxyribonucléique (ADN). L’isolement de l’ADN à partir de tissus peut être effectué au moyen de kits disponibles dans le commerce; la présence ou l’absence du marqueur est analysée par le biais d’une réaction en chaîne par polymérase (PCR) (appendice 5). En règle générale, la concordance entre le sexe histologique et le génotype des animaux témoins au moment de l’échantillonnage des juvéniles dans les groupes témoins est supérieure à 95 %.
Collecte et fixation des tissus pour l’histopathologie
57. Les gonades, les conduits reproducteurs, les reins et les foies sont collectés à des fins d’analyse histologique lors de l’échantillonnage final. La cavité abdominale est ouverte, et le foie disséqué et pesé. Ensuite, les organes digestifs (estomac, intestins, etc.) sont soigneusement retirés de la partie inférieure de l’abdomen pour faire apparaître les gonades, les reins et les conduits reproducteurs. Les éventuelles anomalies morphologiques macroscopiques observées dans les gonades sont notées. Enfin, les membres postérieurs sont retirés s’ils ne l’ont pas déjà été pour le prélèvement du sang. Les foies collectés et la carcasse avec les gonades conservées in situ sont immédiatement placés dans du fixateur de Davidson. Le volume de fixateur dans le conteneur doit être supérieur ou égal à 10 fois le volume approximatif des tissus. Tous les tissus restent dans le fixateur de Davidson pendant au moins 48 heures, mais pas plus de 96 heures, après quoi ils sont rincés à l’eau désionisée et stockés dans du formol à 10 % neutre tamponné (1) (29).
Histopathologie
58. Chaque échantillon de juvéniles fait l’objet d’une évaluation histologique visant à déceler une pathologie dans les gonades, les conduits reproducteurs, les reins et les tissus hépatiques; cette évaluation histologique permet de poser un diagnostic et d’évaluer l’indice de gravité (32). Le phénotype gonadique est aussi dérivé de cette évaluation (ovaires, testicules, hermaphrodisme, par exemple); couplées à la caractérisation du sexe génétique de chaque individu, ces observations peuvent servir à calculer les sex-ratios génotypiques/phénotypiques.
RÉSULTATS ET RAPPORT
Analyse statistique
59. Le LAGDA génère trois types de données à soumettre à l’analyse statistique: (1) des données quantitatives continues (poids, LMC, IHS, VTG), (2) des données de type «délai avant événement» concernant les rythmes de développement (nombre de jours jusqu’à l’atteinte du stade NF62 à compter du lancement de l’essai) et (3) des données ordinales sous la forme d’indices de gravité ou de stades de développement, issues des évaluations histopathologiques.
60. Il est recommandé de s’assurer que le protocole d’essai et le test statistique sélectionné ont une puissance suffisante pour permettre de déceler des changements d’importance biologique concernant les effets pour lesquels une CSEO ou une CEx doit être rapportée. Il est préférable d’effectuer ces analyses statistiques (en règle générale, sur la base de la moyenne des réplicats) en suivant les procédures décrites dans le document de l’OCDE sur les méthodes actuelles d’analyse des données d’écotoxicité (Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application) (33). L’appendice 7 de la présente méthode d’essai illustre l’arbre de décision recommandé pour l’analyse statistique et donne des indications pour le traitement des données, permettant ainsi de choisir le test ou modèle statistique le plus approprié dans le LAGDA.
61. Les données issues des échantillons de juvéniles (croissance, IHS, par exemple) sont analysées pour chaque sexe génotypique séparément sachant que le sexe génotypique est déterminé pour toutes les grenouilles.
Considérations relatives à l’analyse des données
Utilisation de réplicats et de traitements compromis
62. Une mortalité excessive due à une toxicité manifeste, une maladie ou une erreur technique peut compromettre les réplicats et traitements. Si un traitement est compromis par une maladie ou une erreur technique, trois traitements non compromis et trois réplicats non compromis devront être disponibles pour l’analyse. Si une toxicité manifeste est observée pour la/les dose(s) la/les plus forte(s), il est préférable qu’au moins trois niveaux de traitement avec trois réplicats non compromis soient disponibles pour l’analyse [conformément à l’approche de la concentration maximale tolérée appliquée dans les lignes directrices pour les essais de l’OCDE (34)]. Outre la mortalité, les signes de toxicité manifeste peuvent inclure des effets comportementaux (animaux flottant à la surface, immobiles au fond du vivier, nage inversée ou irrégulière, manque d’activité à la surface, par exemple), des lésions morphologiques (lésions hémorragiques, œdème abdominal, par exemple) ou l’inhibition des réactions normales au régime alimentaire par rapport aux animaux témoins sur le plan qualitatif.
Témoin avec solvant
63. À la clôture de l’essai, les effets potentiels du solvant (en cas d’utilisation d’un solvant) font l’objet d’une évaluation. Pour cela, les résultats correspondant au groupe témoin avec solvant sont comparés à ceux du groupe témoin avec eau de dilution. Les relevés d’observation les plus pertinents dans ce cadre concernent les déterminants de la croissance (poids et longueur), qui peuvent être affectés en cas d’effets toxiques généralisés. Si des différences statistiquement significatives sont décelées entre les relevés d’observation du groupe témoin avec eau de dilution et ceux du groupe témoin avec solvant, un avis d’expert doit permettre de déterminer si la validité de l’essai est compromise. Si les deux témoins diffèrent, les témoins exposés au produit chimique sont comparés au témoin avec solvant, sauf si l’on sait qu’il est préférable de les comparer au témoin contenant l’eau de dilution. S’il n’existe pas de différence statistiquement significative entre les deux groupes témoins, il est recommandé de comparer les groupes exposés au produit chimique d’essai avec l’ensemble des deux groupes (témoin avec solvant + témoin avec eau de dilution), sauf si l’on sait qu’il est préférable de les comparer soit au groupe témoin avec eau de dilution soit au témoin avec solvant.
Rapport d’essai
64. Le rapport d’essai contient les informations suivantes:
Produit chimique d’essai:
— État physique et, si nécessaire, propriétés physico-chimiques;
— Substance mono-constituant:
apparence physique, hydro-solubilité, autres propriétés physico-chimiques importantes pour la conduite de l’étude;
identification chimique, telle que désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc. (y compris la teneur en carbone organique, si cela se justifie).
— Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:
caractérisés autant que possible par l’identité chimique (voir ci-dessus), la teneur et les propriétés physico-chimiques pertinentes des constituants.
Espèce soumise à l’essai:
— nom scientifique, souche (si possible), origine, méthode de collecte des œufs fécondés et de manipulation ultérieure.
— incidence de la scoliose chez les témoins historiques en ce qui concerne la culture-mère utilisée.
Conditions d’essai:
— Photopériode(s);
— conception de l’essai (dimensions des récipients, matériel et volume d’eau, nombre de récipients et de réplicats, nombre d’organismes d’essai par réplicat, etc.);
— méthode de préparation des solutions-mères et fréquence de renouvellement (l’agent solubilisant et sa concentration doivent être indiqués le cas échéant);
— méthode de dosage du produit chimique d’essai: pompes doseuses, systèmes de dilution, etc.;
— efficacité de récupération de la méthode et concentrations d’essai nominales, limite de quantification, moyennes des valeurs mesurées avec leurs écarts-types dans les récipients d’essai, méthode analytique utilisée et données montrant que les mesures se réfèrent aux concentrations du produit chimique d’essai en solution vraie;
— caractéristiques de l’eau de dilution: pH, dureté, température, concentration d’oxygène dissous, taux de chlore résiduel (si mesuré), iode total, carbone organique total (si mesuré), solides en suspension (si mesurés), salinité du milieu d’essai (si mesurée) et toute autre mesure effectuée;
— concentrations d’essai nominales, moyennes des valeurs mesurées avec leurs écarts-types;
— qualité de l’eau dans les récipients d’essai, pH, température (quotidiennement) et concentration d’oxygène dissous;
— informations détaillées sur l’alimentation (type d’aliments, provenance, quantité distribuée et fréquence, etc.).
Résultats:
— données attestant que les témoins répondent aux critères de validité;
— données relatives au groupe témoin (plus témoin avec solvant le cas échéant) et aux groupes traités: mortalité et anomalies observées, délai jusqu’au stade NF62, histologie de la thyroïde (échantillon de larves uniquement), croissance (poids et longueur), IHS (échantillon de juvéniles uniquement), sex-ratios génotypiques/phénotypiques (échantillon de juvéniles uniquement), résultats de l’histopathologie des gonades, des conduits reproducteurs, des reins et du foie (échantillon de juvéniles uniquement) et de la VTG plasmatique (échantillon de juvéniles uniquement, si mesurée);
— approche utilisée pour l’analyse statistique et le traitement des données (test ou modèle statistique utilisé);
— concentration sans effet observé (CSEO)pour chacune des réponses évaluées;
— concentration minimale avec effet observé (CMEO) pour chacune des réponses évaluées (à rα = 0,05); CEx pour chacune des réponses évaluées, le cas échéant, et intervalles de confiance (95 %, par exemple), graphique du modèle ajusté utilisé pour calculer la CEx, pente de la courbe concentration-réponse, formule du modèle de régression, estimation des paramètres du modèle et de leurs erreurs-types.
— tout écart par rapport à la méthode d’essai et aux critères d’acceptation; considérations relatives aux conséquences susceptibles d’en découler pour les résultats de l’essai.
65. En ce qui concerne les résultats de la mesure des effets, on présentera les valeurs moyennes et leurs écarts-types (par réplicat et par concentration, si possible).
66. Le délai médian jusqu’au stade NF62 dans les témoins est calculé et présenté comme la moyenne des médianes dans les réplicats et leur écart-type. De même, pour les traitements, une médiane est calculée et présentée comme la moyenne des médianes dans les réplicats et leur écart-type.
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