Critères applicables à la préparation des échantillons et aux méthodes d’analyse utilisées pour le contrôle des teneurs en mycotoxines des denrées alimentaires
1. INTRODUCTION Précautions
Les toxines végétales étant généralement réparties de façon hétérogène, les échantillons sont préparés, et surtout homogénéisés, avec le plus grand soin.
Lorsque l’homogénéisation a lieu au laboratoire, la totalité de l’échantillon reçu au laboratoire doit être homogénéisée.
2. TRAITEMENT DE L’ÉCHANTILLON REÇU AU LABORATOIRE
Chaque échantillon de laboratoire doit être soigneusement mélangé à l’aide d’un procédé, y compris un broyage fin si nécessaire, dont il a été démontré qu’il permet d’obtenir une homogénéisation complète.
Si la teneur maximale s’applique à la matière sèche, la teneur du produit en matière sèche est déterminée sur une partie de l’échantillon homogénéisé à l’aide d’une méthode dont il est démontré qu’elle permet une détermination précise de la teneur en matière sèche.
3. ÉCHANTILLONS IDENTIQUES
Les échantillons identiques destinés à des fins de contrôle, de recours et d’arbitrage sont prélevés sur le produit homogénéisé, sauf si cette procédure est contraire aux dispositions réglementaires d’un États membre relative aux droits des exploitants du secteur alimentaire.
4. MÉTHODE D’ANALYSE À UTILISER PAR LE LABORATOIRE ET EXIGENCES DE CONTRÔLE
4. 1. Exigences générales
Les méthodes analytiques de confirmation utilisées pour le contrôle des denrées alimentaires doivent satisfaire aux dispositions de l’annexe III, points 1 et 2, du règlement (UE) 2017/625.
Dans la mesure du possible, la justesse de la méthode devrait être vérifiée par l’analyse d’un matériau de référence certifié et/ou par des résultats positifs à des essais d’aptitude effectués régulièrement.
4. 2. Exigences spécifiques
4. 2.1. Exigences spécifiques pour les méthodes de confirmation
4. 2.1.1. Critères de performance
Pour les méthodes de confirmation, les critères de performance suivants s’appliquent:
Récupération: le taux de récupération moyen devrait se situer entre 70 et 120 %.
Le taux de récupération moyen correspond à la valeur moyenne des échantillons identiques obtenus au cours de la validation lors de la détermination des paramètres de fidélité RSDr et RSDwR. Ce critère s’applique à toutes les concentrations et à toutes les toxines individuelles.
Dans des cas exceptionnels, les taux de récupération moyens en dehors de la fourchette ci-dessus peuvent être acceptables pour autant qu’ils se situent entre 50 et 130 % et que les critères de fidélité RSDr et RSDwR sont remplis.
Fidélité
RSDr doit être ≤ 20 %.
RSDwR doit être ≤ 20 %.
RSDR devrait être ≤ 25 %.
Ces critères s’appliquent à toutes les concentrations.
Si un laboratoire apporte la preuve que le critère RSDwR est respecté, il n’est pas nécessaire de fournir cette preuve pour le critère RSDr, étant donné que le respect du premier garantit le respect du second.
Si la teneur maximale s’applique à une somme de toxines, les critères de fidélité s’appliquent à la fois à la somme des toxines et aux toxines individuelles.
Limite de quantification
Lorsqu’une exigence spécifique relative à la limite de quantification d’une toxine végétale a été fixée dans le tableau 1 ci-dessous, la méthode doit avoir une limite de quantification égale ou inférieure à cette valeur.
Tableau 1
Exigences concernant la LOQ pour certaines toxines végétales
| Toxines végétales | Remarques | Denrées alimentaires | Exigence concernant la LOQ (μg/kg) ou (μg/l)
| Alcaloïdes pyrrolizidiniques | Exigence concernant la LOQ pour les alcaloïdes pyrrolizidine individuels |
Produit séché
Produit liquide
|
≤ 10
≤ 0,15
| Alcaloïdes tropaniques | Exigence concernant la LOQ respectivement pour l’atropine et pour la scopolamine |
Préparations à base de céréales destinées aux nourrissons et aux enfants en bas âge
Céréales et produits céréaliers
Infusions (produit séché)
Infusions (produit liquide)
|
≤ 1
≤ 2
≤ 5
≤ 0,05
| Alcaloïdes opioïdes | Exigence concernant la LOQ respectivement pour la morphine et pour la codéine | Produits de boulangerie | ≤ 500
Dans tous les autres cas, les dispositions suivantes s’appliquent:
LOQ: doit être ≤ 0,5 * teneur maximale (TM) et devrait de préférence être inférieure (≤ 0,2 * TM).
Si la teneur maximale s’applique à une somme de toxines, la limite de quantification des toxines individuelles doit être ≤ 0,5 * TM/n, n étant le nombre de toxines incluses dans la définition de la teneur maximale.
Identification
Les critères définis dans le document d’orientation sur l’identification des mycotoxines et des toxines végétales dans les denrées alimentaires et les aliments pour animaux sont appliqués aux fins de l’identification.
4. 2.1.2. Extension du champ d’application de la méthode
4. 2.1.2.1. Extension du champ d’application à d’autres mycotoxines
Lorsque le champ d’application d’une méthode de confirmation existante est étendu à d’autres analytes, la validité de la méthode doit être démontrée au moyen d’une validation complète.
4. 2.1.2.2. Extension du champ d’application à d’autres produits
S’il est avéré ou probable que la méthode de confirmations est applicable à d’autres produits, sa validité doit être vérifiée pour ces autres produits. Si le nouveau produit appartient à un groupe de produits (voir tableau 2 de la présente annexe) pour lequel la méthode a déjà fait l’objet d’une validation initiale, la réalisation d’une validation supplémentaire limitée est suffisante.
4. 2.2. Exigences spécifiques pour les méthodes de dépistage semi-quantitatives
4. 2.2.1. Champ d’application
La présente section s’applique aux méthodes bioanalytiques fondées sur l’immunoreconnaissance ou la fixation à un récepteur (ELISA, bandelettes réactives, dispositifs à flux latéral, immunodétecteurs, etc.) et aux méthodes physico-chimiques fondées sur la chromatographie ou la détection directe par spectrométrie de masse (spectrométrie de masse en milieu ambiant, par exemple). Les autres méthodes (telle la chromatographie sur couche mince) ne sont pas exclues pour autant que les signaux émis se rapportent directement aux toxines végétales considérées et permettent l’application du principe décrit ci-dessous.
Les exigences spécifiques s’appliquent aux méthodes donnant comme résultat de la mesure une valeur numérique [réponse (relative) d’un lecteur de bandelettes réactives, signal du couplage de la chromatographie en phase liquide (CL) et de la spectrométrie de masse, etc.] et auxquelles s’appliquent les règles statistiques ordinaires.
Les exigences ne s’appliquent pas aux méthodes qui ne donnent pas des valeurs numériques (mais se limitent, par exemple, à signaler la présence ou l’absence), lesquelles requièrent d’autres modes de validation. Les exigences spécifiques applicables à ces méthodes sont énoncées au point 4.2.3.
Le présent document décrit les procédures de validation des méthodes de dépistage par validation interlaboratoire, de vérification de la performance d’une méthode validée au terme d’un exercice interlaboratoire et de validation monolaboratoire d’une méthode de dépistage.
4. 2.2.2. Procédure de validation
La validation vise à démontrer que la méthode de dépistage est adaptée à l’usage auquel elle est destinée. Elle se fait par détermination de la valeur seuil et par détermination du taux d’échantillons faussement négatifs et d’échantillons faussement suspects. Des caractéristiques de la performance telles que la capacité de détection, la sélectivité et la fidélité sont inhérentes à ces deux paramètres.
Les méthodes de dépistage peuvent faire l’objet d’une validation interlaboratoire ou monolaboratoire. Si les données d’une validation interlaboratoire d’une méthode sont déjà disponibles pour une combinaison toxine végétale/matrice/STC donnée, un laboratoire appliquant la méthode pourra se contenter de vérifier les performances de celle-ci.
4. 2.2.2.1. Validation initiale par validation monolaboratoire
Toxines végétales
La validation doit être faite pour chaque toxine végétale relevant du champ d’application. Si des méthodes de bioanalyse produisent une réponse combinée pour un groupe donné de toxines végétales (les alcaloïdes pyrrolizidiniques, par exemple), leur applicabilité doit être démontrée et les limites de l’essai doivent être mentionnées dans la définition du champ d’application de la méthode. La réactivité croisée non souhaitée ne devrait pas augmenter le taux d’échantillons faussement négatifs pour les toxines végétales ciblées, mais elle pourrait augmenter le taux d’échantillons faussement suspects. La réalisation d’analyses de confirmation visant à identifier et à quantifier précisément les toxines végétales permettra de limiter cette augmentation indésirable.
Matrices
Une validation initiale est réalisée pour chaque produit ou, lorsqu’il est avéré que la méthode est utilisable pour des produits multiples, pour chaque groupe de produits. Dans le second cas, un produit représentatif et présentant un intérêt est sélectionné dans le groupe concerné (voir tableau 2).
Ensemble d’échantillons
Le nombre minimal d’échantillons requis en vue de la validation est fixé à 20 échantillons témoins négatifs homogènes et à 20 échantillons témoins positifs homogènes contenant la toxine végétale à la STC, analysés dans des conditions de reproductibilité intralaboratoire (RSDwR) pendant une période s’étalant sur cinq jours. Des ensembles supplémentaires de 20 échantillons dans lesquels la mycotoxine est présente à des teneurs différentes peuvent être ajoutés à l’ensemble constitué pour la validation, pour que l’on puisse se faire une idée de la plage dans laquelle la méthode permet de discriminer les différentes concentrations de la toxine végétale.
Concentration
La méthode doit être validée pour chaque STC à utiliser lors des applications de routine.
4. 2.2.2.2. Validation initiale au moyen d’études collaboratives
La validation par des essais collaboratifs est effectuée conformément à la norme ISO 5725:1994 ou au protocole international harmonisé de l’UICPA ou à tout autre protocole internationalement reconnu sur les essais collaboratifs qui requiert l’utilisation des données valides d’au moins huit laboratoires. La seule autre différence par rapport aux validations monolaboratoires réside dans le fait que les ≥ 20 échantillons par produit/teneur peuvent être répartis également entre les laboratoires participants, chaque laboratoire recevant au minimum deux échantillons.
4. 2.2.3. Détermination de la valeur seuil et du taux de résultats faussement suspects des échantillons blancs
Les réponses (relatives) concernant les échantillons témoins négatifs et positifs servent de base pour le calcul des paramètres requis.
Méthodes de dépistage à réponse proportionnelle à la concentration de la toxine végétale
La formule suivante s’applique aux méthodes de dépistage à réponse proportionnelle à la concentration de la toxine végétale:
Valeur seuil = RSTC - valeur t0,05 *SDSTC
RSTCréponse moyenne des échantillons témoins positifs (à la STC)
valeur t: une valeur t unicaudale pour un taux de résultats faussement négatifs de 5 % (voir tableau 3)
SDSTCécart type
Méthodes de dépistage à réponse inversement proportionnelle à la concentration de la toxine végétale
Par analogie, pour les méthodes de dépistage à réponse inversement proportionnelle à la concentration de la toxine végétale, la valeur seuil est déterminée comme suit:
Valeur seuil = RSTC - valeur t0,05 *SDSTC
Si l’on utilise cette valeur t spécifique pour déterminer la valeur seuil, le taux de résultats faussement négatifs est fixé par défaut à 5 %.
Évaluation de l’adaptation à l’usage
Les résultats relatifs aux échantillons témoins négatifs servent à estimer le taux correspondant de résultats faussement suspects. La valeur t calculée correspond au cas où le résultat d’un échantillon témoin négatif est supérieur à la valeur seuil et donc erronément considéré comme suspect.
valeur t(valeur seuil - moyenneblanc)/SDblanc
pour les méthodes de dépistage à réponse proportionnelle à la concentration de la toxine végétale
ou
valeur t(moyenneblanc – valeur seuil)/SDblanc
pour les méthodes de dépistage à réponse inversement proportionnelle à la concentration de la toxine végétale
À partir de la valeur t obtenue sur la base des degrés de liberté calculés à partir du nombre d’expériences, la probabilité d’échantillons faussement suspects dans une distribution unicaudale peut être calculée (fonction TDIST de la feuille de calcul, par exemple) ou trouvée dans un tableau relatif à la distribution de t (voir tableau 3).
La valeur correspondante de la distribution unicaudale de t indique le taux de résultats faussement suspects.
Ce concept est décrit en détail, exemple à l’appui, dans Analytical and Bioanalytical Chemistry DOI 10.1007/s00216 -013-6922-1.
4. 2.2.4. Extension du champ d’application de la méthode
4. 2.2.4.1. Extension du champ d’application à d’autres toxines végétales
Lorsque le champ d’application d’une méthode de dépistage existante est étendu à d’autres toxines végétales, la validité de la méthode doit être démontrée au moyen d’une validation complète.
4. 2.2.4.2. Extension du champ d’application à d’autres produits
S’il est avéré ou probable que la méthode de dépistage est applicable à d’autres produits, sa validité doit être vérifiée pour ces autres produits. Si le nouveau produit appartient à un groupe de produits (voir tableau 2 de la présente annexe) pour lequel la méthode a déjà fait l’objet d’une validation initiale, la réalisation d’une validation supplémentaire limitée est suffisante. À cet effet, un minimum de 10 échantillons témoins négatifs homogènes et de 10 échantillons témoins positifs homogènes (à la STC) doivent être analysés dans des conditions de reproductibilité intralaboratoire. Les échantillons témoins positifs doivent tous présenter des valeurs dépassant la valeur seuil. Si ce critère n’est pas rempli, une validation complète est requise.
4. 2.2.5. Vérification de méthodes déjà validées au moyen d’études collaboratives
La performance des méthodes de dépistage déjà validées au moyen d’une étude collaborative doit être vérifiée. À cet effet, un minimum de 6 échantillons témoins négatifs et de 6 échantillons témoins positifs (à la STC) doivent être analysés. Les échantillons témoins positifs doivent tous présenter des valeurs dépassant la valeur seuil. Si ce critère n’est pas rempli, le laboratoire doit réaliser une analyse des causes profondes de cette situation afin de déceler pourquoi il ne peut pas répéter le résultat obtenu lors de l’étude collaborative. Après avoir pris les mesures correctrices nécessaires, le laboratoire doit revérifier la performance de la méthode en interne. Si le laboratoire n’est pas capable de vérifier les résultats de l’étude collaborative, il doit établir sa propre valeur seuil dans le cadre d’une validation monolaboratoire complète.
4. 2.2.6. Vérification/validation continue de la méthode
Après validation initiale de la méthode, le laboratoire collecte des données de validation supplémentaires en joignant au moins deux échantillons témoins positifs à chaque lot d’échantillons soumis à un dépistage. L’un des échantillons témoins positifs est un échantillon connu (un échantillon utilisé, par exemple, lors de la validation initiale) et l’autre provient d’un produit différent appartenant au même groupe de produits (si l’analyse porte sur un seul produit, l’échantillon consiste en un autre échantillon de ce produit). Un échantillon témoin négatif peut également être joint. Les résultats obtenus pour les deux échantillons témoins positifs sont ajoutés aux données de validation existantes.
Au moins une fois par an, la valeur seuil est redéterminée et la validité de la méthode est réévaluée (réévaluation des données disponibles sur l’assurance et le contrôle de la qualité obtenues au cours de l’année écoulée). La méthode de vérification continue vise plusieurs objectifs, notamment:
— assurer le contrôle qualité du lot d’échantillons soumis à un dépistage,
— fournir des informations sur la robustesse de la méthode dans les conditions prévalant dans le laboratoire appliquant la méthode,
— démontrer l’applicabilité de la méthode à d’autres produits,
— permettre une adaptation des valeurs seuils en cas de dérive graduelle au fil du temps.
4. 2.2.7. Rapport de validation
Le rapport de validation doit comporter:
— une partie consacrée à la STC,
— une partie consacrée à la valeur seuil déterminée,
Note: La valeur seuil doit comporter le même nombre de chiffres significatifs que la STC. Les valeurs numériques servant à calculer la valeur seuil doivent avoir au moins un chiffre significatif de plus que la STC.
— une partie consacrée au taux calculé d’échantillons faussement suspects,
— une partie portant sur la manière dont le taux d’échantillons faussement suspects a été établi.
Note: La partie du rapport consacrée au taux calculé d’échantillons faussement suspects mentionne si la méthode est adaptée à l’usage prévu alors qu’elle précise le nombre d’échantillons blancs (ou présentant un faible niveau de contamination) qui seront soumis à une vérification.
Tableau 2
Groupes de produits entrant en considération pour la validation des méthodes de confirmation ou de dépistage
| Groupes de produits | Catégories de produits | Produits représentatifs de la catégorie
| Forte teneur en eau |
Boissons
Fruits et légumes
Purées à base de céréales ou de fruits
Herbes culinaires fraîches
| Infusions (produit liquide), feuilles de bourrache, pommes de terre, purées destinées aux nourrissons et aux enfants en bas âge
| Forte teneur en huile |
Fruits à coque
Graines oléagineuses et produits dérivés
Fruits oléagineux et produits dérivés
|
Amandes, amandes d’abricot, graines de colza, graines de coton, graines de lin, graines de lupin, graines de pavot, graines de chanvre, etc.
Huiles et pâtes
| Forte teneur en fécule et/ou protéines et faible teneur en eau et en matières grasses |
Graines de céréales et produits dérivés
Produits diététiques
|
Maïs, sarrasin, millet, sorgho, farine de manioc, produits à base de pommes de terre
Pain, produits de boulangerie, crackers, céréales pour petit-déjeuner, pâtes alimentaires
Poudres sèches destinées à la préparation d’aliments pour nourrissons et enfants en bas âge
| Forte teneur en acide et forte teneur en eau | Agrumes |
| «Produits difficiles ou uniques» | |
Pollen et produits à base de pollen, compléments alimentaires, infusions (produit séché),
thé (produit séché)
Épices, réglisse
| Forte teneur en sucre et faible teneur en eau | Fruits séchés | Figues, raisins, groseilles, sultanines, miel
|
Lait et
produits laitiers
|
Lait
Fromage
Produits laitiers (lait en poudre, par exemple)
|
Lait de vache, de chèvre et de bufflonne
Fromage de vache et de chèvre
Yaourt, crème
Tableau 3
Valeur t unicaudale pour un taux d’échantillons faussement négatifs de 5 %
| Degrés de liberté | Nombre d’identiques | Valeur t (5 %)
| 10 | 11 | 1,812
| 11 | 12 | 1,796
| 12 | 13 | 1,782
| 13 | 14 | 1,771
| 14 | 15 | 1,761
| 15 | 16 | 1,753
| 16 | 17 | 1,746
| 17 | 18 | 1,74
| 18 | 19 | 1,734
| 19 | 20 | 1,729
| 20 | 21 | 1,725
| 21 | 22 | 1,721
| 22 | 23 | 1,717
| 23 | 24 | 1,714
| 24 | 25 | 1,711
| 25 | 26 | 1,708
| 26 | 27 | 1,706
| 27 | 28 | 1,703
| 28 | 29 | 1,701
| 29 | 30 | 1,699
| 30 | 31 | 1,697
| 40 | 41 | 1,684
| 60 | 61 | 1,671
| 120 | 121 | 1,658
| ∞ | ∞ | 1,645
4. 2.3. Exigences pour les méthodes de dépistage qualitatives (méthodes ne donnant pas de valeurs numériques)
Plusieurs organismes de normalisation (tels que l’AOAC et l’ISO) travaillent actuellement à l’élaboration de lignes directrices pour la validation de méthodes d’essai binaires. L’AOAC a rédigé une ligne directrice sur la validation des méthodes d’essai binaires. Ce document peut être considéré comme reflétant l’état actuel de la technique dans ce domaine. Par conséquent, les méthodes qui donnent des résultats binaires (le contrôle visuel de bandelettes réactives, par exemple) devraient être validées conformément aux lignes directrices internationales de l’AOAC pour la validation des méthodes chimiques qualitatives (méthodes d’essai binaires).
Il est toutefois possible de recourir à d’autres lignes directrices reconnues pour la validation, comme l’approche prévue dans ISO/TS 23758:2021 | IDF/RM 251 Lignes directrices pour la validation des méthodes qualitatives de dépistage des résidus de médicaments vétérinaires dans le lait et les produits laitiers
4. 3. Estimation de l’incertitude de mesure, calcul du taux de récupération et enregistrement des résultats
4. 3.1. Méthodes de confirmation
Le résultat de l’analyse doit être enregistré comme suit:
a) corrigé au titre de la récupération s’il y a lieu, et lorsqu’il y a correction, celle-ci doit être signalée. Le taux de récupération doit être indiqué, sauf si la correction intrinsèque au titre des biais fait partie de la procédure. La correction au titre de la récupération n’est pas nécessaire lorsque le taux de récupération est compris entre 90 et 110 %;
b) sous la forme «x +/–U», où x est le résultat de l’analyse et U l’incertitude de mesure élargie, calculée à l’aide d’un coefficient de couverture 2 qui donne un niveau de confiance d’environ 95 %.
Une incertitude de mesure élargie par défaut de 50 % peut être déclarée, pour autant que le laboratoire satisfait à toutes les exigences de fidélité spécifiées au point 4.2. Un laboratoire individuel peut démontrer cela en satisfaisant aux critères de répétabilité (RSDr) et de reproductibilité intralaboratoire (RSDwR) et en participant en outre avec succès aux programmes d’essai d’aptitude (à moins qu’aucun programme d’essai d’aptitude approprié ne soit disponible); l’obtention d’une note z moyenne de |z| ≤ 2 permet de démontrer que le critère de reproductibilité (RSDR) est rempli (sur la base d’un écart type cible de 25 %).
Si la teneur maximale a été fixée pour la somme des toxines, les résultats d’analyse pour chacune des toxines doivent être communiqués.
La correction au titre de la récupération, si elle est applicable, est effectuée pour chacune des toxines individuelles avant le calcul de la somme des concentrations.
Aux fins de la vérification de la conformité avec la somme des limites maximales, il convient d’appliquer une méthode fondée sur la limite inférieure, ce qui signifie que les résultats pour les toxines individuelles qui sont inférieurs à la LOQ sont remplacés par zéro pour calculer la somme.
Les présentes règles d’interprétation du résultat d’analyse en vue de l’acceptation ou du rejet du lot s’appliquent au résultat de l’analyse de l’échantillon destiné au contrôle officiel. En cas d’analyse à des fins de recours ou d’arbitrage, les réglementations nationales s’appliquent. En particulier:
lorsque le résultat de l’analyse de l’échantillon utilisé pour le contrôle officiel indique une non-conformité au-delà de tout doute raisonnable, compte tenu de l’incertitude de mesure élargie, et
que le résultat de l’analyse de l’échantillon utilisé à des fins de recours indique une non-conformité n’échappant toutefois pas à un doute raisonnable avec une incertitude de mesure élargie plus grande que celle établie pour le contrôle officiel,
le résultat de l’analyse de l’échantillon utilisé à des fins de recours ne peut pas prévaloir sur la non-conformité établie pour l’échantillon utilisé pour le contrôle officiel.
4. 3.2. Méthodes de dépistage
Le résultat du dépistage est déclaré «conforme» ou «suspecté d’être non conforme».
Est «suspecté d’être non conforme» l’échantillon qui dépasse la valeur seuil et dont la teneur en toxine végétale peut être supérieure à la STC. Tout échantillon suspect est soumis à une analyse de confirmation qui doit permettre d’identifier et de quantifier avec précision la toxine végétale.
Est «conforme» l’échantillon dont la teneur en toxine végétale est inférieure à la STC avec un niveau de confiance de 95 % (c’est-à-dire qu’il y a 5 % de risque que l’échantillon ait été déclaré erronément négatif). Le résultat de l’analyse est enregistré comme étant «< STC» et la STC doit être indiquée.
4. 4. Normes de qualité applicables aux laboratoires
Les laboratoires doivent satisfaire aux dispositions de l’article 37, paragraphes 4 et 5, du règlement (UE) 2017/625.