À l’annexe du règlement (UE) no 231/2012, l’entrée suivante est insérée après l’entrée relative à l’additif alimentaire E 960a:
«E 960b(i) RÉBAUDIOSIDE M PRODUIT PAR FERMENTATION AU MOYEN DE YARROWIA LIPOLYTICA
| Synonymes |
| Définition | Le rébaudioside M produit par fermentation au moyen de Yarrowia lipolytica consiste en un mélange de glycosides de stéviol ayant le rébaudioside M comme principal composant, avec quelques quantités de rébaudioside D et de plus petites quantités de rébaudioside A et de rébaudioside B. Le processus de fabrication comprend deux phases principales. La première phase consiste en la fermentation d’une source de sucres simples au moyen d’une souche non pathogène et non génotoxique de Yarrowia lipolytica qui a été génétiquement modifié au moyen de gènes hétérologues afin de surexpresser des gènes intervenant dans la synthèse des glycosides de stéviol pour aboutir à la souche VRM (CBS 147477). L’élimination de la biomasse par séparation solide/liquide et traitement thermique est suivie de la concentration des glycosides de stéviol. La deuxième phase consiste en la purification au moyen de la chromatographie par échange d’ions, suivie de la cristallisation des glycosides de stéviol au moyen d’éthanol, pour obtenir un produit final contenant au moins 95 % de rébaudiosides M, D, A et B. Les cellules viables et l’ADN de Yarrowia lipolytica VRM ne sont pas détectés dans l’additif alimentaire.
| Nom chimique |
Rébaudioside A: ester β-D-glucopyranosylique d’acide 13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]kaur-16-én-18-oïque
Rébaudioside B: acide 13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]kaur-16-én-18-oïque
Rébaudioside D: ester 2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosylique d’acide 13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]kaur-16-én-18-oïque
Rébaudioside M: ester 2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosylique d’acide 13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]kaur-16-én-18-oïque
| Formule moléculaire | Nom commun | Formule | Facteur de conversion
| | Rébaudioside A | C44 H70 O23 | 0,33
| Rébaudioside B | C38 H60 O18 | 0,40
| Rébaudioside D | C50 H80 O28 | 0,29
| Rébaudioside M | C56 H90 O33 | 0,25
| Poids moléculaire et numéro CAS | Nom commun | Numéro CAS | Poids moléculaire (g/mol)
| Rébaudioside A | 58543-16-1 | 967,01
| Rébaudioside B | 58543-17-2 | 804,88
| Rébaudioside D | 63279-13-0 | 1129,15
| Rébaudioside M | 1220616-44-3 | 1291,30
| Dosage | Pas moins de 95 % de rébaudioside M, rébaudioside D, rébaudioside A et rébaudioside B, sur la base de la matière sèche.
| Taille des particules | Pas plus de 0,5 % de particules de moins de 300 nm (selon la méthode STEM)
| Description | Poudre blanche à jaune clair ayant un pouvoir sucrant environ 200 à 350 fois supérieur à celui du saccharose (à raison d’une teneur en équivalent saccharose de 5 %)
| Identification
| Solubilité | Légèrement soluble dans l’eau
| pH | Entre 4,5 et 7,0 (solution à 1:100)
| Pureté
| Cendre totales | Pas plus de 1 %
| Perte à la dessiccation | Pas plus de 6 % (105 °C, 2 heures)
| Solvants résiduels | Pas plus de 5 000 mg/kg d’éthanol
| Acide kaurénoïque | Pas plus de 0,3 mg/kg (mesuré par chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse)
| Arsenic | Pas plus de 0,01 mg/kg
| Plomb | Pas plus de 0,01 mg/kg
| Cadmium | Pas plus de 0,01 mg/kg
| Mercure | Pas plus de 0,05 mg/kg
| Critères microbiologiques
| Dénombrement sur plaque du total des micro-organismes aérobies | Pas plus de 1 000 UFC/g
| Levures et moisissures | Pas plus de 100 UFC/g
| Escherichia coli | Négatif dans 1 g
| Salmonella spp. | Négatif dans 25 g
| Protéines résiduelles | Pas plus de 20 mg/kg»