1. Échantillonnage
60 échantillons au moins comprenant au moins 30 écouvillonnages trachéaux et 30 écouvillonnages cloacaux doivent être prélevés sur chaque troupeau. 60 oiseaux au moins doivent être échantillonnés. Les échantillons doivent être prélevés 5 jours avant l'abattage et transportés, à l'état réfrigéré mais non congelé, au laboratoire national de la maladie de Newcastle à des fins d'examens.
3. Traitement des échantillons
5 échantillons au maximum de chaque type peuvent être groupés. Les écouvillonnages doivent être placés dans une quantité de milieu antibiotique suffisante pour assurer leur immersion totale et reposer, après agitation, pendant 2 heures environ à la température ambiante (ou plus longtemps à 4 oC) puis clarifiés par centrifugation (par exemple 800 à 1 000 g pendant 10 minutes).
3. Milieu antibiotique
Un exemple typique pour les écouvillonnages cloacaux est le suivant: 10 000 unités/ml de pénicilline, 10 mg/ml de streptomycine, 0,25 mg/ml de gentamycine et 5 000 unités/ml de mycostatine dans une solution tamponnée au phosphate ayant un pH compris entre 7,2 et 7,4. L'addition de 50 μg/ml d'oxytétracycline est autorisée. Ces taux d'antibiotiques peuvent être 5 fois moins élevés pour les écouvillonnages trachéaux. Lors de la confection du milieu, il est impératif que le pH soit contrôlé après addition des antibiotiques et ajusté.
4. Isolement du virus dans les œufs embryonnés de poules
Inoculer 0,2 ml du surnageant clarifié dans la cavité allantoïdienne d'au moins 4 œufs embryonnés de poules, mis à incuber pendant 8 à 11 jours. Idéalement, ces œufs devraient être issus d'un troupeau exempt d'organes pathogènes spécifiques (EOPS), mais si cela n'est pas possible, il est admis d'utiliser des œufs issus d'un troupeau reconnu exempt d'anticorps du virus de la maladie de Newcastle. Les œufs inoculés sont conservés à 37 oC et mirés quotidiennement. Au fur et à mesure, les œufs contenant les embryons morts ou mourants et tous les œufs restant après quatre jours d'inoculation doivent être réfrigérés à 4 oC et faire l'objet d'une recherche d'hémagglutinines à partir du liquide allantoïdien/amniotique.
5. Interprétation
En l'absence d'hémagglutination et si aucun virus n'est isolé, le test doit être considéré comme négatif. L'isolement du virus de la maladie de Newcastle signifie que le troupeau est traité comme troupeau suspect et soumis aux exigences de l'article 4 de la directive 92/66/CEE du Conseil. Si le virus s'avère d'origine vaccinale, l'échantillonnage et l'examen doivent être répétés.