ANNEXE I
Spécifications techniques visées à l'article 2
1. Base d'échantillonnage
Un échantillon composé d'un nombre minimal de porcs détenus dans l'État membre pendant les trois mois au moins précédant l'échantillonnage est prélevé de manière aléatoire conformément au tableau 1.
Tableau 1
Taille minimale de l'échantillon
| Population porcine | Taille minimale de l'échantillon
| > 20 000 000 | 2 400
| 10 à 20 000 000 | 1 067
| 2 à 10 000 000 | 600
| < 2 000 000 | 384
Les États membres prélèvent 10 % d'échantillons en plus, qui seront analysés au cas où certains échantillons seraient exclus de l'étude pour diverses raisons.
Il convient de réaliser un échantillonnage stratifié par mois afin de couvrir les différentes saisons.
L'échantillonnage doit être stratifié par abattoir participant et proportionnel à la capacité de l'abattoir. Les États membres classent tous les abattoirs en fonction du nombre de porcs à l'engrais abattus au cours de l'année précédente. Ils déterminent ainsi les abattoirs à l'origine d'au moins 80 % de tous les abattages de porcs à l'engrais.
Le nombre total de porcs et de carcasses à échantillonner dans chacun des abattoirs participant à l'étude est estimé en multipliant la taille de l'échantillon (2 400, par exemple) par la proportion de porcs à l'engrais abattus l'année précédente. Ainsi, si un abattoir a comptabilisé 25 % de l'ensemble des porcs à l'engrais abattus par les établissements sélectionnés (à l'origine d'au moins 80 % des abattages de porcs à l'engrais dans l'État membre), il convient de prélever un échantillon sur 600 porcs (2 400 × 0,25). L'échantillonnage doit être uniformément réparti sur douze mois, soit 50 porcs par mois. Le tableau 2 présente un autre exemple.
Il va de soi que, si un abattoir cesse ses activités, si un nouvel établissement est ouvert ou si une évolution sensible de la capacité d'un abattoir est prévue au cours de l'étude, il convient d'ajuster la capacité estimée en conséquence.
Tableau 2
Pondération des abattoirs aux fins de la détermination de la taille de l'échantillon à prélever dans chaque abattoir; calcul du nombre d'animaux par abattoir faisant l'objet d'un prélèvement
| Code d'identification de l'abattoir | Nombre de porcs à l'engrais abattus l'année précédente | Part dans le nombre total d'animaux abattus pris en compte dans l'étude (en %) | Nombre d'échantillons par abattoir |
Nombre d'échantillons prélevés par mois
(/12)
| AXD | 88 000 | 17,6 | 0,176 × 2 400 = 422,4 | 422,4:12 = 36
| SVH | 25 000 | 5,0 | |
| TPB | 75 000 | 15,0 | |
| MLG | 100 000 | 20,0 | |
| GHT | 212 000 | 42,4 | |
| Total | 500 000 | 100,0 | |
Pour chaque abattoir, il convient de sélectionner aléatoirement, tous les mois, un nombre compris entre 1 et 31. Si ce nombre correspond à un jour d'abattage pour le mois en cours, ce jour est choisi pour l'échantillonnage. Dans le cas contraire, un autre nombre est choisi au hasard. Ce processus est appliqué une fois par mois et réitéré autant de fois qu'il y a d'échantillons à prélever dans l'abattoir concerné. Pour l'abattoir AXD, par exemple, le processus sera répété au moins trente-six fois pour choisir au hasard au moins trente-six jours ouvrables. Il est évidemment possible qu'il faille prélever un échantillon sur plus d'une carcasse le même jour.
Du fait de la variation sensible du nombre d'animaux abattus un jour donné, il convient d'effectuer la sélection aléatoire de chaque animal à l'abattoir, le jour choisi pour l'échantillonnage, selon la procédure susmentionnée. Le nombre total d'animaux ce jour-là est connu; le personnel de l'abattoir choisit alors aléatoirement une ou plusieurs carcasses à l'aide de la liste de randomisation qui leur a été fournie et qui a été générée sur la base d'un nombre maximal supérieur au nombre le plus élevé de porcs à l'engrais susceptibles d'être abattus un jour quelconque dans n'importe quel abattoir de l'État membre.
Un exemple de liste de randomisation est donné par le tableau 3.
Tableau 3
Liste de randomisation
| Abattoir | Jour du mois | No d'ordre de la carcasse
| AXD | 19 | 5
| 4 | 2
| 12 | 124
| 12 | 2
| 8 | 59
Les animaux suivants sont exclus de l'étude de référence:
— les animaux d'un poids vif inférieur à 50 kg ou supérieur à 170 kg,
— les animaux abattus d'urgence,
— les carcasses déclarées entièrement impropres à la consommation.
2. Échantillons
2. 1. Généralités
Les échantillons suivants sont prélevés:
— les ganglions lymphatiques iléo-cæcaux, sous forme d'échantillon agrégé, ou au moins cinq ganglions lymphatiques iléo-cæcaux distincts, prélevés sur tous les porcs sélectionnés. Il convient de prélever, dans la mesure du possible, au moins 25 g de ganglion lymphatique sans graisse ni tissus conjonctifs,
— une éponge frottée, conformément au point 2.3, sur quatre sites de la carcasse, prélevée sur un total de 384 porcs au moins choisis aléatoirement parmi les porcs sélectionnés. La méthode d'échantillonnage à l'éponge doit être utilisée conformément à la version la plus récente de la norme ISO 17604. Cette technique d'échantillonnage est appliquée en Belgique, en République tchèque, au Danemark, en France, en Irlande, à Chypre, en Lettonie, en Lituanie, en Autriche, en Pologne, en Slovénie, en Suède et au Royaume-Uni,
— un échantillon musculaire, prélevé sur tous les porcs sélectionnés pour une analyse sérologique du jus de viande ou du sang (si cette dernière est équivalente à l'analyse du jus de viande). Il convient de prélever assez de muscles sur le cou ou le diaphragme pour obtenir une quantité de jus de viande suffisante pour en congeler et en stocker une partie afin de pouvoir réaliser ultérieurement des analyses comparatives. Cette technique d'échantillonnage est appliquée au Danemark, en Allemagne, en France, en Irlande, à Chypre, en Lituanie, aux Pays-Bas, en Slovénie, en Suède et au Royaume-Uni.
Des documents dans lesquels sont consignés le muscle sur lequel l'échantillon est prélevé, l'heure et la date de prélèvement de chaque échantillon, le nom du service de messagerie chargé de la livraison des échantillons ainsi que l'heure et la date de leur prise en charge par le service de messagerie sont conservés à l'abattoir.
2. 2. Détails concernant l'échantillonnage des ganglions lymphatiques
Le déchirement du mésentère entre le cæcum et la partie de l'iléon la plus proche du cæcum laisse apparaître les ganglions lymphatiques iléo-cæcaux à la surface de la zone ainsi dégagée. En cas de prélèvement séparé, il convient de prélever les ganglions grossièrement à la main, sans couteau, mais avec des gants. Les ganglions lymphatiques ou l'échantillon agrégé sont placés dans un sac en plastique sur lequel sont inscrits la date, l'heure ainsi que les codes d'identification de l'abattoir et de l'échantillon.
2. 3. Détails concernant le prélèvement d'échantillons à la surface des carcasses à l'aide d'une éponge
Il convient de prélever l'échantillon sur la carcasse après l'éviscération, mais avant le refroidissement. Une surface d'environ 100 cm2 par site de prélèvement est frottée à l'aide d'une seule éponge abrasive, qui servira pour tous les sites suivants tels qu'indiqués et numérotés ci-après conformément à l'annexe A de la norme ISO 17604:
— membre postérieur, partie médiane (9),
— abdomen, partie latérale (poitrine, 3),
— région dorsale médiane (dos, 4),
— joue (7).
Deux sites sont frottés avec une face de l'éponge, les deux autres avec l'autre face. La personne qui effectue le prélèvement doit exercer une pression suffisante pour écarter légèrement (2 à 5 mm) de lui la partie inférieure de la carcasse. Le site de prélèvement est frotté avec l'éponge environ dix fois verticalement et dix fois horizontalement. En cas d'utilisation d'un gabarit, il faut veiller à éviter une contamination croisée entre les carcasses.
L'échantillon doit être conservé à 7 °C au maximum pendant le stockage et le transport. La date, l'heure et les codes d'identification de l'abattoir et de l'échantillon sont inscrits sur le sac en plastique contenant l'échantillon.
3. Transport
Les échantillons sont envoyés dans les 36 heures par courrier prioritaire ou service de messagerie et doivent parvenir au laboratoire au plus tard 72 heures après le prélèvement. Les échantillons qui arrivent passé ce délai sont écartés, sauf s'ils sont analysés dans les 96 heures suivant l'échantillonnage et que la chaîne du froid n'a pas été interrompue.
4. Analyse des échantillons
L'analyse et le sérotypage sont effectués par le laboratoire national de référence (LNR). Si le LNR n’a pas la capacité pour réaliser toutes les analyses ou n’est pas le laboratoire qui effectue habituellement la détection, les autorités compétentes peuvent désigner un nombre limité d'autres laboratoires participant au contrôle officiel des salmonelles pour effectuer les analyses. Ces laboratoires doivent disposer d'une expérience attestée dans l'utilisation de la méthode de détection requise ainsi que d'un système d'assurance de la qualité conforme à la norme ISO 17025, et sont soumis à la supervision du laboratoire national de référence.
Au laboratoire, les échantillons sont maintenus réfrigérés jusqu'au moment de l'analyse bactériologique, qui doit être effectuée dans les 24 heures suivant leur réception et au plus tard 96 heures après le prélèvement de l'échantillon.
L'échantillon musculaire destiné à la sérologie doit rester congelé jusqu'à l'analyse, qui est effectuée immédiatement après la décongélation.
4. 1. Préparation des échantillons pour les analyses bactériologiques
La surface des ganglions lymphatiques est stérilisée avant l'analyse par immersion dans de l'alcool absolu et séchage à l'air.
Tous les ganglions lymphatiques sont regroupés et mis dans un sac en plastique, que l'on ferme. Ils sont ensuite écrasés à l'aide d'un marteau ou d'un outil similaire.
Une fois homogénéisés, les ganglions lymphatiques sont pesés et placés dans un récipient stérile contenant une solution d'eau peptonée tamponnée (EPT) diluée au 1:10 et préchauffée. Le récipient est incubé pour une durée totale de (18 ± 2) heures à (37 ± 1) °C.
Au laboratoire, on ajoute aux échantillons prélevés à l’éponge 100 ml d'EPT pour un enrichissement préalable. L'échantillon est incubé une nuit à 37 °C et analysé en milieu semi-solide modifié Rappaport-Vassiliadis (méthode MSRV) [projet d'annexe D de la norme ISO 6579:2002(E)] pour la recherche des salmonelles.
4. 2. Méthode de détection pour l'analyse bactériologique
Il convient d'utiliser la méthode recommandée par le laboratoire communautaire de référence (LCR) pour les salmonelles, situé à Bilthoven, aux Pays-Bas. Cette méthode est décrite dans la version actuelle du projet d’annexe D de la norme ISO 6579 (2002): «Recherche de Salmonella spp. dans les matières fécales des animaux et dans des échantillons au stade de la production primaire». Dans cette méthode, seul le MSRV est utilisé comme milieu d’enrichissement sélectif.
4. 3. Sérotypage
Toutes les souches isolées et identifiées comme Salmonella spp. font l'objet d'un sérotypage selon la classification de Kaufmann-White.
Pour garantir la qualité, seize souches typables et seize isolats non typables sont envoyés au LCR. Si le nombre de souches isolées est inférieur, toutes sont envoyées au laboratoire.
4. 4. Lysotypie
Pour la lysotypie d'un isolat de Salmonella sérotype typhimurium ou enteritidis (analyse facultative), il convient d'utiliser les méthodes décrites par le centre de référence OMS pour la lysotypie de Salmonella à l'agence de protection sanitaire (Health Protection Agency — HPA), située à Colindale, au Royaume-Uni.
4. 5. Test de sensibilité aux antibiotiques
En cas de test de sensibilité aux antibiotiques (facultatif), il convient d'utiliser une méthode validée et contrôlée, comme celles recommandées par le National Committee for Clinical Laboratory Standards — NCCLS (appelé le Clinical and Laboratory Standards Institute — CLSI — depuis le 1er janvier 2005).
Les méthodes de diffusion sur agar et de dilution en bouillon peuvent toutes deux être utilisées. Les résultats sont communiqués sous forme de données quantitatives (en concentration inhibitrice minimale — CIM — pour les méthodes de dilution et en diamètre de la zone d'inhibition pour les méthodes de diffusion) et qualitatives (proportion des isolats résistants). Les données qualitatives se fondent sur une interprétation selon les seuils (cut-off values) présentés par le European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (Eucast) sur le site: http://www.eucast.org
Les isolats sont testés eu égard à leur sensibilité aux substances antimicrobiennes suivantes:
— Ampicilline ou Amoxicilline
— Tétracycline
— Chloramphénicol
— Florfénicol
— Acide nalidixique
— Ciprofloxacine (de préférence) ou enrofloxacine
— Sulfamide (sulfamétoxazole, de préférence)
— Sulfamide/triméthoprime ou triméthoprime
— Gentamicine
— Streptomycine
— Kanamycine (de préférence) ou néomycine
— Céphalosporine de 3e génération (céfotaxime, de préférence)
— Colistine (facultatif)
Avant le lancement de l'étude, les États membres sont encouragés à organiser des formations pour les parties prenantes.
5. Registres et stockage des échantillons
Il convient de consigner toutes les analyses bactériologiques effectuées sur les échantillons selon un modèle identique ou analogue à celui présenté dans le tableau 4.
Toutes les souches isolées sont stockées dans les LRN des États membres en veillant à préserver l'intégrité de ces souches pendant cinq ans au moins.
Tous les échantillons de jus de viande prélevés pour la sérologie sont conservés congelés pendant deux ans.
Tableau 4
Exemple d'informations à consigner pour tous les échantillons analysés
| Échantillon | Réception | Analyse
| Identifiant et type de l'échantillon | Identifiant de l'abattoir | Nom | Date | Heure | Nom | Date | Heure | Pos. ou nég. | Sérotype | Lysotype | Antibiogramme | Code d'archivage
| 1 E | EU012 | PW | 3-10-06 | 12h00 | AB | 3-10 | 14h00 | Nég. | | | |
| 2 G | EU023 | PW | 4-10 | 12h30 | AB | 4-10 | 14h00 | Pos. | Typh | DT104 | ASTSu | (no ID)
| 3 G | EU083 | PW | 8-10 | 16h30 | AB | 9-10 | 9h00 | Pos. | Agona | s.o. | ASTE | (no ID)
6. Rapports des États membres
L'autorité compétente responsable de la préparation du rapport annuel national sur la surveillance des salmonelles chez les animaux, conformément à l'article 9 de la directive 2003/99/CE, doit collecter et évaluer les résultats et faire un rapport à la Commission.
Ce rapport mentionne au moins les informations suivantes:
6. 1. Description globale de la mise en œuvre du programme
— Description de la population sous revue stratifiée selon la capacité des abattoirs.
— Description de la procédure de randomisation ainsi que du système de notification.
— Taille calculée des échantillons.
— Renseignements sur les autorités et les laboratoires participant à l'échantillonnage, aux analyses et au typage.
— Résultats généraux de l'étude (échantillons analysés par bactériologie et par sérologie, nombre d'échantillons positifs, sérotype, lysotype et antibiogramme).
6. 2. Données complètes sur chaque animal ayant fait l'objet d'un prélèvement et résultats des tests correspondants
Les États membres communiquent les résultats des analyses sous forme de données brutes à l'aide du dictionnaire de données et des formulaires de collecte de données fournis par la Commission. Ce dictionnaire et ces formulaires sont établis par la Commission:
— identifiant de l'abattoir,
— capacité de l'abattoir,
— date et heure de l'échantillonnage,
— identifiant des échantillons (numéro, par exemple),
— type d'échantillons prélevés: ganglions lymphatiques, prélèvement à l'éponge,
— date d'expédition au laboratoire.
Pour chaque échantillon envoyé au laboratoire, les États membres recueillent les informations suivantes:
— identifiant du laboratoire (si plusieurs laboratoires sont concernés),
— moyens de transport des échantillons,
— date de réception par le laboratoire,
— pour l'analyse de ganglions lymphatiques, poids de l'échantillon,
— résultats pour l'échantillon analysé: «négatif» ou, en cas de détection de Salmonella spp., résultats du sérotypage (Salmonella serovar ou non typable),
— résultats pour les souches qui ont fait l'objet d'un antibiogramme et/ou d'une lysotypie.